Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
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この作品は、NIAID 1K22AI118929-01 によって賄われていた。EBP はオールド ドミニオン大学、ノーフォーク、バージニア州、アメリカ合衆国での調査のオフィスから夏研究フェローシップ プログラム助成金によって支えられました。

1. 誘導ヒスチジン付けられた蛋白質過剰発現
<ol><li>Difficile C. R20291 ゲノム DNA からrshを増幅します。<ol>
<li>高品質なポリメラーゼを使用し、製造元の指示に従ってください。</li>
		<li>C. ディフィシル rshのプライマーを用いて増幅します。 rsh_F (カリフォルニア州GGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) と rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC)、C 末端...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

ここで報告difficile C.から彼の付けられた RSH の浄化と radiolabeled 薄層クロマトグラフィーを用いた活動の定量化手法を提案します。このメソッドは、以前のdifficile C.、(p) ppGpp 合成酵素、ヌクレオチド酸シクラーゼ、キナーゼ diguanylate 酸シクラーゼ酵素と他の生物から11,12 ホスホジエステラーゼの酵素活性を評価するために使用されていま?...

キナーゼとピロホスホキナーゼ (または diphospho キナーゼ) の酵素はヌクレオチド三リン酸 (NTP) 前駆体から基質分子にリン酸塩を転送します。基板は他のヌクレオチド、アミノ酸や蛋白質、炭水化物および脂質1を含めることができます。酵素の同種基板や基板の特徴酵素に類似度に基づく情報の解析が予測できる時が、実験による検証が必要です。同様に、その substrate(s) のレートでそれは蛍光体転送反応を触媒する酵素の親和性と共同の要因、阻害剤、または他の酵素のエフェクタの効果は実験的決定する必要があります。その他の ATP 消費の酵素を細菌の細胞質に存在して ATP 前駆体の枯渇を避けるため、定量的活性アッセイは浄化された蛋白質を要求します。
金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質の浄化は、文献2,3徹底的に覆われています。N- または C 末端の組換え蛋白質を追加 6 連続ヒスチジン残基から成るヒスチジン タグは、金属親和性クロマトグラフィー4,5,6による急速な浄化を許可します。これらのシーケンスが彼らは時々、タンパク質の安定性や酵素反応速度論7、8を変更すること、彼らは変更し、タンパク質の機能にほとんど影響を持つ通常のタンパク質に比べて小さいです。ヒスチジン タグで N と C-末端同じ蛋白質の問題の蛋白質の構造を知らなくても予測することは困難である、さまざまな効果を持つことができます。ヒスチジンのタグは、通常ケーブルをどちらかすぐに六つのヒスチジン残基をエンコードのプライマーを設計することによって、3' ATG 開始コドンにまたはすぐに 5' 停止コドンに開いたリーディング ・ フレームの組換え蛋白質のクローン作成中に組み込まれています。増幅後、hexahistidine を含む遺伝子は誘導性プロモーターの制御の下でベクトルに、大腸菌の実験室で、通常表されます。組換えタンパク質は、固定化の二価陽イオン (通常ニッケルまたはコバルト)9を含む親和性の樹脂で分離できます。ネイティブ金属結合蛋白質の汚染は、競争力のある連結蛋白質2を転置するイミダゾールを滴定法によって削除できます。最後に、ターゲット蛋白質はイミダゾールの高濃度の列から溶離されます。固定化金属陽イオン樹脂のいくつかの商業源があるし、メーカーは、バッファー条件とイミダゾールの集中のための推奨事項を提供します。溶出後タンパク質ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を用いて、透析、または機能の試金ですぐに使用します。
ATP のリン酸結合の加水分解を解放または励起、蛍光、化学発光を生成します 2 番目の反応に結合することによって直接にキナーゼ活動を監視する方法はいくつかありますが、これらの反応は複数の可動部が、することができます。ロジスティック困難である10。特に蛍光体転送アクティビティを測定する最も簡単な方法は直接の監視から市販の γ-32radiolabeled リン酸基の転送 -P、非標識基板11に NTP 前駆体,12,13。 標識基板と製品の混合物を分離および薄層クロマトグラフィー (TLC) による定量化できます。TLC は、毛管作用によって、溶質の混合物の吸着14をされている表面 (固相) に移行する溶媒 (液相) により溶媒中の溶質の差分のモビリティを利用しています。小さいや固相との良好な相互作用が不足する溶質移行より高い分子量またはソリッドの偉大な親和性と溶質それぞれ初期の場所から長い距離。蛍光体転送の検討、リン酸基は彼らを追加する、中性または酸性 pH11,12,14負イオン電荷を追加分子の分子量を増やします。これは PEI セルロースなどの基本的な面で自分たちのモビリティを減らします。酸性カリウム リン酸バッファーに開発され、モノ、ジ、トリ、テトラ-、pentaphosphate 種の混合物は、PEI セルロース、(図 2 図 3) 各種の定量化を可能に容易に分離できます。関心の酵素を含むセル lysates を使用してこのようなアッセイを行うことが、これは基板や製品を破壊する他のキナーゼ、ホスファターゼ、および一般的な Atpase の活動の可能性を含まれています。酵素活性の定量の in vitro評価、関心の酵素を浄化するために必要です。
グアノシン四リン酸 (ppGpp) とグアノシン pentaphosphate (pppGpp) は、リボヌクレオチド シグナリング分子、ピロリン酸の移動によって形成されたグループ アデノシン三リン酸 (ATP) の前駆体から、それぞれ、グアノシン二リン酸 (GDP) またはグアノシン四リン酸 (GTP) 基板15。(P) ppGpp と総称するこれらの単一リボヌクレオチド信号は、多様な細菌種15,16で厳格な応答として知られている環境ストレスへのセル全体の応答を仲介します。形成を触媒する酵素の 2 つの保存されたクラス (p) ppGpp15,17 Rel/Spo の相同物 (RSH) 酵素が 'long' 二官能性 (p) ppGpp 合成酵素/加水分解酵素関連やスポット (p) が彼らの類似の名前 ppGpp 代謝小さな alarmone 合成酵素 (SAS) 酵素がグラム陽性菌15,排他的に見られる短い単シンテターゼ、合成酵素、加水分解酵素、および規制のドメインを含む大腸菌由来の酵素17,18. 胞子形成グラム陽性菌クロストリジウム ・ ディフィシルは、RSH と SAS の推定の遺伝子19をエンコードします。C. ディフィシルRSH 酵素が触媒活性を示す (p) ppGpp 合成酵素であることを確認する初期活性測定法を紹介します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

