Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av NIAID 1K22AI118929-01. EBP ble støttet av en sommer forskning Fellowship Program stipend fra Office for forskning ved Old Dominion University i Norfolk, Virginia, USA.

1. induserbart overuttrykte et histidin-merket Protein
<ol><li>Forsterke rsh fra C. difficile R20291 genomisk DNA.<ol>
<li>Bruke en høy kvalitet utvalg, og følg produsentens instruksjoner.</li>
		<li>Forsterke C. difficile rsh bruker primere rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) og rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), som introduserer en C-terminalen hexahistidine kode. Merk: KpnI og PstI kutte områder i primer sekvens...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

Her rapporterer vi rensing av hans-merket RSH fra C. difficile og presentere en metode for aktivitet kvantifisering bruker radiolabeled tynt lag kromatografi. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å vurdere diguanylate cyclase enzymer fra C. difficile, samt nucleotide cyclase (p) ppGpp synthetase, kinase og fosfodiesterase enzymer fra andre organismer11,12 ,13,21. Meto...

Kinase og pyrophosphokinase (eller diphospho-kinase) enzymer overføre fosfater fra nukleotid trifosfat (NTP) forløpere til underlaget molekyler. Substrater kan inneholde andre nukleotider, aminosyrer eller proteiner, karbohydrater og lipider1. Bioinformatic analyser kan noen ganger forutsi et enzym beslektet substrat eller underlag basert på likheten til preget enzymer, men eksperimentelle validering er fortsatt nødvendig. Tilsvarende affinitet av et enzym for sin substrate(s) og som det gir fosfor-transfer reaksjonen, og effekten av co-faktorer, hemmere, eller andre enzym effektor må avgjøres eksperimentelt. For å unngå uttømming av ATP forløperen av andre ATP tidkrevende enzymer i bakteriell cytoplasma, krever kvantitativ aktivitet analyser renset protein.
Protein rensing av metall affinitet kromatografi har blitt dekket grundig i litteratur2,3. Histidin tags bestående av seks påfølgende histidin rester lagt til N - eller C-terminus en rekombinant protein tillate rask rensing av metall affinitet kromatografi4,5,6. Disse sekvensene er små sammenlignet med proteiner de endre og har vanligvis en minimal effekt på protein funksjon, selv om de kan noen ganger endre protein stabilitet eller enzym kinetics7,8. Histidin koder på N - og C-jernbanestasjonen termini av samme protein kan ha ulike effekter, som er vanskelig å forutsi uten å vite strukturen av proteinet i spørsmålet. Histidin tags er vanligvis innlemmet under kloning av et rekombinant protein ved å utforme primere som kode seks histidin rester, enten umiddelbart 3' til ATG start codon eller umiddelbart 5' å stoppe codon åpent lesing rammen. Etter forsterkning, er hexahistidine inneholder genet samskrevet i en vektor under kontroll av en induserbart selskapet og uttrykt, vanligvis i et laboratorium stamme av E. coli. Rekombinasjon protein kan deretter bli isolert på en affinitet harpiks inneholder immobilisert divalent kasjoner (vanligvis nikkel eller kobolt)9. Forurensende opprinnelige metal-bindende proteiner kan fjernes ved titrering med imidazole, som konkurransedyktig fortrenger bundet protein2. Endelig er mål protein elut fra kolonnen med høyere konsentrasjoner av imidazole. Det er flere kommersielle kilder for immobilisert metall kation harpikser, og produsentene gir anbefalinger for bufferen betingelsene og imidazole konsentrasjoner. Etter elueringsrør, kan protein være analysert av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side), dialyzed eller brukes umiddelbart i funksjonelle analyser.
Det er adskillige metoder å overvåke indirekte kinase aktivitet ved å koble ATP fosfat bond hydrolyse til en andre reaksjon som utgivelser interesserer en fluorophore eller genererer chemiluminescence, men disse reaksjonene har flere bevegelige deler og kan logistisk utfordrende10. Den enkleste måten å måle spesielt fosfor-datatransport aktivitet er å overvåke direkte overføring av radiolabeled fosfatgruppe fra en kommersielt tilgjengelig γ -32-P NTP forløperen til en ikke-radiolabeled substrat11 , 12 , 13. blandinger av radiolabeled underlag og produkter kan atskilt og kvantifisert ved tynt lag kromatografi (TLC). TLC benytter differensial mobilitet av solutes i et gitt løsemiddel ved å la løsemiddelet (flytende fase) overføre kapillær handling over en overflate (solid fase) som en blanding av solutes har vært adsorbert14. Solutes som er små og/eller mangler gunstige interaksjoner med solid fase vil migrere lengre avstander fra deres første sted enn solutes med høyere molekylvekt eller stor slektskap for solid. For undersøkelse av fosfor-overføring øke fosfat moieties molekylvekt molekyler de legges til, og legger til negativ ioniske nøytrale eller surt pH11,12,14. Dette reduserer mobilitet på en grunnleggende overflate som PEI-cellulose. Når utviklet i surt kalium fosfatbuffer, kan blandinger av mono - di-, tre-, tetra- og pentaphosphate Art lett skilles på PEI-cellulose, slik at kvantifisering av hver art (figur 2, figur 3). Slike analyser utføres med cellen lysates som inneholder enzymet rundt, men dette inkluderer potensialet for aktiviteten til andre kinaser, phosphatases og generell ATPases å utarme substrat og/eller produkt. For en kvantitativ i vitro vurdering av enzym aktivitet er det nødvendig å rense enzymet rundt.
Guanosine tetraphosphate (ppGpp) og guanosine pentaphosphate (pppGpp) er ribonucleotide signalnettverk molekyler som er dannet av overføring av en pyrophosphate gruppe fra en adenosin trifosfat (ATP)-forløperen til, henholdsvis en guanosine diphosphate (BNP) eller guanosine tetraphosphate (GTP) substrat15. Disse enkelt ribonucleotide signaler, kollektivt kjent som (p) ppGpp, formidle celle hele svar på miljøstress kjent som strenge svaret i bakteriell artsmangfoldet15,16. To bevarte klasser av enzymer katalysere dannelse (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymer er 'lang' bifunctional (p) ppGpp synthetase/hydrolases oppkalt etter deres likhet til avslapning og SpoT (p) ppGpp metabolske enzymer fra Escherichia coli som inneholder synthetase, hydrolase og regulatoriske domener, mens små alarmone synthetase (SAS) enzymer er korte monofunctional synthetases funnet i Gram positiv bakterier15, 17 , 18. spore-forming Gram-positive bakterien Clostridium difficile koder antatte RSH og SAS gener19. Her presenterer vi første aktivitet analyser som bekrefter at C. difficile RSH enzymet er en katalytisk aktive (p) ppGpp synthetase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

