Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von NIAID 1K22AI118929-01 finanziert. EBP wurde unterstützt durch einen Sommer Research Fellowship Programm Zuschuss von der Office of Research bei Old Dominion University in Norfolk, Virginia, USA.

(1) induzierbaren Überexpression eines Proteins Histidin-markierten
<ol><li>Rsh von C. Difficile R20291 genomic DNA zu verstärken.<ol>
<li>Verwenden Sie eine High Fidelity Polymerase und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>C. Difficile Rsh mit Primer zu verstärken Rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) und Rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), die einen C-terminale Hexahistidine Tag einführt. Hinweis:...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. 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D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

Hier berichten wir die Reinigung des His-Tags RSH von C. Difficile und stellen eine Methode zur Quantifizierung der Aktivität mit radioaktiven Dünnschichtchromatographie. Diese Methode wurde zuvor verwendet, um die Aktivität der Diguanylate Cyclase Enzyme von C. Difficile, sowie (p) PpGpp Synthestase, Nukleotid-Cyclase, Kinase und Phosphodiesterase Enzyme aus anderen Organismen11,12 bewerten ,13,...

Kinase und Pyrophosphokinase (oder Diphospho-Kinase) Enzyme ins Substrat Moleküle Phosphate aus Nukleotid Triphosphat (NTP) Vorstufen. Die Substrate können andere Nukleotide, Aminosäuren oder Proteine, Kohlenhydrate und Lipide1gehören. Bioinformatische Analysen können manchmal ein Enzym cognate Substrat oder Substrate aufgrund der Ähnlichkeit zu gekennzeichnet Enzyme, aber experimenteller Validierung ist immer noch notwendig. Ebenso müssen die Affinität des Enzyms für ihre Substrate und die Rate, mit der es die Phosphor-Transfer Reaktion katalysiert, und die Auswirkungen der Co-Faktoren, Inhibitoren oder anderen Enzym Effektoren experimentell ermittelt werden. Zur Vermeidung von Erschöpfung der ATP-Vorstufe durch andere Enzyme ATP verbrauchenden in bakteriellen Zytoplasma erfordern quantitative Aktivität Assays gereinigtes Protein.
Proteinreinigung durch Metall Affinitätschromatographie wurde gründlich in die Literatur2,3berichtet. Histidin-Tags bestehend aus sechs aufeinander folgende Histidin Rückstände angehängt, N - oder C-Terminus eines rekombinanten Proteins erlauben schnelle Reinigung von Metall Affinität Chromatographie4,5,6. Diese Sequenzen sind klein im Vergleich zu den Proteinen, die Sie ändern und haben in der Regel einen minimalen Einfluss auf die Proteinfunktion, obwohl sie manchmal Proteinstabilität und/oder Enzym Kinetik7,8zu ändern. Histidin-Tags auf die N - und C-Termini des gleichen Proteins können unterschiedliche Auswirkungen haben schwer vorherzusagen, ohne zu wissen, die Struktur des Proteins in Frage stellen. Histidin-Tags sind in der Regel beim Klonen eines rekombinanten Proteins durch die Gestaltung von Grundierungen, die sechs Histidin Rückstände entweder sofort kodieren 3', die ATG-Start-Codon oder sofort 5' auf das Stopp-Codon der offenen Leserahmen eingearbeitet. Nach Verstärkung ist das Hexahistidine-haltigen gen in einen Vektor unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors ligiert und zum Ausdruck gebracht, in der Regel in einem Laborstamm von E. Coli. Die Rekombination Protein kann dann auf eine Affinität Harz mit immobilisierten zweiwertigen kationen (in der Regel Nickel oder Kobalt)9isoliert werden. Kontaminierende native Metall-bindende Proteine kann durch Titration mit Imidazol, entfernt werden die gebundenen Protein2kompetitiv verdrängt. Zu guter Letzt ist das Zielprotein aus der Spalte mit höheren Konzentrationen von Imidazol eluiert. Gibt es mehrere kommerzielle Quellen immobilisierten Metall kation Harze, und die Hersteller geben Empfehlungen für die Pufferbedingungen und Imidazol-Konzentrationen. Nach der Elution kann Protein von Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, dialysiert oder sofort in funktionellen Tests verwendet.
