Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af NIAID 1K22AI118929-01. EBP blev støttet af en sommer Research Fellowship Program tilskud fra Office of Research på Old Dominion Universitet, Norfolk, Virginia, USA.

1. inducerbar overekspression af en histidin-mærkede Protein
<ol><li>Forstærke rsh fra C. difficile R20291 genomisk DNA.<ol>
<li>Bruge et Hi-Fi-polymerase og Følg fabrikantens anvisninger.</li>
		<li>Forstærke C. difficile rsh ved hjælp af primere rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) og rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), som indfører en C-terminal hexahistidine tag. Bemærk: KpnI og PstI skæres websteder i prime...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

Her rapporterer vi en rensning af hans markeret RSH fra C. difficile og præsentere en metode for aktivitet kvantificering ved hjælp af radiolabeled tyndtlagskromatografi. Denne metode har tidligere været anvendt til at vurdere aktiviteten af diguanylate cyclase enzymer fra C. difficile, samt (p) ppGpp syntetase, nukleotid cyclase, kinase og phosphodiesterase enzymer fra andre organismer11,12 ,13,...

Kinase og pyrophosphokinase (eller diphospho-kinase) enzymer overføre fosfater fra nukleotid trifosfat (NTP) prækursorer til substrater. Substraterne kan omfatte andre nukleotider, aminosyrer eller proteiner, kulhydrater og lipider1. Bioinformatic analyser kan undertiden forudsige et enzym beslægtet substrater eller substrater baseret på lighed karakteriseret enzymer, men eksperimentel validering er stadig nødvendige. På samme måde, et enzym affinitet for sin substrate(s) og den hastighed, hvormed det katalyserer phosphor-overførsel reaktion, og virkningerne af co-faktorer, hæmmere eller andre enzym effektorer skal bestemmes eksperimentelt. For at undgå nedbrydning af ATP forløber af andre ATP-forbrugende enzymer til stede i bakteriel cytoplasma, kræver kvantitative aktivitet assays oprenset protein.
Protein oprensning af metal affinitet kromatografi er blevet dækket grundigt i litteratur2,3. Histidin tags bestående af seks på hinanden følgende histidinrester føjes til N - eller C-terminalen af en rekombinant protein giver mulighed for hurtig rensning af metal affinitet kromatografi4,5,6. Disse sekvenser er lille i forhold til de proteiner, de ændre og typisk har en minimal effekt på protein funktion, selv om de kan nogle gange ændre protein stabilitet og/eller enzym kinetik7,8. Histidin tags på N - og C-termini af den samme protein kan have forskellige virkninger, som er vanskeligt at forudsige uden at vide det pågældende protein struktur. Histidin tags er typisk indarbejdet i kloning af en rekombinant protein ved at designe primere, der indkode seks histidinrester, enten straks 3' til ATG start codon eller straks 5' til stop-codon af åbne læsning rammen. Efter forstærkning, er hexahistidine-holdige genet forbundet til en vektor under kontrol af en inducerbar promotor og udtrykt, typisk i et laboratorium stamme af E. coli. Rekombination proteiner kan derefter være isoleret på en affinitet harpiks indeholdende immobiliseret divalent kationer (typisk nikkel eller kobolt)9. Forurener indfødte metal-bindende proteiner kan fjernes ved titrering med imidazol, som konkurrencedygtige fortrænger bundet protein2. Endelig, target proteinet elueres af kolonnen med højere koncentrationer af imidazol. Der er flere kommercielle kilder for immobiliseret metal kation harpiks, og fabrikanterne give anbefalinger til buffer betingelser og imidazol koncentrationer. Efter eluering, kan protein være analyseret af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), dialysebehandling eller anvendes umiddelbart i funktionelle assays.
Der er flere metoder til indirekte overvåge kinase aktivitet ved at koble ATP fosfat bond hydrolyse til en anden reaktion, der frigiver eller ophidser en fluorophore eller genererer kemiluminescens, men disse reaktioner har flere bevægelige dele og kan være logistisk udfordrende10. Den mest enkle måde at måle specielt fosfor-overførselsaktivitet er direkte overvåge overførsel af en radiolabeled fosfat gruppen fra et kommercielt tilgængelige γ -32-P NTP forløber for en ikke-radiolabeled substrat11 , 12 , 13. blandinger af radiolabeled substrater og produkter kan være adskilt og kvantificeres ved tyndtlagskromatografi (TLC). TLC udnytter opløste stoffer i en given opløsningsmiddel differential mobilitet ved at tillade opløsningsmidler (flydende fase) til at overflytte af kapillaritet hen over en overflade (fast fase), som en blanding af opløste stoffer har været adsorberet14. Opløste stoffer, der er lille og/eller mangler gunstige interaktioner med den faste fase vil overflytte længere afstande fra deres oprindelige placering end opløste stoffer med højere Molekylær vægt eller stor tilhørsforhold til legemet. For undersoegelse af fosfor-overførsel øge fosfat fraspaltning molekylvægt af molekyler, de føjes til, og Tilføj negative ionisk afgift på neutral eller sure pH11,12,14. Dette nedsætter deres mobilitet på et grundlæggende overflade som PEI-cellulose. Når udviklet i sure kalium fosfat buffer, kan blandinger af mono-, di-, tri-, tetra- og pentaphosphate arter adskilles let på PEI-cellulose, giver mulighed for kvantificering af de enkelte arter (figur 2, figur 3). Disse analyser kan udføres ved hjælp af cellelysater der indeholder enzym af interesse, men dette omfatter potentiale for aktiviteten af andre kinaser og fosfataser, generelle ATPases til nedbryder substrat og/eller produkt. For en kvantitativ in vitro- vurdering af enzymaktivitet er det nødvendigt at rense enzym af interesse.
Guanosinmonofosfat tetraphosphate (ppGpp) og guanosinmonophosphat pentaphosphate (pppGpp) er ribonucleotide signalering, molekyler dannet af overførsel af en pyrofosfat gruppen fra en adenosin trifosfat (ATP) forløber, henholdsvis en Guanosinmonofosfat ud (BNP) eller Guanosinmonofosfat tetraphosphate (GTP) substrat15. Disse enkelt ribonucleotide signaler, kollektivt kendt som (p) ppGpp, mægle en celle-wide respons til miljøstress kendt som den strenge svar i forskellige bakteriearter15,16. To bevarede klasser af enzymer katalyserer dannelsen af (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymer er 'lang' bifunctional (p) ppGpp syntetase/hydrolaser opkaldt efter deres lighed med Real og SpoT (p) ppGpp metaboliske enzymer fra Escherichia coli , der indeholder syntetase, hydrolase og regulerende domæner, mens små alarmone syntetase (SAS) enzymer er kort monofunctional synthetases findes udelukkende i Gram positive bakterier15, 17 , 18. spore-dannende Gram-positive bakterien Clostridium difficile koder formodede RSH og SAS gener19. Vi præsenterer her, indledende aktivitet assays, der bekræfter, at C. difficile RSH enzym er en katalytisk aktive (p) ppGpp syntetase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

