Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door NIAID 1K22AI118929-01. EBP werd gesteund door een subsidie van zomer Research Fellowship programma uit de Office of Research bij Old Dominion University, Norfolk, Virginia, Verenigde Staten.

1. afleidbare overexpressie van een Histidine-gelabelde proteïnen
<ol><li>Amplify rsh van C. difficile R20291 genomic DNA.<ol>
<li>Gebruik van een polymerase van hifi- en volg de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Versterken van C. difficile rsh gebruikend inleidingen rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) en rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), waarin een C-terminal hexahistidine code wordt ingevoerd. Opmerking: De...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

Hier melden we de zuivering van zijn-gelabeld RSH van C. difficile en presenteer een methode voor de kwantificering van de activiteit met behulp van radiolabeled Dunnelaagchromatografie. Deze methode is eerder gebruikt om de activiteiten beoordelen van diguanylate cyclase enzymen van C. difficile, evenals (p) ppGpp synthetase, nucleotide cyclase, kinase en fosfodiësterase enzymen uit andere organismen11,12 ,13</sup...

Kinase en pyrophosphokinase (of diphospho-kinase) enzymen overbrengen fosfaten uit nucleotide trifosfaat (NTP) precursoren substraat moleculen. De substraten kunnen omvatten andere nucleotiden, aminozuren of eiwitten, koolhydraten en vetten1. Bioinformatic analyses kunnen soms voorspellen van een enzym cognaat substraat of substraten op basis van de gelijkenis met gekarakteriseerd enzymen experimentele validatie is echter nog steeds nodig. Ook de affiniteit van een enzym voor haar substrate(s) en het tarief waartegen het katalyseert de fosfor-overdracht-reactie, en de effecten van cofactoren, remmers, of andere enzym effectoren moeten experimenteel worden bepaald. Kwantitatieve activiteit testen vereisen om te voorkomen dat de uitputting van de voorloper van de ATP door andere ATP-verbruikende enzymen aanwezig in bacteriële cytoplasma, gezuiverde eiwit.
Eiwitreiniging door metalen affiniteitchromatografie is grondig gecoverd in de literatuur2,3. Histidine tags bestaande uit zes opeenvolgende histidine residuen toegevoegd aan de N - of C-terminus van een recombinant eiwit toestaan snelle zuivering door metal affinity chromatografie4,5,6. Deze sequenties zijn klein in vergelijking met de eiwitten ze wijzigen en hebben meestal een minimaal effect op eiwitfunctie, hoewel ze soms eiwitstabiliteit en/of enzyme kinetics7,8kunnen wijzigen. Histidine tags op de N - en C-termini van hetzelfde eiwit kunnen verschillende gevolgen hebben, die moeilijk te voorspellen, zonder de structuur van het eiwit in kwestie. Histidine tags zijn meestal tijdens het klonen van een recombinant eiwit door het ontwerpen van inleidingen die zes histidine residuen, ofwel onmiddellijk coderen 3' aan de ATG start codon of onmiddellijk 5' naar de stop codon van het open leesraam opgenomen. Na versterking, is het gen hexahistidine-bevattende afgebonden in een vector onder de controle van een afleidbare promotor en uitgedrukt, meestal in een laboratorium stam van E. coli. Het eiwit recombinatie kan vervolgens worden geïsoleerd op een hars van de affiniteit met daarin geïmmobiliseerdet divalente kationen (meestal nikkel of kobalt)9. Besmetting van inheemse metaal-bindende proteÃ¯nen kan worden verwijderd door titratie met imidazool, die concurrerend afhankelijke eiwitten2 verdringt. Ten slotte is het doel eiwit uit de kolom met hogere concentraties van imidazool geëlueerd. Er zijn verschillende commerciële bronnen voor geïmmobiliseerdet metalen catie harsen en de fabrikanten bieden aanbevelingen voor de buffer voorwaarden en imidazol concentraties. Na elutie, kan eiwit worden geanalyseerd door natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina), dialyzed of onmiddellijk gebruikt in functionele testen.
Er zijn verschillende methoden om niet indirect kinaseactiviteit controleren door de hydrolyse van ATP fosfaat bond koppelen aan een tweede reactie die loslaat of een fluorophore opwekt of Chemoluminescentie genereert, maar deze reacties hebben meerdere bewegende delen en kan logistiek uitdagende10. De eenvoudigste manier om te meten specifiek fosfor-overdracht activiteit is rechtstreeks volgen de overdracht van een radiolabeled fosfaatgroep van een commercieel beschikbare γ -32-P NTP voorloper van een niet-radiolabeled substraat11 , 12 , 13. mengsels van radiolabeled substraten en producten kunnen worden gescheiden en gekwantificeerd door de dunne laag chromatografie (TLC). TLC maakt gebruik van de differentiële mobiliteit van opgeloste stoffen in een bepaald oplosmiddel doordat het oplosmiddel (vloeibare fase) migreren door capillaire actie over een oppervlak (vaste fase) waarop een mengsel van opgeloste stoffen geadsorbeerde14is geweest. Opgeloste stoffen die zijn klein en/of gebrek aan gunstige interactie met de vaste fase zal migreren langere afstanden vanaf hun oorspronkelijke locatie dan opgeloste stoffen met een hoger molecuulgewicht of grote affiniteit voor de vaste stof. Voor de bestudering van fosfor-overdracht, fosfaat wordt verhoogd het molecuulgewicht van moleculen ze worden toegevoegd aan, en voeg negatieve Ionische lading aan neutrale of zure pH11,12,14. Dit vermindert hun mobiliteit op een fundamentele oppervlak zoals PEI-gemengd met cellulose. Wanneer ontwikkeld in zure kalium fosfaatbuffer, kunnen de mengsels van mono-, di-, tri-, tetra- en pentaphosphate soorten gemakkelijk worden gescheiden op PEI-cellulose, waardoor kwantificering van elke soort (Figuur 2, figuur 3). Dergelijke tests kunnen worden uitgevoerd met behulp van cel lysates met het enzym van belang, maar hierbij het potentieel voor de activiteit van andere kinases, fosfatasen genaamd, en algemene ATPasen aan het uitputten van het substraat en/of product. Een kwantitatieve in vitro beoordelingvan enzymactiviteit is het noodzakelijk voor het zuiveren van het enzym van belang.
Calciumguanosine tetraphosphate (ppGpp) en calciumguanosine pentaphosphate (pppGpp) zijn ribonucleotide signalering moleculen gevormd door de overdracht van een pyrofosfaat groep uit een voorloper van adenosinetrifosfaat (ATP) aan, respectievelijk, een calciumguanosine difosfaat (BBP) of calciumguanosine tetraphosphate (GTP) substraat15. Deze interne ribonucleotide signalen, gezamenlijk bekend als (p) ppGpp, bemiddelen een cel-brede reactie op milieudruk bekend als de strenge reactie in verschillende bacteriesoorten15,16. Twee geconserveerde klassen van enzymen katalyseren de vorming van (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymen zijn 'lang' bifunctionele (p) ppGpp synthetase/hydrolases is vernoemd naar hun gelijkenis met de EXTE en SpoT (p) ppGpp metabole enzymen van Escherichia coli die bevatten synthetase, hydrolase en regelgevende domeinen, terwijl kleine alarmone synthetase (SAS) enzymen korte monofunctional synthetases gevonden uitsluitend in Gram positieve bacteriën15, zijn 17 , 18. de spore-vormende gram-positieve bacterie Clostridium difficile codeert putatief RSH en SAS genen19. Hier presenteren we testen van de eerste activiteit die bevestigen dat de C. difficile RSH-enzym een catalytically actieve (p) ppGpp synthetase is.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