Es gibt mehrere Methoden, um die Kinase-Aktivität durch die Kopplung von ATP-Phosphat-Bindung-Hydrolyse zu einer zweiten Reaktion, die veröffentlicht oder reizt ein Fluorophor oder Chemilumineszenz erzeugt mittelbar zu überwachen, aber diese Reaktionen haben mehrere bewegliche Teile und kann logistisch anspruchsvollen10. Der direkteste Weg, insbesondere Phosphor-Transfer Aktivität zu messen ist, direkt die Übertragung von einem radioaktiven Phosphatgruppe von einem handelsüblichen γ -32-P überwachen NTP Vorstufe zu einem Substrat nicht radioaktiv-11 , 12 , 13. Mischungen von radioaktiven Substrate und Produkte getrennt und durch Dünnschichtchromatographie (TLC) quantifiziert werden können. TLC nutzt die differenzielle Mobilität von gelösten Stoffen in einem bestimmten Lösungsmittel dadurch, dass das Lösungsmittel (flüssige Phase) durch Kapillarwirkung über eine Oberfläche (feste Phase) migrieren, auf denen eine Mischung aus gelösten Stoffen adsorbierten14gewesen ist. Solute, die klein sind und/oder günstige Wechselwirkungen mit der festen Phase fehlt migrieren Entfernungen von ihrem ursprünglichen Speicherort als gelöste Stoffe mit höherer Molekulargewichte oder große Affinitäten für die solide. Für die Prüfung der Phosphor-Transfer erhöhen Phosphat Moieties das Molekulargewicht von Molekülen, die sie hinzugefügt werden, die und fügen Sie negativen Ionischen Ladung bei neutralen oder sauren pH11,12,14. Dies verringert ihre Mobilität auf einer Grundfläche wie PEI-Zellulose. Bei der Entwicklung im sauren Kalium-Phosphat-Puffer können Mischungen von Mono - di-, Tri-, Tetra- und Pentaphosphate Arten leicht auf PEI-Zellulose, so dass die Quantifizierung der einzelnen Arten (Abbildung 2, Abbildung 3) getrennt werden. Solche Tests können mit Zelle Lysates, enthält das Enzym von Interesse durchgeführt werden, aber dies beinhaltet das Potential für die Tätigkeit der anderen Kinasen und Phosphatasen allgemeine ATPasen, Substrat und/oder Produkt zum Abbau. Für eine quantitative in-vitro- Bewertung der Enzym-Aktivität ist es notwendig, das Enzym von Interesse zu reinigen.
Guanosin Tetraphosphate (PpGpp) und Guanosin Pentaphosphate (PppGpp) sind Ribonukleotidreduktase Signalisierung Moleküle gebildet durch die Übertragung von einem Pyrophosphat Gruppe aus einem Vorläufer von Adenosintriphosphat (ATP), bzw. ein Guanosin-diphosphat (BIP) oder Guanosin Tetraphosphate (GTP) Substrat15. Diese einzelnen Ribonukleotidreduktase Signale, zusammen bekannt als (p) PpGpp, vermitteln eine Zelle-weite Reaktion auf Umweltstress, bekannt als die strenge Reaktion in unterschiedlichen Bakterienarten15,16. Konservierte Zweiklassen-Enzyme katalysieren die Bildung von (p) PpGpp15,17 Rel/Spo Homolog (RSH) Enzyme sind "lang" bifunktionelle (p) PpGpp Synthestase/Hydrolasen benannt nach ihrer Ähnlichkeit zu den RelA und SpoT (p) PpGpp metabolische Enzyme aus Escherichia coli enthalten Synthestase, Hydrolase und regulatorischen Domains, während kleine Alarmone Synthestase (SAS) Enzyme kurze monofunktionalen Synthetasen fand ausschließlich in Gram-positiven Bakterien-15, sind 17 , 18. das Spore-bildenden Gram-positiven Bakterium Clostridium Difficile kodiert vermeintliche RSH und SAS Gene19. Hier präsentieren wir Ihnen erste Aktivität-Assays, die bestätigen, dass die C. Difficile RSH Enzym ist eine katalytisch aktiven (p) PpGpp Synthestase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

Kinase und Pyrophosphokinase Enzyme übertragen die Gamma-Phosphat oder Beta-Gamma Pyrophosphat glyko-aus Nukleotid Triphosphat Vorstufen auf Substrate phosphorylierten Produkte zu schaffen. Die Verwendung von γ -32- P bezeichnet NTP Vorstufen ermöglicht die gleichzeitige Überwachung der Substrat-Auslastung und Produkt-Bildung durch Röntgen. Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Zellulose Platten ermöglicht schnelle Trennung und sensible Quantifizierung von Substrat und Produkt. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Nutzung der Dünnschichtchromatographie um die Pyrophosphokinase Aktivität einer gereinigten (p) PpGpp Synthestase assay. Diese Methode wurde zuvor verwendet, um die Aktivität der zyklische Nukleotid und Dinucleotide Synthetasen charakterisieren und eignet sich im großen und ganzen für die Charakterisierung der Aktivität jedes Enzym, das eine Nukleotid Triphosphat Bindung hydrolysiert oder überträgt einen terminal Phosphat von einem Phosphat-Spender zu einem anderen Molekül.