Kinase og pyrophosphokinase enzymer overføre gamma fosfat eller beta-gamma pyrofosfat gruppe fra nukleotid trifosfat prækursorer til substrater til at oprette fosforyleres produkter. Brugen af γ -32- P mærket NTP prækursorer tillader samtidig overvågning af substrat udnyttelse og produkt dannelsen af radiografi. Tyndtlagskromatografi (TLC) på cellulose plader giver hurtig adskillelse og følsomme kvantificering af substrat og produkt. Vi præsenterer en metode for at anvende tyndtlagskromatografi for at pyrophosphokinase aktiviteten af en renset (p) ppGpp syntetase-analysen. Denne metode har tidligere været anvendt til at karakterisere aktiviteten af cykliske nukleotid og dinucleotid synthetases og er generelt egnet til karakterisering af aktiviteten af et enzym, der hydrolyserer et nukleotid trifosfat bond eller overfører en terminal fosfat fra fosfat donor til en anden molekyle.

Vi præsenterer en metode til affinitet rensning af en (p) ppGpp syntetase fra Clostridium difficile og vurderingen af dets enzymatiske aktivitet. Figur 1 viser den protein oprensning opnåede ved metal affinitet kromatografi. Den anden eluering (E2) fraktion fra denne rensning blev dialysebehandling og anvendes til enzymatisk aktivitet assay. Figur 2 beskriver de nødvendige trin til at forberede og udføre pyrophosphot...

Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Her, beskriver vi en metode til rensning af histidin-markeret pyrophosphokinase enzymer og anvende tyndtlagskromatografi radioaktive substrater og produkter til assay for enzymatisk aktivitet in vitro. Enzym aktivitet assay er stort set gælder for enhver kinase, nukleotid cyclase eller fosfor-overførsel reaktion hvis mekanisme omfatter nukleotid trifosfat hydrolyse.

