Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

Эта работа финансировалась NIAID 1K22AI118929-01. EBP была поддержана летом исследовательский грант программы стипендий от управлением исследований в университете старого Доминиона, Норфолк, Виргиния, США.

1. индуцибельной гиперэкспрессия белка, гистидин тегами
<ol><li>Усилить rsh от C. difficile R20291 геномной ДНК.<ol>
<li>Используйте высококачественный полимеразы и следуйте инструкциям производителя.</li>
		<li>Усилить C. difficile rsh с помощью грунтовки rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) и rsh_R ...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

Здесь мы приводим очистки его меткой RSH от C. difficile и представит метод количественной оценки деятельности с использованием хроматографии radiolabeled тонким слоем. Этот метод использовался ранее для оценки активности ферментов циклазы diguanylate C. difficile, а также синтетаза ppGpp (p), циклазы ?...

Киназы и pyrophosphokinase (или diphospho киназы) ферментов передать фосфатов из нуклеотидов трифосфата (NTP) прекурсоров молекулы субстрата. Подложки могут включать другие нуклеотиды, аминокислоты или белки, углеводы и липиды1. Bioinformatic анализы иногда можно предсказать фермента родственных субстрата или подложек, основанный на схожести с характеризуется ферментов, но по-прежнему необходима экспериментальная проверка. Аналогичным образом сходство фермент для его substrate(s) и скорость, с которой она катализирует реакцию люминофор передача и последствия сопутствующих факторов, ингибиторы, или другие фермента эффекторы должны быть определены экспериментально. Чтобы избежать истощение АТФ прекурсора других АТФ потребителями ферменты, присутствующие в цитоплазмой бактериальное, анализов количественных деятельности требуют очищенный протеин.
Очищение протеина хромотографией сродства металла тщательно охваченных литература2,3. Гистидин теги, состоящий из шести последовательных гистидина остатков, приложил к N - или C-конечная рекомбинантных белков позволяют быстрое очищение метал близость хроматографии4,5,6. Эти последовательности являются небольшими по сравнению с белками, они изменить и обычно имеют минимальное влияние на функции белка, хотя они могут иногда изменять стабильности белок фермента кинетики7,8. Гистидин теги в N - и C-Термини же протеина могут иметь различные эффекты, которые трудно предсказать, не зная структуры белка в вопросе. Гистидин теги обычно включаются во время клонирования рекомбинантных белков путем разработки грунты, которые кодируют шесть гистидина остатков, либо сразу 3' для начала кодон ГПТ или сразу 5' к стоп-кодон открытом чтения кадра. После усиления hexahistidine содержащие ген лигируют в вектор под контролем промотора индуцибельной и выразил, обычно в лаборатории штамм E. coli. Рекомбинация белок затем могут быть изолированы на близость смол, содержащих иммобилизованные двухвалентной катионов (обычно никель или кобальта)9. Загрязняя родной метал связывающих белков могут быть удалены путем титрования с имидазола, которое конкурсно вытесняет связанный протеин2. Наконец целевого белка этого eluted из столбца с более высокими концентрациями имидазола. Существует несколько коммерческих источников для иммобилизованных катиона металла смолы, и производители предоставляют рекомендации для буфера условий и концентрации имидазола. После элюции белка могут быть проанализирован натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE), dialyzed или сразу же использоваться в функциональных анализов.
Существует несколько способов косвенно контролировать активность протеинкиназы, связывая Бонд гидролиз АТФ фосфат второй реакции, которая выпускает или возбуждает Флюорофор или генерирует хемилюминесценции, но эти реакции имеют несколько движущихся частей и может быть технически сложных10. Наиболее простым способом конкретно измерить активность люминофор передача является непосредственно контролировать передачу radiolabeled фосфатной группы из коммерчески доступных γ -32-P предшественником NTP-radiolabeled субстрата11 , 12 , 13. смеси radiolabeled субстратов и продуктов могут быть разделены и количественно методом хроматографии (ТСХ) тонким слоем. TLC использует дифференциального мобильность растворенных веществ в данного растворителя, позволяя растворителя (жидкой фазы) для переноса капиллярность по всей поверхности (твердой фазы), после чего смесь растворов был адсорбированных14. Растворенных веществ, которые являются небольшими и/или отсутствие благоприятных взаимодействия с твердой фазы будет переносить большие расстояния от их первоначального расположения чем растворенных веществ с более высокой молекулярной массой или большой работоспособностью для тела. Для изучения люминофор передача фосфат постановление увеличить молекулярный вес молекул они добавляются и добавить отрицательный заряд ионных кислой или нейтральной рН11,12,14. Это снижает их мобильности на базовой поверхности, например Пей целлюлозы. Когда в кислой калия фосфатного буфера, смеси моно-, ди-, три-, тетра- и pentaphosphate видов могут быть легко разделены на ОПЭ целлюлозы, позволяя количественная оценка каждого вида (рис. 2, рис. 3). Такие анализы могут быть выполнены с помощью lysates клетки содержащие фермент интерес, но это включает в себя потенциал для деятельности других киназы, фосфатаз и общие ATPases к разрушающим субстрат или продукт. Для оценки количественных в vitro активность фермента необходимо очистить фермента интерес.
Гуанозина tetraphosphate (ppGpp) и pentaphosphate (pppGpp) гуанозина являются рибонуклеотид сигнальные молекулы, образованные передачи пирофосфат группа от прекурсор аденозинтрифосфатом (АТФ), соответственно, гуанозина дифосфат (ВВП) или гуанозина субстрата tetraphosphate (GTP)15. Эти сигналы одной рибонуклеотид, известные как ppGpp (p), посредником клетки широкий ответ экологического стресса, известный как строгие ответ в различных видов бактериальных,1516. Два сохранившихся классы ферментов катализируют образование (p) ppGpp15,17 Rel/Spo гомолога (RSH) ферментов являются «долго» бифункциональных (p) ppGpp синтетаза/гидролаз, назван в честь их сходство с реальными и SpoT (p) ppGpp метаболических ферменты от кишечной палочки , которые содержат синтетаза, гидролазы и нормативной областях, в то время как малые alarmone синтетазы (SAS) ферменты являются короткие монофункциональный синтетаз исключительно в грамм положительных бактерий15, 17 , 18. спорообразующих грамположительные бактерии Clostridium difficile кодирует предполагаемого RSH и SAS генов19. Здесь мы представляем первоначальный деятельность анализов, которые подтверждают, что фермент RSH C. difficile является каталитически активных синтетаза ppGpp (p).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