Wir präsentieren eine Methode für die Affinitätsreinigung ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium Difficile und die Beurteilung der seine enzymatische Aktivität. Abbildung 1 veranschaulicht die Proteinreinigung durch Metall Affinitätschromatographie erreicht. Die zweite Elution (E2)-Fraktion aus diese Reinigung war dialysiert und für die enzymatische Aktivität Assay verwendet. Abbildung 2 beschreibt die notwendi...

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A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Hier beschreiben wir eine Methode zur Reinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase Enzyme und Dünnschichtchromatographie radioaktiv Substrate und Produkte, für die enzymatische Aktivität in Vitroassay nutzen. Die Enzym-Aktivität-Assay ist breit anwendbar auf Kinase, Nukleotid-Cyclase oder Phosphor-Transfer-Reaktion, deren Mechanismus Nukleotid Triphosphat Hydrolyse umfasst.

Eine Reinigung und In vitro- Aktivität Assay für ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu Phosphotransferenzymen zu beantworten, einschließlich Enzymsubstratspezifität und Reaktionskinetik. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle Erfassung mehrerer Datensätze ermöglicht, die sehr konsistent sind und eine statistisch robuste Quantifizierung der Enzymaktivität ermöglichen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es viel einfacher zu demonstrieren als zu erklären ist, die Reaktionen auf die TLC-Platten zu erkennen und die radioaktiven Arten in den Reaktionen zu quantifizieren.Neben Astha wird Asia Poudel, eine weitere Studentin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie dieses Protokoll mit induzierbarer Überexpression eines Histidin-getaggten Proteins, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie einen Milliliter Nickel-Nittriloessigsäureharz in einer Gravitationssäule vor, um das Protein zu reinigen.Am Tag vor dem Gebrauch, gleicht die Säule über Nacht bei vier Grad Celsius mit zwei MilliliterN Gleichgewichtspuffer aus. Am nächsten Tag bringen Sie die Säule von vier Grad Celsius auf Raumtemperatur, bevor Sie das geklärte Lysat beladen und etwa zwei bis drei Stunden stehen lassen. Dann das Pellet im Lysepuffer wieder aussetzen.Sonicatdie Zellen auf Eis für 10 mal 10-Sekunden-Intervalle, Pausieren 30 Sekunden zwischen den Impulsen. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 3 080 mal g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit einer Mikrozentrifuge. Bereiten Sie das geklärte Lysat mit gleichen Mengen lysepuffer numerisch vor, wenden Sie dann das vorbereitete, geklärte Lysat auf die Säule an und sammeln Sie den Durchfluss.Wenden Sie den geklärten Lysatdurchfluss erneut auf die Säule an und sammeln Sie den sekundären Durchfluss. Dann waschen Sie die Säule mit fünf Milliliter Waschpuffer ein sund sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule erneut mit fünf Milliliterwaschpuffer zwei und sammeln Sie den Durchfluss.Wenden Sie nun zwei Milliliter Elutionspuffer an. Sammeln Sie den Durchfluss in zwei Bruchteilen von je einem Milliliter. Bei der Proteinreinigung ist die Aufnahme von Magnesiumchlorid in die Reinigungspuffer, eine Änderung des Herstellerprotokolls, für die enzymatische Aktivität unerlässlich.Um die Proteinreinigung durch SDS-PAGE qualitativ zu bewerten, führen Sie 20 Mikroliter-Aliquots aller Spaltenfraktionen auf einem 4%-Stacking aus, 10%laufendes Polyacrylamid-Gel für 60 Minuten bei 170 Volt. Färben Sie das Gel mit 0,1%Coomassie blau bei Raumtemperatur für fünf Stunden, schaukeln sanft auf einem Tisch Rocker. Dann das Gel in 40%Methanol-10%Eisessigsäure über Nacht bei Raumtemperatur destainieren und auf der Tischplatte Schaukeln.Dialyse die eluierte Fraktion zwei gegen Dialysepuffer im Verhältnis 200:1 mit einem Ein-Milliliter-Dialysegerät mit einem 20-Kilodalton-Molekulargewicht über Nacht bei vier Grad Celsius. Bestimmen Sie die Konzentration der dialysierten Proteinprobe, indem Sie die Absorption bei 280 Nanometern messen und den berechneten Molaren-Aussterbekoeffizienten verwenden. 