Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

Detta arbete finansierades av NIAID 1K22AI118929-01. EBP stöddes av en sommar Fellowship Program forskningsanslag från Office av forskningen vid Old Dominion University, Norfolk, Virginia, USA.

1. inducerbara överuttryck av en histidin-taggade Protein
<ol><li>Förstärka rsh från C. difficile R20291 genomiskt DNA.<ol>
<li>Använd en HiFi-polymeras och följ tillverkarens anvisningar.</li>
		<li>Förstärka C. difficile rsh använder grundfärger rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) och rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), som introducerar en C-terminal hexahistidine tagg. Obs: De KpnI och PstI skär platser i...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

Här rapporterar vi rening av hans-taggade RSH från C. difficile och presenterar en metod för aktivitet kvantifiering med radiomärkt tunnskiktskromatografi. Denna metod har tidigare använts för att bedöma aktivitet diguanylate cyclase enzymer från C. difficile, samt (p) ppGpp kväveoxidsyntas, nukleotid cyclase, Kinas och fosfodiesteras enzymer från andra organismer11,12 ,13,<sup class="xref...

Kinas och pyrophosphokinase (eller uridin-Kinas) enzymer överföra fosfater från nukleotid adenosintrifosfat (NTP) prekursorer till substrat molekyler. Substratesna kan inkludera andra nukleotider, aminosyror eller protein, kolhydrater och lipider1. Bioinformatiska analyser kan ibland förutsäga ett enzym cognate substrat eller substrat baserat på likheten med kännetecknas enzymer, men experimentell validering är fortfarande nödvändig. Likaså frändskapet av ett enzym för dess substrate(s) och den hastighet som det katalyserar phosphor-överföring reaktionen, och effekterna av co-faktorer,-hämmare, eller andra enzym effektorer måste bestämmas experimentellt. För att undvika utarmning av ATP precursoren av andra ATP-krävande enzymer som förekommer i bakteriell cytoplasman, kräver kvantitativa aktivitet analyser renat protein.
Protein rening av metall affinitetskromatografi har täckts noga i litteratur2,3. Histidin tags bestående av sex på varandra följande histidin rester bifogas till N - eller C-terminus av ett rekombinant protein kan snabba rening av metall affinitet kromatografi4,5,6. Dessa sekvenser är små jämfört med de proteiner de ändra och vanligtvis har minimal inverkan på proteinfunktion, även om de ibland kan förändra protein stabilitet eller enzym kinetik7,8. Histidin taggar på N - och C-termini av samma protein kan ha olika effekter, som är svåra att förutsäga utan att känna till strukturen för proteinet som är i fråga. Histidin Taggar ingår vanligtvis under kloning av ett rekombinant protein genom att utforma primers som kodar sex histidin rester, antingen omedelbart 3' till den ATG start Codonen eller omedelbart 5' till den stop kodon av ramen öppen läsning. Efter förstärkning, är hexahistidine-innehållande genen sammanskrivna i en vektor under kontroll av en inducerbara arrangören och uttryckt, vanligtvis i ett laboratorium stam av E. coli. Rekombination proteinet kan sedan vara isolerad på en affinitet harts innehållande immobiliserade divalenta katjoner (vanligen nickel eller kobolt)9. Kontaminerande infödda metall-bindande proteiner kan avlägsnas genom titrering med Imidazol, som konkurrenskraftigt förflyttar bundna protein2. Slutligen elueras målproteinet från kolonnen med högre koncentrationer av Imidazol. Det finns flera kommersiella källor för immobiliserade metall ering hartser, och tillverkarna tillhandahåller rekommendationer för buffert villkor och Imidazol koncentrationer. Efter eluering, kan protein vara analyseras av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE), dialyseras eller används omedelbart i funktionella analyser.