Kinase en pyrophosphokinase enzymen overbrengen in de gamma-fosfaat of het beta-gamma pyrofosfaat deel van nucleotide trifosfaat precursors substraten gefosforyleerd producten te maken. Het gebruik van γ -32- P label NTP precursoren zorgt voor de gelijktijdige opvolging van substraat gebruik en product vorming door radiografie. Dunnelaagchromatografie (TLC) op cellulose platen kan snelle scheiding en gevoelige kwantificering van substraat en product. Presenteren we een methode voor het gebruik van de dunne-laag chromatografie te assay de pyrophosphokinase activiteit van een gezuiverde (p) ppGpp synthetase. Deze methode is eerder gebruikt voor het karakteriseren van de activiteit van cyclische nucleotide en dinucleotide synthetases en is in grote lijnen geschikt voor het karakteriseren van de activiteit van een enzym dat een nucleotide trifosfaat obligatie ontstabiel of overdraagt van een terminal fosfaat uit een fosfaat donor aan een andere molecule.

Presenteren we een methode voor de zuivering van de affiniteit van een (p) ppGpp synthetase van Clostridium difficile en de beoordeling van de enzymatische activiteit. Figuur 1 toont de eiwitreiniging bereikt door metalen affiniteitchromatografie. Het tweede deel van de elutie (E2) van deze reiniging was dialyzed en gebruikt voor de bepaling van de enzymatische activiteit. Figuur 2 geeft het nodige voorbereiden en uitvoe...

Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over fosforenzymen, waaronder enzymsubstraatspecificiteit en reactiekinetiek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor een snelle verzameling van meerdere gegevenssets die zeer consistent zijn, waardoor statistisch robuuste kwantificering van enzymactiviteit mogelijk is. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het spotten van de reacties op de TLC-platen en het kwantificeren van de radioactieve soorten in de reacties veel gemakkelijker aan te tonen is dan uit te leggen.Naast Astha, het aantonen van de procedure zal worden Azië Poudel, een andere afgestudeerde student van mijn laboratorium. Begin dit protocol met inducible overexpressie van een histidine-gelabeld eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een milliliter nikkel nitriloacetische zuur hars in een zwaartekracht kolom om het eiwit te zuiveren.De dag voor gebruik, equilibrate de kolom 's nachts op vier graden Celsius met twee milliliter van evenwicht buffer. De volgende dag breng de kolom van vier graden Celsius op kamertemperatuur voorafgaand aan het laden van de verduidelijkt lysate en laat het staan voor ongeveer twee tot drie uur. Dan resuspend de pellet in de lyse buffer.Sonicate de cellen op ijs voor 10 keer 10-seconden intervallen, pauzeren 30 seconden tussen pulsen. Verhelder het lysaat door centrifugatie op 3, 080 keer g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met behulp van een microcentrifuge. Bereid het verduidelijkte lysaat voor met gelijke volumes lysisbuffer, pas vervolgens het voorbereide, verduidelijkt lysaat toe op de kolom en verzamel de doorstroom.De opgehelderde lysaatstroom opnieuw doorzetten naar de kolom en de secundaire doorstroom verzamelen. Was vervolgens de kolom met vijf milliliter wasbuffer een en het verzamelen van de flow-through. Was de kolom opnieuw met vijf milliliter wasbuffer twee en verzamel de flow-through.Breng nu twee milliliter elutie buffer. Verzamel flow-through in twee fracties van een milliliter per stuk. Tijdens de eiwitzuivering is opname van magnesiumchloride in de zuiveringsbuffers, een wijziging van het protocol van de fabrikant, essentieel voor enzymatische activiteit.Om eiwitzuivering door SDS-PAGE kwalitatief te beoordelen, voer 20 microliter aliquots van alle kolomfracties uit op een stapeling van 4%, 10% lopende polyacrylamide gel gedurende 60 minuten op 170 volt. Vlek de gel met 0,1%Coomassie blauw op kamertemperatuur gedurende vijf uur, zachtjes schommelen op een benchtop rocker. Dan destain de gel in 40% methanol-10%glaciale azijnzuur 's nachts bij kamertemperatuur, schommelen op de benchtop rocker.Dialyze de eluted fractie twee tegen dialyse buffer op een 200:1 verhouding met behulp van een een-milliliter dialyse apparaat met een 20-kilodalton moleculair gewicht cutoff 's nachts op vier graden Celsius. Bepaal de concentratie van dialyseerd eiwitmonster door absorptie op 280 nanometer te meten en de berekende molaire extinctiecoëfficiënt te gebruiken. Bewaar 100-microliter aliquots van het dialyseerde eiwitmonster bij min 80 graden Celsius tot gebruik.Bereid de reactie vóór het uitvoeren van de reactie pei cellulose dunne laagchromatografieplaten door ze in gedeïsatiseerd water te wassen. Plaats de platen in een glazen kamer met dubbel gedestilleerd water tot een diepte van ongeveer 0,5 centimeter. Nadat het water naar de bovenkant van de plaat is gemigreerd, brengt u de platen uit de glazen kamer en laat u 's nachts op een banktoprek drogen.Markeer de gedroogde platen twee centimeter van één rand met een zacht potlood om aan te geven waar de monsters voor TLC worden aangebracht. Voor monsters met twee microliter, breng monsters niet minder dan een centimeter uit elkaar. Bij het plannen van experimenten, altijd laat een plek op elke plaat ongebruikt om te dienen als een lege baan voor monster kwantificering.Om de enzymactiviteitstest uit te voeren, bereidt u individuele reacties voor met behulp van gamma P32 ATP zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg de RSH toe nadat de andere componenten zijn gemengd, omdat de toevoeging van RSH aan de nucleotide-bevattende mix de enzymatische activiteitstest initieert. Om atp hydrolyse te controleren tegen vervuilende nuclease-activiteit, verzamelt u een 10-microliterreactie die geen eiwit bevat en parallel uitbroedt.Spot twee-microliter monsters op T gelijk nul en aan het einde van het experiment om ervoor te zorgen dat ATP niet werd gehydrolyseerd in de afwezigheid van eiwitten. Onmiddellijk na toevoeging van RSH, verwijder twee microliters en spot het op de gelabelde PEI-cellulose plaat als de T gelijk is aan nul minuten monster. Broed de reactie op 37 graden Celsius, het verwijderen van twee-microliter aliquots op de gewenste tijdstippen.Nadat alle aliquoten zijn verzameld, voert u dunne laagchromatografie uit door de chromatografiekamer te vullen met 1,5-molaire monobasische kaliumfosfaat tot een diepte van 0,5 centimeter. Dompel de onderkant