En rensning og In Vitro aktivitet Assay for en (p) ppGpp syntetase fra Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om fosfortransferenzymer, herunder enzymsubstrat specificitet og reaktion kinetik. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver mulighed for hurtig indsamling af flere datasæt, der er meget ensartede, hvilket muliggør statistisk robust kvantificering af enzymaktivitet. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, fordi det er meget lettere at påvise reaktionerne på TLC-pladerne og kvantificere de radioaktive arter i reaktionerne end at forklare.Ud over Astha, viser proceduren vil være Asien Poudel, en anden kandidat studerende fra mit laboratorium. Begynd denne protokol med inducerende overekspression af et histidin-mærket protein som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en milliliter nikkelnitrloetsyre harpiks i en tyngdekraftssøjle for at rense proteinet.Dagen før brug, ligevægt kolonnen natten over ved fire grader Celsius med to milliliter ækvivalens buffer. Den følgende dag bringe kolonnen fra fire grader Celsius til stuetemperatur før lastning den afklarede lysate og lad det stå i cirka to til tre timer. Derefter resuspend pellet i lysis buffer.Sonikere cellerne på is i 10 gange 10-sekunders intervaller, pauser 30 sekunder mellem pulser. Afklare lysatet ved centrifugering ved 3, 080 gange g i 30 minutter ved fire grader Celsius ved hjælp af en mikrocentrifuge. Forbered den afklarede lysate med lige store mængder lysis buffer, derefter anvende prepped, afklaret lysate til kolonnen og indsamle flow-through.Den afklarede lysatstrømning skal genanvendes til kolonnen, og den sekundære gennemstrømning opsaml igen. Derefter vaskes kolonnen med fem milliliter vaskepude en og opsaml gennemstrømningen. Vask kolonnen igen med fem milliliter vaskepude to og opsaml gennemstrømningen.Anvend nu to milliliter elution buffer. Gennemsl flow-through i to fraktioner af en milliliter hver. Under proteinrensning er optagelse af magnesiumchlorid i rensebuffere, en ændring af producentens protokol, afgørende for enzymatisk aktivitet.For kvalitativt at vurdere proteinrensning ved SDS-PAGE, køre 20 mikroliter aliquots af alle kolonne fraktioner på en 4% stabling, 10% kører polyarylamid gel i 60 minutter ved 170 volt. Plet gelen med 0,1% Coomassie blå ved stuetemperatur i fem timer, vuggende forsigtigt på en benchtop rocker. Derefter destain gelen i 40% methanol-10% iskold eddikesyre natten over ved stuetemperatur, vuggende på benchtop rocker.Dialyse den eluterede fraktion to mod dialyse buffer på en 200:1 forholdet ved hjælp af en en-milliliter dialyse enhed med en 20-kilodalton molekylvægt cutoff natten over ved fire grader Celsius. Koncentrationen af dialyseret proteinprøve bestemmes ved måling af absorbans ved 280 nanometer og ved hjælp af den beregnede molære udryddelseskoefficient. Opbevar 100-mikroliter aliquots af dialyzed protein prøve på minus 80 grader Celsius indtil brug.Før reaktionen udføres, forberedes PEI cellulose tynde lagkromatografiplader ved at vaske dem i deioniseret vand. Pladerne sættes i et glaskammer med dobbeltdestilleret vand til en dybde på ca. 0,5 centimeter. Efter at have ladet vandet migrere til toppen af pladen, bringe pladerne ud af glaskammeret og lad på en benchtop rack til tørre natten over.Marker de tørrede plader to centimeter fra den ene kant med en blød blyant for at angive, hvor prøverne skal anvendes til TLC. Ved prøver med to mikroliter påføres prøverne med en afstand på mindst en centimeter. Når du planlægger eksperimenter, skal du altid efterlade et sted på hver plade ubrugt til at fungere som en tom vognbane til prøve kvantificering.For at udføre enzymaktivitetsanalysen skal individuelle reaktioner ved hjælp af gamma P32 ATP som beskrevet i tekstprotokollen forberedes individuelle reaktioner ved hjælp af gamma P32 ATP som beskrevet i tekstprotokollen. Tilsæt RSH efter de andre komponenter er blevet blandet, da tilsætning af RSH til nukleotid-holdige mix initiere enzymatisk aktivitet assay. For at kontrollere for ATP hydrolyse fra forurenende nuklease aktivitet, samle en 10-mikroliter reaktion, der ikke indeholder protein og inkubere det parallelt.Spot to-mikroliter prøver ved T lig nul og ved afslutningen af forsøget for at sikre, at ATP ikke blev hydrolyseret i mangel af protein. Umiddelbart efter tilsætning af RSH fjernes to mikroliter, og den anbringes på den mærkede PEI-celluloseplade, da T er lig med nul minutters prøve. Inkuber reaktionen ved 37 grader Celsius, fjerne to-mikroliter aliquots på de ønskede tidspunkter.Når alle aliquots er blevet indsamlet, udføre tyndt lag kromatografi ved at fylde kromatografi kammer med 1,5-molar monobasic kaliumphosphat til en dybde på 0,5 centimeter. Pladens nederste kant nedsænkes i opløsningsmiddel, og