Det finns flera metoder för att indirekt övervaka Kinas aktivitet av koppling ATP fosfat bond hydrolys till en andra reaktion som frigör eller retar en fluorophore eller genererar chemiluminescence, men dessa reaktioner har flera rörliga delar och kan vara logistiskt utmanande10. Det enklaste sättet att mäta specifikt phosphor-överföring verksamhet är att direkt övervaka överföring av en radioaktivt märkt fosfatgrupp från ett kommersiellt tillgängliga γ -32-P NTP föregångare till en icke-radioaktivt substrat11 , 12 , 13. blandningar av radiomärkt substrat och produkter kan separeras och kvantifieras genom tunnskiktskromatografi (TK). TLC använder tredjeparts koncentrationsfördelningen i ett givet lösningsmedel differentiell rörlighet genom att låta lösningsmedlet (flytande fas) migrera genom kapillärkraften över en yta (fast fas) som en blandning av koncentrationsfördelningen varit adsorberade14. Koncentrationsfördelningen som är små och/eller saknar gynnsamma interaktioner med den fasta fasen kommer att migrera längre avstånd från sin ursprungliga plats än koncentrationsfördelningen med högre molekylvikt eller stor frändskap för fast. För granskning av fosfor-överföring öka fosfat beståndsdelarna molekylvikten för molekyler de läggs till och Lägg till negativ jonisk laddning neutral eller sura pH11,12,14. Detta minskar deras rörlighet på en grundläggande yta såsom PEI-cellulosa. När utvecklat i sura kalium fosfatbuffert, kan blandningar av mono-, di-, tri-, tetra- och pentaphosphate arter lätt separeras på PEI-cellulosa, möjliggör kvantifiering av varje art (figur 2, figur 3). Sådana analyser kan utföras med cell lysates som innehåller enzymet av intresse, men detta inkluderar potentialen för aktiviteten av andra kinaser, fosfataser och allmänna ATPases att tömma de substrat eller produkt. För en kvantitativ in vitro- bedömning av enzymaktivitet är det nödvändigt att rena enzymet av intresse.
Guanosinmonofosfat tetraphosphate (ppGpp) och guanosinmonofosfat pentaphosphate (pppGpp) är ribonucleotid signaling molekyler som bildas av överföring av en pyrofosfat grupp från en adenosintrifosfat (ATP) föregångare till, respektive en guanosinmonofosfat diphosphate (BNP) eller guanosinmonofosfat tetraphosphate (GTP) substrat15. Dessa enda ribonucleotid signaler, gemensamt benämnda (p) ppGpp, förmedlar ett cell-wide svar på miljömässig stress kallas den stränga svaren i olika bakteriearter15,16. Två bevarade klasser av enzym katalyserar bildandet (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymer är 'lång' bifunktionell (p) ppGpp kväveoxidsyntas/Hydrolaser uppkallad efter deras likhet till förbindelser och plats (p) ppGpp metabola enzymer från Escherichia coli som innehåller kväveoxidsyntas, hydrolas och reglerande domäner, medan små alarmone kväveoxidsyntas (SAS) enzymer är kort monofunktionella synthetases hittade exklusivt i Gram positiva bakterier15, 17 , 18. sporbildande grampositiva bakterien Clostridium difficile kodar förmodad RSH och SAS gener19. Här presenterar vi inledande aktivitet-analyser som bekräftar att enzymet C. difficile RSH är en katalytiskt aktiv ppGpp kväveoxidsyntas (p).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

Kinas och pyrophosphokinase enzymer överför gamma fosfatet eller den beta-gamma pyrofosfat biexponentiellt från nukleotid trifosfat prekursorer till substrat att skapa fosforyleras produkter. Användning av γ -32- P märkt NTP prekursorer tillåter samtidig övervakning av substrat utnyttjande och produkten bildandet av radiografi. Tunnskiktskromatografi (TK) på cellulosa tallrikar tillåter snabb separation och känsliga kvantifiering av substrat och produkt. Vi presenterar en metod för att utnyttja den tunnskiktskromatografi för att assay pyrophosphokinase aktiviteten av en renad ppGpp kväveoxidsyntas (p). Denna metod har tidigare använts för att karakterisera aktiviteten av cykliska nukleotid och dinukleotid synthetases och passar i stort sett kännetecknar aktiviteten hos ett enzym som hydrolyserar en nukleotid trifosfat obligation eller överför en terminal fosfat från en fosfat donator till en annan molekyl.