Киназы и pyrophosphokinase ферменты передать фосфат гамма или бета гамма пирофосфат остаток от нуклеотида трифосфата прекурсоров субстратов для создания фосфорилированных продуктов. Использование γ -32- P пометкой прекурсоры NTP позволяет одновременный мониторинг использования и продукта формирования субстрата, рентгенография. Хроматографии (ТСХ) тонким слоем на пластины целлюлозы позволяет быстрое разделение и чувствительных количественной оценки субстрата и продукта. Мы представляем метод для использования тонкослойной хроматографии для анализа активности pyrophosphokinase очищенный синтетаза ppGpp (p). Этот метод использовался ранее для характеризовать деятельность циклических нуклеотидов и динуклеотид синтетаз и широко подходит для характеризующие активность фермента, который гидролизует Бонд трифосфата нуклеотидов или передает терминал фосфат с донором фосфатной к другой молекуле.

Мы представляем метод очищения сродства синтетаза ppGpp (p) с Clostridium difficile и оценки ее Ферментативная активность. Рисунок 1 демонстрирует очищение протеина, достигнутые металла аффинной хроматографии. Вторая фракция элюции (E2) от этого очищения был dialy...

Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Здесь мы описываем метод для очистки гистидин меткой pyrophosphokinase ферментов и используя тонкий слой хроматографии радиоизотопами субстратов и продуктов для анализа для ферментативной активности в пробирке. Assay активность фермента широко применима к любой киназы, циклазы нуклеотидов или реакции фосфора передача, механизм которого включает нуклеотидов трифосфата гидролиза.