opløsningsmidlet migreres til toppen af pladen over ca. 90 minutter. Fjern pladen fra kromatografitanken, og læg den på en prøvebænk, der tørrer risten, luftret natten over.Når pladen er tør, pak pladen ind i plastfilm for at undgå overførsel af radioaktivt materiale til billedkassetten og analysere ved autoradiografi. PEI-cellulosepladen, der indeholder adskilte reaktioner på en fosformagerkassette, eksponeres i fire timer ved stuetemperatur. Efter eksponering, billede kassetten på en fosformager.Brug billedbehandlingssoftware med en grafisk brugergrænseflade til at tegne interesseområder eller ROI'er ved først at vælge Tegn et rektangel, og brug derefter musen til at tegne rektangulære RO'er omkring en hel vognbane og ATP- og guanosin-tetraphosphat-pletterne i den pågældende vognbane. Brug kommandoerne Vælg, Kopier og Sæt ind til at tegne identiske ROI'er i de andre baner for at sikre, at ROI'erne måler signalet inden for identiske områder i hver vognbane. Medtag ROI'er fra en ubrugt vognbane, der skal bruges som tomme felter.Ved hjælp af Analyze, Tools, ROI Manager, Add commands of the imaging software skal du vælge alle de ROI'er, der er tegnet på PEI-cellulosepladen. Brug nu kommandoerne Analysér, Indstil målinger, Målordner til at kvantificere signalintensiteten i hvert investeringsafkast og eksportere målingerne som et spreadsheeet. Træk tomme ROI-værdier fra eksperimentelle signaler i regnearket.Konvertering af data til procent guanosin-tetraphosphat syntetiseret er kritisk, fordi det sikrer, at datasæt indsamlet på forskellige dage med forskellige partier af protein eller forskellige gamma P32 ATP er konsekvente og kan samles for statistisk stringens. Denne tegneserie viser, hvordan interesseområder bruges til at definere en vognbane, der indeholder det samlede radioaktive signal i en prøve og komponenten radioaktive ATP og guanosin tetraphosphat regioner af interesse. ATP- og guanosinte tetraphosphatsignaler normaliseres til det samlede signal i stedet for at rapportere de absolutte værdier, fordi pipetteringsfejl eller henfald af det radioaktive substrat kan påvirke det samlede signal i prøven, men ikke påvirker enzymaktiviteten.Vist her er en faktisk TLC plade af en reaktion udført ved hjælp af renset C.difficile RSH. En kontrolreaktion, der ikke indeholder protein, gør det muligt at kvantificere uncatalyzed ATP-hydrolyse, mens en tom vognbane muliggør nøjagtig signalantektificering. I ATP- og guanosin-tetraphosphat-pletterne overfører enzymet det radioaktive fosfat fra ATP-substrat til BNP-prækursor, hvilket skaber radioaktivt guanosinte tetraphosphat.Dette bekræfter, at den formodede guanosin tetraphosphatsyntetase fra C.difficile er et aktivt enzym. Ved at udtage prøver af reaktionen med mellemrum kan der observeres fremskridt. Her observeres det rå signal på hvert tidspunkt.ATP er faldende og guanosin tetraphosphat er stigende. Vist her er de normaliserede data. Fejllinjerne er meget mindre, fordi normaliseringen tager sig af eventuelle pipetteringsfejl.Under forsøg på denne procedure, er det vigtigt at være forsigtig med ikke at ridse harpiksen på TLC pladen, da dette kan forstyrre opløsningsmiddel migration. Dette er en meget tilgængelig teknik med enkel dataanalyse, der hurtigt kan give robust kvantificering af enzymaktivitet. Vi har brugt det til at bekræfte, at Clostridium difficile syntetiserer guanosin tetraphosphat, som aldrig tidligere er blevet rapporteret.Glem ikke, at arbejde med radioaktivitet kan være yderst farligt, og du skal følge din institutions regler for opbevaring og brug af radioaktive materialer, mens du udfører denne procedure. Denne metode kan give indsigt i guanosin tetraphosphat syntese, men det kan også anvendes på andre fosfortransfer reaktioner, herunder protein kinase aktivitet og cyklisk diguanylat syntese.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Måling af faktor V aktivitet i humant plasma ved hjælp af en Microplate koagulationsassay

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spyt, spytkirtel, og hæmolymfe Collection fra Ixodes scapularis Flåter

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Dyrkning og vedligeholdelse<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; I et anaerobt miljø

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay at vurdere Patogen induceret Neutrophil Trans-epitel Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Oprensning fra Intracellulært Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazon behandlet musemodel af klinisk relevant<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

En protokol til at karakterisere de morfologiske ændringer af<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Som svar på antibiotisk behandling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...