酵素キナーゼとピロホスホキナーゼは、ヌクレオチド三リン酸前駆体から γ リン酸または β-γ ピロリン酸基をリン酸化製品を作成する基板に転送します。使用-p NTP 前駆体をラベル付けにより、γ-32のラジオグラフィによる基板の利用と製品の形成を同時にモニタリングします。薄層クロマトグラフィー (TLC) セルロース プレート上では、迅速な分離と基板と製品の定量法をことができます。アッセイの精製 (p) ppGpp 合成酵素のピロホスホキナーゼ活動に薄層クロマトグラフィーを利用するための方法を提案します。このメソッドは以前環状ヌクレオチド及び還元型酵素の活動の特性に使用されています、ヌクレオチドの三リン酸塩結合を加水分解するまたは端末に転送する酵素の活性の特性を広く適切ですリン酸リン酸ドナーから別の分子へ。

クロストリジウム ・ ディフィシルとその酵素活性の評価から (p) ppGpp 合成酵素の親和性の浄化のための方法を提案する.金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーにより蛋白質の浄化を図 1に示します。この精製から 2 番目の溶出 (E2) 分数は透析、酵素活性アッセイに使用します。図 2は、準備し、薄層クロマトグ?...

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A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

ここでは、放射性標識基質と酵素活性の生体外の試金する製品の薄層クロマトグラフィーによるヒスチジン ピロホスホキナーゼ酵素の浄化法について述べる.酵素活性測定法はキナーゼ、ヌクレオチド酸シクラーゼ、またはその機構を含むヌクレオチド三リン酸加水分解蛍光体移動反応に広く適用可能。