Kinase og pyrophosphokinase enzymer overføre gamma-fosfat eller beta-gamma pyrophosphate moiety fra nukleotid trifosfat forløpere til underlag å lage fosforylert produkter. Bruk av γ -32- P merket NTP forløpere tillater samtidig overvåking av underlaget utnyttelse og produkt dannelsen av røntgenfotograferingen. Tynt lag kromatografi (TLC) på cellulose plater tillater rask separasjon og følsom kvantifisering av underlaget og produkt. Vi presenterer en metode for å utnytte den tynne lag kromatografi å analysen pyrophosphokinase aktiviteten til en renset (p) ppGpp synthetase. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å beskrive aktiviteten av syklisk nukleotid og dinucleotide synthetases og er generelt egnet for karakteriserer aktiviteten til et enzym som hydrolyzes en nukleotid trifosfat obligasjon eller overfører en terminal fosfat fra fosfat giver til et annet molekyl.

Vi presenterer en metode for affinitet rensing av en (p) ppGpp synthetase fra Clostridium difficile og vurdering av den enzymatiske aktiviteten. Figur 1 viser protein rensing av metall affinitet kromatografi. Andre elueringsrør (E2) brøken fra denne renselsen var dialyzed og brukes for enzymatiske aktiviteten analysen. Figur 2 viser de nødvendige skritt for å forberede og gjennomføre pyrophosphotransferase analyser ...

Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Her beskriver vi en metode for rensing histidin-merket pyrophosphokinase enzymer og utnytte tynt lag kromatografi radiolabelled underlag og produkter til analysen for den enzymatiske aktiviteten i vitro. Enzym aktivitet analysen er bredt aktuelt noen kinase, nucleotide cyclase eller fosfor-transfer reaksjon som mekanisme inkluderer nukleotid trifosfat hydrolyse.