Очистка и пробирного активность In Vitro для ppGpp (p) синтетаза с Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о ферментах фосфотрансфера, включая специфичность ферментного субстрата и реакцию кинетики. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет быстро сбор нескольких наборов данных, которые являются очень последовательными, что позволяет статистически надежную количественную оценку активности ферментов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку обнаружение реакций на пластинах TLC и количественная оценка радиоактивных видов в реакциях гораздо легче продемонстрировать, чем объяснить.В дополнение к Astha, демонстрируя процедуру будет Азия Poudel, другой аспирант из моей лаборатории. Начните этот протокол с неудобовательного переэкспрессии белка с гистидином, как описано в текстовом протоколе. Подготовка одного миллилитра никеля нитрилоацетической кислоты смолы в гравитационном столбе для очистки белка.За день до использования, уравночные столбец ночь на четыре градуса по Цельсию с двумя миллилитров эквилибрации буфера. На следующий день довести столбец от четырех градусов по Цельсию до комнатной температуры до загрузки очищенного лизата и дайте ему постоять около двух-трех часов. Затем повторное приостановление гранул в буфере лиза.Sonicate клетки на льду в течение 10 раз 10-секундных интервалов, останавливаясь 30 секунд между импульсами. Уточните лизат центрифугой при 3, 080 раз г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия с помощью микроцентрифуга. Подготовь уточненный лизат с равными объемами буфера лиза, затем примените готовый, уточненный лизат к столбецу и соберите протекаемый поток.Повторное приколоть уточненный лисировать поток через столбец и собирать вторичный поток через. Затем вымойте столбец с пятью миллилитров мыть буфера один и собирать поток через. Вымойте столбец снова с пятью миллилитров мыть буфера два и собирать поток через.Теперь примените два миллилитров буфера элюции. Соберите поток через две фракции по одному миллилитру каждый. Во время очистки белка включение хлорида магния в буферы очистки, изменение протокола производителя, имеет важное значение для энзиматической активности.Чтобы качественно оценить очистку белка SDS-PAGE, запустите 20 микролитровых алицитов всех фракций столбца на 4%stacking, 10%бегущий полиакриламидный гель в течение 60 минут при 170 вольтах. Пятно гель с 0,1%Coomassie синий при комнатной температуре в течение пяти часов, качаясь мягко на скамейке рокер. Затем destain гель в 40%метанол-10%ледниковой уксусной кислоты ночь при комнатной температуре, качаясь на скамейке рокер.Диализ eluted фракции два против диализа буфера на 200:1 соотношение с использованием одного миллилитров диализа устройство с 20-килодальтон молекулярного веса отсечения ночь на четыре градуса по Цельсию. Определите концентрацию диализированного образца белка, измерив абсорбанс на 280 нанометров и используя рассчитанный коэффициент вымирания моляров. Храните 100-микролитровые алициты образца диализируемого белка при температуре минус 80 градусов по Цельсию до его использования.Перед выполнением реакции, подготовить PEI целлюлозы тонкого слоя хроматографии пластин, мыть их в деионизированной воде. Поместите пластины в стеклянную камеру с двойной дистиллированной водой на глубину около 0,5 сантиметра. После того, как вода мигрирует в верхней части пластины, принести пластины из стеклянной камеры и оставить на скамейке стойки высохнуть на ночь.Отметь высушенные пластины в двух сантиметрах от одного края мягким карандашом, чтобы указать, где образцы будут применяться для TLC. Для двухмиберных образцов применяют образцы не менее чем на один сантиметр друг от друга. При планировании экспериментов, всегда оставляйте одно место на каждой пластине неиспользованными, чтобы служить пустой полосой для количественной оценки выборки.Для выполнения анализа активности ферментов, подготовить индивидуальные реакции с использованием гамма P32 АТФ, как описано в текстовом протоколе. Добавьте RSH после смешивания других компонентов, так как добавление RSH в нуклеотидсодержащую смесь инициирует анализ энзиматической активности. Для контроля гидролиза АТФ от загрязняя активность нуклеазы, собрать 10-микролитер реакции, не содержащие белка и инкубировать его параллельно.Обнаружить двухмиберные образцы на T равны нулю и в конце эксперимента, чтобы убедиться, что АТФ не был гидролизовается в отсутствие белка. Сразу же после добавления RSH, удалить два микролитера и пятно его на помечены PEI-целлюлозной пластины, как T равна нулевой минуте образца. Инкубировать реакцию при 37 градусах по Цельсию, удаляя двухмиллерные алициты в нужных точках времени.После того, как все алициты были собраны, выполните тонкослойную хроматографию, заполнив хроматографическую камеру 1,5-молярным монобазным фосфатом калия на глубину 0,5 сантиметра. Погрузите нижний край пластины в растворитель и позвольте растворителю мигрировать в верхнюю часть пластины в течение примерно 90 минут. Снимите пластину с хроматографического бака и поместите ее на скамейку сушилки для сушки воздуха на ночь.