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

この方法は、酵素基質特異性および反応動態を含むリン酸化酵素に関する重要な質問に答える助けとなる。この手法の主な利点は、非常に一貫性のある複数のデータセットを迅速に収集できるため、酵素活性の統計的に堅牢な定量が可能です。この方法の視覚的なデモンストレーションは、TLCプレートに反応を発見し、反応中の放射性種を定量化することは、説明するよりもはるかに簡単に実証できるため、非常に重要です。アスタに加えて、この手順を実証するのは、私の研究室のもう一人の大学院生であるアジア・プーデルです。テキストプロトコルに記載されているように、ヒスチジンタグ付きタンパク質の誘導可能な過剰発現でこのプロトコルを開始します。重力カラムにニッケルニトリロ酢酸樹脂を1ミリリットル用意して、タンパク質を精製します。使用前日、2ミリリットルの平衡バッファーで一晩4度でカラムを平衡化する。翌日、明確化されたライセートをロードする前に、カラムを摂氏4度から室温に戻し、約2〜3時間放置します。次に、リシスバッファー内のペレットを再懸濁します。氷上の細胞を10秒間隔で10回超音波処理し、パルス間で30秒間一時停止します。マイクロ遠心分離機を用いて摂氏4度で30分間3,080回gの遠心分離により、ライセートを明らかにする。同じ量のリシスバッファーで明確化したライセートを準備し、その後、準備された、明確化されたライセートをカラムに適用し、フロースルーを収集します。明確化されたライセートフロースルーをカラムに再適用し、二次フロースルーを収集します。その後、5ミリリットルの洗浄バッファー1でカラムを洗浄し、フロースルーを収集します。5ミリリットルの洗浄バッファー2でカラムをもう一度洗い、フロースルーを収集します。今、溶出バッファーの2ミリリットルを適用します。フロースルーをそれぞれ1ミリリットルの2つの部分で収集します。タンパク質精製の際、精製バッファーに塩化マグネシウムを含めることが、製造業者のプロトコルに対する変更であり、酵素活性に不可欠です。SDS-PAGEによるタンパク質精製を定性的に評価するには、4%スタッキングで全てのカラム分画の20マイクロリットルのアリコートを実行し、10%は170ボルトで60分間ポリアクリルアミドゲルを実行します。室温で0.1%クマシーブルーでゲルを5時間染色し、ベンチトップロッカーで穏やかに揺れます。その後、ゲルを室温で一晩40%メタノール-10%氷酢酸でデステインし、ベンチトップロッカーで揺れる。200:1比で透析バッファーに対して溶出した分画2を、摂氏4度で一晩で20キロダルトンの分子量カットオフを有する1ミリリットル透析装置を使用して透析バッファーに対して透析する。280ナノメートルで吸光度を測定し、計算されたモル絶滅係数を使用して、透析タンパク質サンプルの濃度を決定します。透析タンパク質サンプルの100マイクロリットルのアリコートを使用するまでマイナス80°Cで保存します。反応を行う前に、脱イオン水で洗浄して、薄層クロマトグラフィープレートのPEIセルロースを調製します。プレートをガラスチャンバーに入れ、二重蒸留水を約0.5センチメートルの深さまで入れます。水がプレートの上部に移動することを許可した後、ガラスチャンバーからプレートを持ち出し、ベンチトップラックに残して一晩乾燥させます。乾燥したプレートを1つの端から2センチメートル離れた場所に柔らかい鉛筆でマークし、サンプルがTLCに適用される場所を示します。2マイクロリットルのサンプルの場合、1センチメートル以上離れたサンプルを適用します。実験を計画する場合は、各プレートに常に1つのスポットを未使用のままにして、サンプル定量用の空白のレーンとして機能させます。酵素活性アッセイを行うために、テキストプロトコルに記載されているようにγP32 ATPを用いて個々の反応を調製する。ヌクレオチド含有混合物にRSHを添加すると酵素活性アッセイが開始されるように、他の成分が混合された後にRSHを添加する。ヌクレアーゼ活性を汚染することからATP加水分解を制御するには、タンパク質を含みずに10マイクロリットル反応を組み立て、それを並行してインキュベートする。T等しいゼロで2マイクロリットルのサンプルを見つけ、実験の最後にATPがタンパク質の不在時に加水分解されていないことを確認します。RSHを添加した直後に、2マイクロリットルを取り除き、Tがゼロ分サンプルに等しいようにラベル付きPEIセルロースプレートにスポットを当てる。摂氏37度で反応をインキュベートし、所望の時点で2マイクロリットルのアリコートを取り除く。すべてのアリコートが収集された後、0.5センチメートルの深さまで1.5モル単塩基性リン酸カリウムでクロマトグラフィーチャンバーを充填することにより、薄層クロマトグラフィーを行います。プレートの底辺を溶媒に浸し、約90分間にわたってプレートの上部に移動させます。クロマトグラフィータンクからプレートを取り出し、ベンチトップの乾燥ラックに置き、一晩空気乾燥します。プレートが乾燥したら、プラスティックフィルムでプレートを包み込んで、放射性物質を撮像カセットに送り込むのを避け、自動ラジオグラフィーで分析します。