En rensing og I Vitro aktivitet analysen for en (p) ppGpp Synthetase fra Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om fosfotransferenzymer, inkludert enzymsubstratspesifisitet og reaksjonskinetikk. Den største fordelen med denne teknikken er at den muliggjør rask innsamling av flere datasett som er svært konsekvente, noe som muliggjør statistisk robust kvantifisering av enzymaktivitet. Visuell demonstrasjon av denne metoden er avgjørende fordi det er mye lettere å se reaksjonene på TLC-platene og kvantifisere de radioaktive artene i reaksjonene enn å forklare.I tillegg til Astha, viser prosedyren vil være Asia Poudel, en annen graduate student fra laboratoriet mitt. Begynn denne protokollen med induserbar overuttrykk av et histidinmerket protein som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en milliliter nikkel nitriloacetic acid harpiks i en gravitasjonskolonne for å rense proteinet.Dagen før bruk, likevekt kolonnen over natten på fire grader Celsius med to milliliter av likevekt buffer. Dagen etter bringer du kolonnen fra fire grader Celsius til romtemperatur før du laster det avklarte lysatet og lar den stå i omtrent to til tre timer. Deretter gjenbruker pellet i lysisbufferen.Sonicate cellene på is i 10 ganger 10-sekunders intervaller, pause 30 sekunder mellom pulser. Klargjør lysatet ved sentrifugering ved 3, 080 ganger g i 30 minutter ved fire grader Celsius ved hjelp av en mikrocentrifuge. Forbered det avklarede lysatet med like mengder lysisbuffer, og bruk deretter den klargjorte, avklarte lysate til kolonnen og samle gjennomstrømningen.Bruk den avklarede lysateflyten på nytt til kolonnen og samle inn den sekundære gjennomstrømningen. Vask deretter kolonnen med fem milliliter vaskebuffer en og samle gjennomstrømningen. Vask kolonnen igjen med fem milliliter vaskebuffer to og samle gjennomstrømningen.Bruk nå to milliliter elution buffer. Samle gjennomstrømning i to brøkdeler av en milliliter hver. Under proteinrensing er inkludering av magnesiumklorid i rensebufferne, en endring av produsentens protokoll, avgjørende for enzymatisk aktivitet.For å kvalitativt vurdere proteinrensing av SDS-PAGE, kjør 20 mikroliter aliquots av alle kolonnefraksjoner på en 4% stabling, 10% kjører polyakrylamidgel i 60 minutter ved 170 volt. Beis gelen med 0,1% Coomassie blå ved romtemperatur i fem timer, gynge forsiktig på en benketopp rocker. Deretter destain gelen i 40% metanol-10% glacial eddiksyre over natten ved romtemperatur, gynge på benkeplaten rocker.Dialyze den eluted fraksjon to mot dialysebuffer på et 200:1-forhold ved hjelp av en en-milliliter dialyseenhet med en 20-kilodaltonmolekylær vekt cutoff over natten på fire grader Celsius. Bestem konsentrasjonen av dialysert proteinprøve ved å måle absorbans ved 280 nanometer og bruke den beregnede molarutryddelseskoeffisienten. Oppbevar 100 mikroliter aliquots av dialyzed protein prøven på minus 80 grader Celsius til bruk.Før du utfører reaksjonen, forberede PEI cellulose tynt lag kromatografi plater ved å vaske dem i deionisert vann. Legg platene i et glasskammer med dobbeltdestillert vann til en dybde på ca. 0,5 centimeter. Etter å ha tillatt vannet å migrere til toppen av platen, ta platene ut av glasskammeret og la på en benkeplate stativ å tørke over natten.Merk de tørkede platene to centimeter fra den ene kanten med en myk blyant for å indikere hvor prøvene skal påføres for TLC. For to mikrolitersprøver, bruk prøver ikke mindre enn en centimeter fra hverandre. Når du planlegger eksperimenter, må du alltid la ett sted stå på hver plate ubrukt for å fungere som et tomt kjørefelt for prøvekvantifisering.For å utføre enzymaktivitetsanalysen, klargjør individuelle reaksjoner ved hjelp av gamma P32 ATP som beskrevet i tekstprotokollen. Tilsett RSH etter at de andre komponentene er blandet, da tillegg av RSH til nukleotidholdig blanding initierer enzymatisk aktivitetsanalyse. For å kontrollere for ATP hydrolyse fra forurensende kjerneaktivitet, monter en 10-mikroliterreaksjon som ikke inneholder noe protein og inkuberer det parallelt.Spot to mikrolitersprøver ved T lik null og på slutten av forsøket for å sikre at ATP ikke ble hydrolysert i fravær av protein. Umiddelbart etter tilsetning av RSH, fjern to mikroliter og se den på den merkede PEI-celluloseplaten, da T er lik null minutters prøve. Inkuber reaksjonen ved 37 grader Celsius, og fjern to mikroliter aliquots på ønskede tidspunkter.Etter at alle aliquots er samlet inn, utfør tynt lag kromatografi ved å fylle kromatografikammeret med 1,5-molar monobasisk kaliumfosfat til en dybde på 0,5 centimeter. Senk ned den nedre kanten av platen i løsemiddel og la