После того, как пластина высохнет, оберните пластину в пластиковую пленку, чтобы избежать передачи радиоактивного материала на кассету с изображением и проанализируйте с помощью ауторадиографии. Разоблачить пластину PEI-целлюлозы, содержащую разделенные реакции на кассету фосфоримагера в течение четырех часов при комнатной температуре. После экспозиции, изображение кассеты на фосфоримагер.Используя программное обеспечение для визуализации с графическим пользовательским интерфейсом, нарисуйте области интереса или ИП, сначала выбрав Draw a Rectangle, затем используйте мышь, чтобы нарисовать прямоугольные ИП вокруг одной целой полосы движения, а также точки АТФ и гуанозина-тетрафосфата, содержащиеся в этой полосе. Используйте команды Select, Copy и Paste, чтобы нарисовать одинаковые ИИ в других полосах движения, чтобы гарантировать, что ИИ измеряют сигнал в одинаковых областях в каждой полосе движения. Включите ROIs из неиспользованной полосы, которая будет использоваться в качестве пробелов.Используя анализ, инструменты, roi Manager, Добавляйте команды программного обеспечения для визуализации, выберите все ИИ, нарисованные на пластине PEI-целлюлозы. Теперь используйте команды Analyze, Set Measurements, Measure для количественной оценки интенсивности сигнала в рамках каждой рентабельности инвестиций и экспорта измерений в виде спредов. В электронной таблице вычесть пустые значения рентабельности инвестиций из экспериментальных сигналов.Преобразование данных в процент гуанозин-тетрафосфат синтезированных имеет решающее значение, потому что это гарантирует, что наборы данных, собранные в разные дни с различными партиями белка или различных гамма P32 АТФ являются последовательными и могут быть объединились для статистической строгости. Эта карикатура демонстрирует, как регионы, представляющие интерес, используются для определения полосы, которая содержит общий радиоактивный сигнал в образце и компонент радиоактивных АТФ и гуанозин тетрафосфатных областях, представляющих интерес. Тетрафосфатные сигналы АТФ и гуанозина нормализуются до общего сигнала, а не сообщают абсолютные значения, поскольку ошибка трубопроводирования или распад радиоактивного субстрата может повлиять на общий сигнал в образце, но не повлиять на активность ферментов.Здесь показана фактическая пластина TLC реакции, выполненной с использованием очищенного C.difficile RSH. Контрольная реакция, не содержащая белка, позволяет количественно определить гидролиз АТФ без стечения атФ, в то время как пустая полоса позволяет точной количественной оценки сигнала. В точках АТФ и гуанозин-тетрафосфат фермент передает радиоактивный фосфат из субстрата АТФ в прекурсор ВВП, создавая радиоактивный тетрафосфат гуанозина.Это подтверждает, что если ставить гуанозин тетрафосфат синтетазы из C.difficile является активным ферментом. При отборе проб реакции с интервалами можно наблюдать прогресс. Здесь необработанный сигнал наблюдается в каждой точке времени.АТФ уменьшается, а тетрафосфат гуанозина увеличивается. Здесь показаны нормализованные данные. Бары ошибок гораздо меньше, потому что нормализация объясняет любую ошибку пипетки.При попытке этой процедуры, важно быть осторожным, чтобы не поцарапать смолу на пластине TLC, так как это может помешать миграции растворителя. Это очень доступный метод с простым анализом данных, который может быстро обеспечить надежную количественную оценку активности ферментов. Мы использовали его, чтобы подтвердить, что Clostridium difficile синтезирует тетрафосфат гуанозина, о котором ранее не сообщалось.Не забывайте, что работа с радиоактивностью может быть чрезвычайно опасной, и вы должны следовать правилам вашего учреждения для хранения и использования радиоактивных материалов при выполнении этой процедуры. Этот метод может дать представление о синтезе тетрафосфата гуанозина, но он также может быть применен к другим фосфатным реакциям, включая активность белка киназы и циклический синтез дигуанилатов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

В пробирке образование биопленки в 8-и палаты слайдов

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Измерение активности фактора V в плазме крови человека с помощью анализа микропланшетов коагуляции

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Культивирование и поддержка<em&gt; Clostridium несговорчивый</em&gt; В анаэробной среде

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay для оценки патогена индуцированной нейтрофил трансэпителиальной миграции

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

РНК Очистка от внутриклеточно Grown<em&gt; листерий</em&gt; В клетках макрофагальной

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Цефоперазон обработанных мышей Модель Клинически значимых<em&gt; Clostridium несговорчивый</em&gt; Штамм R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Протокол для характеристики морфологических изменений<em&gt; Сложный Clostridium</em&gt; В ответ на лечение антибиотиками

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...