分離反応を含むPEIセルロースプレートをリンイメージカセットに室温で4時間露出させます。露光後、リンイメージャー上にカセットを画像化します。グラフィカルユーザーインターフェースを備えたイメージングソフトウェアを使用して、最初に矩形を描画を選択して目的の領域またはROIを描画し、マウスを使用して1車線全体の周りに長方形のROIを描き、そのレーン内に含まれるATPおよびグアノシン-テトラリン酸スポットを描きます。[選択]、[コピー]、[貼り付け]コマンドを使用して、他のレーン内に同一のROIを描画し、ROI が各レーン内の同一領域内で信号を測定していることを確認します。未使用のレーンの ROI を含めます。解析、ツール、ROI マネージャ、イメージング ソフトウェアの追加コマンドを使用して、PEI セルロース プレートに描画されたすべての ROI を選択します。解析、測定の設定、測定コマンドを使用して、各ROI内の信号強度を定量化し、測定値を拡散シートとしてエクスポートします。スプレッドシートで、実験信号から空白のROI値を減算します。異なるタンパク質のバッチまたは異なるガンマP32 ATPで異なる日に収集されたデータセットが一貫しており、統計的な厳格さのためにプールすることができるので、データをグアノシン-テトラリン酸合成率に変換することが重要です。この漫画は、サンプル中の総放射性信号と関心のある成分のATPおよびグアノシンテトラリン酸塩領域を含む車線を定義するために関心のある領域がどのように使用されているかを示しています。ATPおよびグアノシン四リン酸シグナルは、放射性基質のピペット化誤差または崩壊がサンプル中の全シグナルに影響を与える可能性があるが、酵素活性に影響を与えないため、絶対値を報告するのではなく、全信号に正規化される。ここに示されているのは、精製されたC.difficile RSHを用いて行われる反応の実際のTLCプレートである。タンパク質を含み込んだ制御反応は、非触媒ATP加水分解の定量を可能にし、一方、ブランクレーンは正確な信号定量を可能にする。ATPおよびグアノシン-テトラリン酸塩スポットでは、酵素はATP基質からGDP前駆体に放射性リン酸を移し、放射性グアノシン四リン酸を作り出す。これは、C.difficile由来のテトラリン酸テトラリン酸酵素が活性酵素であることを確認する。反応を一間隔でサンプリングすることで、進行を観察することができる。ここで生信号は各時点で観察される。ATPが減少し、グアノシン四リン酸が増加しています。ここに示されているのは、正規化されたデータです。正規化はピペット処理エラーを占めるため、誤差範囲ははるかに小さくなります。この手順を試みる間、これは溶媒の移動を妨げる可能性がありますので、TLCプレート上の樹脂を傷つけないように注意することが重要です。これは、酵素活性の堅牢な定量を迅速に提供できる、簡単なデータ分析を備えた非常にアクセス可能な手法です。我々は、クロストリジウム・ディフィシルがグアノシン四リン酸を合成することを確認するためにそれを使用しました, これは以前に報告されたことがない.放射能を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行しながら放射性物質の貯蔵と使用に関する機関の規則に従わなければならないことを忘れないでください。この方法は、グアノシンテトラリン酸合成に関する洞察を提供することができますが、タンパク質キナーゼ活性および環状デグアニル酸合成を含む他のホスホトランスファー反応にも適用できます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

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培養およびメンテナンス<em&gt;クロストリジウム·ディフィシル</em&gt;嫌気性環境での

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

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インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

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臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;ひずみR20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

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形態変化を特徴付けるプロトコル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;抗生物質治療に対する反応

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性

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