Vi presenterar en metod för affinitet rening av en (p) ppGpp kväveoxidsyntas från Clostridium difficile och bedömningen av dess enzymatiska aktivitet. Figur 1 visar protein rening uppnås genom metall affinitetskromatografi. Den andra eluering (E2) fraktionen från denna rening var dialyseras och används för enzymatisk aktivitet haltbestämning. Figur 2 Detaljer nödvändiga åtgärder för att förbereda och genom...

Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Här, beskriver vi en metod för rening av histidin-taggade pyrophosphokinase enzymer och utnyttja tunnskiktskromatografi av radioaktivt märkt substrat och produkter till assay för enzymatisk aktivitet in vitro. Enzym aktivitet analysen är i stort sett tillämpliga till Kinas, nukleotid cyclase eller fosfor-överföring reaktion vars mekanism inkluderar nukleotid trifosfat hydrolys.

En rening och In Vitro aktivitet Assay för en (p) ppGpp kväveoxidsyntas från Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor om fosfotransfer enzymer inklusive enzym substrat specificitet och reaktion kinetik. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör snabb insamling av flera datamängder som är mycket konsekventa, vilket möjliggör statistiskt robust kvantifiering av enzymaktivitet. Visuell demonstration av denna metod är avgörande eftersom spotting reaktionerna på TLC plattorna och kvantifiera de radioaktiva arterna i reaktionerna är mycket lättare att visa än att förklara.Förutom Astha, visar förfarandet kommer att Vara Asia Poudel, en annan doktorand från mitt laboratorium. Börja detta protokoll med inducible överuttryck av en histidin-taggade protein som beskrivs i textprotokollet. Förbered en milliliter nickelnitloättiksyraharts i en gravitationskolumn för att rena proteinet.Dagen före användning, jämvikt kolumnen över natten vid fyra grader Celsius med två milliliter av jämvikt buffert. Efter dagen kommer med kolonnen från fyra grader celsiust till rumstemperatur, för att ladda den klargj橬一j lysateen och l5At den stå för ungefärligt två till tre timmar. Sedan resuspend pelleten i lysbufferten.Sonikera cellerna på is i 10 gånger 10-sekunders intervaller, pausa 30 sekunder mellan pulser. Klargöra lysate genom centrifugering vid 3, 080 gånger g i 30 minuter vid fyra grader Celsius med hjälp av en microcentrfuge. Förbered den klarstlade lysate med lika volymer av lysbuffert, applicera sedan den prepped, förtydligade lysate till kolonnen och samla in genomflödet.Återapplicera den klargj橬一j lysate flöde-through till kolonnen och samla det sekundära flödet-through. Tvätta sedan kolonnen med fem milliliter tvättbuffert en och samla in genomflödet. Tvätta kolonnen igen med fem milliliter tvättbuffert två och samla in genomflödet.Nu gäller två milliliter elueringsbuffert. Samla in genomflöde i två bråkdelar av en milliliter vardera. Under proteinrening är det viktigt att ta med magnesiumklorid i reningsbuffertarna, en modifiering av tillverkarens protokoll, för enzymatisk aktivitet.För att kvalitativt bedöma proteinrening genom SDS-PAGE, kör 20 microliter alikvoter av alla kolonnfraktioner på en 4%stapling, 10%löpande polyakrylamidgel i 60 minuter vid 170 volt. Fläck gelen med 0,1%Coomassie blå i rumstemperatur i fem timmar, gunga försiktigt på en bänkskiva rocker. Sedan destain gelen i 40%metanol-10%glacial ättiksyra över natten vid rumstemperatur, gunga på bänkskivan vipp.Dialyze den eluted fraktionen två mot dialys buffert på en 200:1 förhållande med hjälp av en en-milliliter dialys enhet med en 20-kilodalton molekylär vikt cutoff över natten vid fyra grader Celsius. Bestäm koncentrationen av dialyserat proteinprov genom att mäta absorbans vid 280 nanometer och med hjälp av den beräknade molarutdöetisk utdöendet koefficienten. Förvara 100-mikroliter alikvoter av det dialyserade proteinprovet vid minus 80 grader Celsius