100-Mikroliter-Aliquots der dialysierten Proteinprobe bei minus 80 Grad Celsius bis zur Verwendung lagern.Vor der Reaktion bereiten Sie PEI-Zellulose-Dünnschichtchromatographieplatten vor, indem Sie sie in entionisiertem Wasser waschen. Die Platten in eine Glaskammer mit doppelt destilliertem Wasser bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 Zentimetern legen. Nachdem Sie das Wasser an die Spitze der Platte wandern lassen, die Platten aus der Glaskammer holen und auf einem Tischträger über Nacht trocknen lassen.Markieren Sie die getrockneten Platten zwei Zentimeter von einer Kante mit einem weichen Bleistift, um anzugeben, wo die Proben für TLC angewendet werden. Bei Proben mit zwei Mikrolitern Proben nicht weniger als einen Zentimeter voneinander entfernt anwenden. Lassen Sie bei der Planung von Experimenten immer einen Fleck auf jeder Platte ungenutzt, um als leere Spur für die Probenquantifizierung zu dienen.Um den Enzymaktivitätstest durchzuführen, bereiten Sie individuelle Reaktionen mit Gamma P32 ATP vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie die RSH hinzu, nachdem die anderen Komponenten gemischt wurden, da die Zugabe von RSH zum Nukleotid-haltigen Mix den enzymatischen Aktivitätstest einleitet. Um die ATP-Hydrolyse von der kontaminierenden Nukleaseaktivität zu steuern, montieren Sie eine 10-Mikroliter-Reaktion, die kein Protein enthält, und inkubieren Sie sie parallel.Erkennen Sie Zwei-Mikroliter-Proben bei T gleich Null und am Ende des Experiments, um sicherzustellen, dass ATP ohne Protein nicht hydrolysiert wurde. Unmittelbar nach Zugabe von RSH zwei Mikroliter entfernen und auf der beschrifteten PEI-Zelluloseplatte erkennen, da die T einer Null-Minuten-Probe entspricht. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius, wodurch zwei Mikroliter Aliquots zu den gewünschten Zeitpunkten entfernt werden.Nachdem alle Aliquots gesammelt wurden, führen Sie eine Dünnschichtchromatographie durch, indem Sie die Chromatographiekammer mit 1,5-molaren monobasisem Kaliumphosphat bis zu einer Tiefe von 0,5 Zentimetern füllen. Tauchen Sie den unteren Rand der Platte in Lösungsmittel ein und lassen Sie das Lösungsmittel über ca. 90 Minuten an die Plattenoberseite wandern. Entfernen Sie die Platte aus dem Chromatographietank und legen Sie sie auf einen Tischtrockner, um sie über Nacht zu trocknen.Nachdem die Platte trocken ist, wickeln Sie die Platte in Kunststofffolie, um eine Übertragung radioaktiven Materials auf die Bildkassette zu vermeiden und durch Autoradiographie zu analysieren. Setzen Sie die PEI-Zelluloseplatte mit getrennten Reaktionen auf eine Phosphorimagerkassette für vier Stunden bei Raumtemperatur aus. Zeigen Sie nach der Belichtung die Kassette auf einem Phosphorimager ab.Zeichnen Sie mithilfe von Bildverarbeitungssoftware mit grafischer Benutzeroberfläche Interessenbereiche oder ROIs, indem Sie zuerst Ein Rechteck zeichnen auswählen, und verwenden Sie dann die Maus, um rechteckige ROIs um eine ganze Spur zu zeichnen, und die IN dieser Spur enthaltenen ATP- und Guanosin-Tetraphosphat-Spots. Verwenden Sie die Befehle Auswählen, Kopieren und Einfügen, um identische ROIs innerhalb der anderen Fahrspuren