oppløsningsvæsken migrere til toppen av platen over ca. 90 minutter. Fjern platen fra kromatografitanken og legg den på et tørkestativ på benkeplaten for å lufttørke over natten.Etter at platen er tørr, pakk platen i plastfilm for å unngå overføring av radioaktivt materiale til bildekassetten og analyser ved autoradiografi. Utsett PEI-celluloseplaten som inneholder separerte reaksjoner på en fosforokassett i fire timer ved romtemperatur. Etter eksponering, bilde kassetten på en fosforer.Bruk av bildeprogramvare med et grafisk brukergrensesnitt, tegn områder av interesse eller ROIer ved først å velge Tegn et rektangle, og bruk deretter musen til å tegne rektangulære ROIer rundt ett helt kjørefelt og ATP- og guanosine-tetrafosfatflekkene i det kjørefeltet. Bruk kommandoene Velg, Kopier og Lim inn til å tegne identiske ROIer i de andre banene for å sikre at ROIene måler signal innenfor identiske områder i hvert kjørefelt. Inkluder ROIer fra et ubrukt kjørefelt som skal brukes som emner.Bruk analyser, verktøy, ROI Manager, Legg til kommandoer i bildeprogramvaren, velg alle ROIene som tegnes på PEI-celluloseplaten. Bruk nå kommandoene Analyser, Angi målinger, Mål for å kvantifisere signalintensiteten i hver avkastning og eksportere målene som et spreadsheeet. Trekk tomme avkastningsverdier fra eksperimentelle signaler i regnearket.Konvertering av dataene til prosent guanosine-tetrafosfatsyntet er avgjørende, fordi det sikrer at datasett samlet på forskjellige dager med forskjellige grupper av protein eller forskjellig gamma P32 ATP er konsistente og kan samles for statistisk rigor. Denne tegneserien demonstrerer hvordan områder av interesse brukes til å definere et kjørefelt som inneholder det totale radioaktive signalet i en prøve og komponenten radioaktive ATP og guanosine tetrafosfat regioner av interesse. ATP- og guanosinttrafosfatsignaler normaliseres til det totale signalet i stedet for å rapportere de absolutte verdiene fordi pipetteringsfeil eller forfall av det radioaktive substratet kan påvirke det totale signalet i prøven, men påvirker ikke enzymaktivitet.Vist her er en faktisk TLC plate av en reaksjon utført ved hjelp av renset C.difficile RSH. En kontrollreaksjon som ikke inneholder noe protein tillater kvantifisering av ukasert ATP hydrolyse, mens et tomt kjørefelt gir nøyaktig signalkvantifisering. I ATP- og guanosine-tetrafosfatflekkene overfører enzymet det radioaktive fosfatet fra ATP-substrat til BNP-forløperen, noe som skaper radioaktiv guanosintetrafosfat.Dette bekrefter at den antatte guanosin tetrafosfatsyntetase fra C.difficile er et aktivt enzym. Ved å prøve reaksjonen med intervaller, kan fremdriften observeres. Her observeres råsignalet på hvert tidspunkt.ATP avtar og guanosin tetrafosfat øker. Vist her er de normaliserte dataene. Feilfeltene er mye mindre fordi normalisering står for eventuelle pipetteringsfeil.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å være forsiktig så du ikke riper harpiksen på TLC-platen, da dette kan forstyrre løsemiddelmigrasjon. Dette er en svært tilgjengelig teknikk med enkel dataanalyse som raskt kan gi robust kvantifisering av enzymaktivitet. Vi har brukt den til å bekrefte at Clostridium difficile syntetiserer guanosine tetrafosfat, som aldri tidligere har blitt rapportert.Ikke glem at det å arbeide med radioaktivitet kan være ekstremt farlig, og du må følge institusjonens regler for lagring og bruk av radioaktivt materiale mens du utfører denne prosedyren. Denne metoden kan gi innsikt i guanosin tetrafosfatsyntese, men den kan også brukes på andre fosfotransferreaksjoner, inkludert proteinkinaseaktivitet og syklisk diguanylatsyntese.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Måling av Faktor V aktivitet i Human Plasma Ved hjelp av en Microplate koagulasjon Assay

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spytt, spyttkjertel, og Hemolymph Collection fra Ixodes Scapularis Flått

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Dyrking og Vedlikehold<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; I et anaerobt miljø

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Introduksjon Kokulturanalyse for å vurdere patogenindusert nøytrofil transepiteriemigrasjon

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification fra intracellulært Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone behandlet musemodell for klinisk relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

En protokoll for å karakterisere de morfologiske endringene av<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Som svar på antibiotisk behandling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...