van de plaat onder in oplosmiddel en laat het oplosmiddel gedurende ongeveer 90 minuten naar de bovenkant van de plaat migreren. Haal de plaat uit de chromatografietank en leg deze 's nachts op een droogrek van benchtop om 's nachts aan de lucht te drogen.Nadat de plaat droog is, wikkel de plaat in plastic folie om de overdracht van radioactief materiaal naar de beeldvorming cassette te voorkomen en analyseren door autoradiografie. Leg de PEI-celluloseplaat met gescheiden reacties op een fosforimagercassette vier uur lang bloot bij kamertemperatuur. Na blootstelling, beeld de cassette op een fosforimager.Met behulp van imaging software met een grafische gebruikersinterface, trekken regio's van belang of ROI's door eerst draw a Rectangle te selecteren, gebruik dan de muis om rechthoekige ROI's te tekenen rond een hele rijstrook en de ATP en guanosine-tetraphosfate vlekken in die rijstrook. Gebruik de opdrachten Selecteren, Kopiëren en Plakken om identieke ROI's binnen de andere rijstroken te tekenen om ervoor te zorgen dat de ROM's signaal meet binnen identieke gebieden in elke rijstrook. Neem ROI's op van een ongebruikte rijstrook die als losse flodders moet worden gebruikt.Selecteer met behulp van de analyse, hulpmiddelen, ROI Manager, Opdrachten toevoegen van de imaging-software alle ROI's die op de PEI-celluloseplaat zijn getekend. Gebruik nu de opdrachten Analyseren, Metingen instellen, Meten om de signaalintensiteit binnen elke ROI te kwantificeren en de metingen te exporteren als een spreadsheeet. Trek in de spreadsheet lege ROI-waarden af van experimentele signalen.Het omzetten van de gegevens naar het percentage guanosine-tetraphosfat gesynthetiseerd is van cruciaal belang, omdat het ervoor zorgt dat gegevenssets verzameld op verschillende dagen met verschillende partijen eiwit of verschillende gamma P32 ATP consistent zijn en kunnen worden samengevoegd voor statistische strengheid. Deze cartoon laat zien hoe bezienswaardigheden worden gebruikt om een rijstrook te definiëren die het totale radioactieve signaal in een monster bevat en de component radioactieve ATP en guanosine tetraphosfate regio's van belang. ATP- en guanosine-tetrapsfatesignalen worden genormaliseerd tot het totale signaal in plaats van de absolute waarden te rapporteren omdat pipettingfout of verval van het radioactieve substraat het totale signaal in het monster kan beïnvloeden, maar geen invloed hebben op de enzymactiviteit.Hier getoond is een werkelijke TLC plaat van een reactie uitgevoerd met behulp van gezuiverde C.difficile RSH. Een controlereactie die geen eiwit bevat, maakt kwantificering van niet-gekatalyseerde ATP hydrolyse mogelijk, terwijl een lege rijstrook nauwkeurige signaalkwantificering mogelijk maakt. In de ATP- en guanosine-tetraphosfat-vlekken brengt het enzym het radioactieve fosfaat van ATP-substraat over naar bbp-voorloper, waardoor radioactief guanosine tetraphosfat ontstaat.Dit bevestigt dat de vermeende guanosine tetraphosfate synthetase van C.difficile een actief enzym is. Door de reactie met tussenpozen te bemonsteren, kan de voortgang worden waargenomen. Hier wordt het ruwe signaal waargenomen op elk tijdstip.ATP neemt af en guanosine tetraphosfat neemt toe. Hier worden de genormaliseerde gegevens weergegeven. De foutbalken zijn veel kleiner omdat normalisatie rekening houdt met een pipettingfout.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om voorzichtig te zijn niet te krassen op de hars op de TLC-plaat, omdat dit kan interfereren met oplosmiddel migratie. Dit is een zeer toegankelijke techniek met eenvoudige data-analyse die snel een robuuste kwantificering van enzymactiviteit kan bieden. We hebben het gebruikt om te bevestigen dat Clostridium difficile guanosine tetraphosfat synthetiseert, wat nooit eerder is gemeld.Vergeet niet dat het werken met radioactiviteit zeer gevaarlijk kan zijn en dat u de regels van uw instelling voor de opslag en het gebruik van radioactieve materialen moet volgen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Deze methode kan inzicht geven in guanosine tetraphosfaetsynthese, maar kan ook worden toegepast op andere fosforreacties, waaronder eiwitkinaseactiviteit en cyclische diguanyaatsynthese.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speeksel, speekselklieren en hemolymfe Collectie van Ixodes scapularis Teken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Het kweken en onderhouden<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In een anaëroob milieu

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Zuivering van Intracellulair Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofaag-cellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

-Cefoperazone behandelde muismodel van klinisch relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Een protocol om de morfologische veranderingen van<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In reactie op Antibiotische Behandeling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...