zu zeichnen, um sicherzustellen, dass die ROIs das Signal in identischen Bereichen in jeder Spur messen. Fügen Sie ROIs aus einer nicht verwendeten Spur ein, die als Leerzeichen verwendet werden soll.Wählen Sie mit den Befehlen Analysieren, Tools, ROI-Manager, Hinzufügen der Imaging-Software alle ROIs aus, die auf der PEI-Zelluloseplatte gezeichnet werden. Verwenden Sie nun die Befehle Analysieren, Messen festlegen, Messen, um die Signalintensität innerhalb jedes ROI zu quantifizieren und die Messungen als Spreadsheeet zu exportieren. Subtrahieren Sie in der Kalkulationstabelle leere ROI-Werte von experimentellen Signalen.Die Konvertierung der Daten in das prozentuale Guanosin-Tetraphosphat-Synthetisierte ist entscheidend, da es sicherstellt, dass Datensätze, die an verschiedenen Tagen mit unterschiedlichen Proteinchargen oder verschiedenen Gamma-P32-ATP gesammelt werden, konsistent sind und für statistische Strenge gepoolt werden können. Diese Karikatur zeigt, wie Interessensgebiete verwendet werden, um eine Spur zu definieren, die das gesamte radioaktive Signal in einer Probe und die Komponente radioaktive ATP- und Guanosintetraphosphat-Regionen von Interesse enthält. ATP- und Guanosin-Tetraphosphatsignale werden auf das Gesamtsignal normalisiert, anstatt die absoluten Werte zu melden, da Pipettierfehler oder Zerfall des radioaktiven Substrats das Gesamtsignal in der Probe beeinflussen können, aber nicht die Enzymaktivität beeinflussen.Hier ist eine tatsächliche TLC-Platte einer Reaktion mit gereinigtem C.difficile RSH. Eine Kontrollreaktion, die kein Protein enthält, ermöglicht die Quantifizierung der nicht katalysierten ATP-Hydrolyse, während eine leere Spur eine genaue Signalquantifizierung ermöglicht. In den ATP- und Guanosin-Tetraphosphat-Spots überträgt das Enzym das radioaktive Phosphat vom ATP-Substrat auf den BIP-Vorläufer und erzeugt radioaktives Guanosintetraphosphat.Dies bestätigt, dass die vermeintliche Guanosintetraphosphatsynthetase von C.difficile ein aktives Enzym ist. Durch die Probenahme der Reaktion in Intervallen kann der Fortschritt beobachtet werden. Hier wird das Rohsignal zu jedem Zeitpunkt beobachtet.ATP nimmt ab und Guanosintetraphosphat nimmt zu. Hier sind die normalisierten Daten zu sehen. Die Fehlerbalken sind viel kleiner, da die Normalisierung für pipettierende Fehler verursacht.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Harz auf der TLC-Platte nicht zerkratzt wird, da dies die Lösungsmittelmigration beeinträchtigen kann. Dies ist eine sehr zugängliche Technik mit einfacher Datenanalyse, die schnell eine robuste Quantifizierung der Enzymaktivität ermöglichen kann. Wir haben es verwendet, um zu bestätigen, dass Clostridium difficile Guanosintetraphosphat synthetisiert, das noch nie zuvor berichtet wurde.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität extrem gefährlich sein kann, und Sie müssen die Regeln Ihrer Institution für die Lagerung und Verwendung radioaktiver Materialien befolgen, während Sie dieses Verfahren durchführen. Diese Methode kann Einblick in Guanosin Tetraphosphat-Synthese bieten, aber es kann auch auf andere Phosphotransfer-Reaktionen angewendet werden, einschließlich Proteinkinase-Aktivität und zyklische Digulylat-Synthese.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Kultivierung und Pflege<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In einer anaeroben Umgebung

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazon behandelten Maus-Modell der klinisch relevanten<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Dehnungs R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...