tills användning.Innan du utför reaktionen, förbereda PEI cellulosa tunt lager kromatografi plattor genom att tvätta dem i avjoniserat vatten. Placera plattorna i en glaskammare med dubbeldestillerat vatten till ett djup av cirka 0,5 centimeter. Efter att vattnet att migrera till toppen av plattan, ta plattorna ur glaskammaren och låt på en bänkskiva rack torka över natten.Markera de torkade plattorna två centimeter från en kant med en mjuk penna för att ange var proverna kommer att appliceras för TLC. För två-mikroliterprover, applicera prover som inte är mindre än en centimeter från varandra. När du planerar experiment, alltid lämna en plats på varje platta oanvända för att fungera som ett tomt körfält för prov kvantifiering.För att utföra enzymet aktivitetsanalys, förbereda enskilda reaktioner med hjälp av gamma P32 ATP som beskrivs i textprotokollet. Lägg till RSH efter att de andra komponenterna har blandats, eftersom tillsats av RSH till den nukleotidhaltiga mixen initierar den enzymatiska aktivitetsanalysen. För att kontrollera för ATP hydrolys från förorenande nukleasaktivitet, montera en 10-mikroliter reaktion som innehåller inget protein och inkubera den parallellt.Spot två-microliter prover på T lika noll och i slutet av experimentet för att säkerställa att ATP inte hydrolyserade i avsaknad av protein. Omedelbart vid tillsats av RSH, ta bort två mikroliter och pricka den på den märkta PEI-cellulosaplattan då T är lika med no minutprov. Inkubera reaktionen vid 37 grader Celsius, ta bort två-microliter alikvoter vid önskade tidpunkter.Efter alla alikvoter har samlats, utföra tunt lager kromatografi genom att fylla kromatografi kammaren med 1,5-molar monobasiska kaliumfosfat till ett djup av 0,5 centimeter. Sänk ned plattans nederkant i lösningsmedel och låt lösningsmedlet migrera till toppen av plattan under cirka 90 minuter. Ta bort plattan från kromatografi tanken och placera den på en bänkskiva torkställning att lufttorka över natten.Efter plattan är torr, linda plattan i plastfilm för att undvika överföring av radioaktivt material till bildåtergivning kassetten och analysera genom autoradiografi. Exponera PEI-cellulosaplattan som innehåller avskilda reaktioner på en fosforbildskasett i fyra timmar i rumstemperatur. Efter exponering, bild kassetten på en fosforbildare.Använda bildhanteringsprogram med ett grafiskt användargränssnitt, dra regioner av intresse eller ROIs genom att först välja Rita en rektangel, sedan använda musen för att dra rektangulära ROIs runt en hel körfält och ATP och guanosin-tetrafosfat fläckar som finns inom den körfält. Använd kommandona Välj, Kopiera och Klistra in för att rita identiska ROIs inom de andra körfälten för att säkerställa att ROIs är mätsignal inom identiska områden i varje körfält. Inkludera ROIs från ett oanvänt körfält som ska användas som tomrum.Med hjälp av analysera, verktyg, ROI Manager, Lägg till kommandon av bildhanteringsprogram, välj alla de ROIs som ritas på PEI-cellulosa plattan. Använd nu kommandona Analysera, Ange mått, Mät för att kvantifiera signalintensiteten inom varje ROI och exportera måtten som en spreadsheeet. I kalkylarket subtraherar du tomma ROI-värden från experimentella signaler.Konvertera data till procent guanosin-tetrafosfat synthetiserade är avgörande, eftersom det säkerställer att datamängder som samlats in på olika dagar med olika partier av protein eller olika gamma P32 ATP är konsekventa och kan poolas för statistiska stringens. Denna karikatyr visar hur regioner av intresse används för att definiera ett körfält som innehåller den totala radioaktiva signalen i ett prov och den komponent radioaktiva ATP och guanosin tetrafosfat regioner av intresse. ATP- och guanosintetrafosfatsignaler normaliseras till den totala signalen i stället för att rapportera de absoluta värdena eftersom pipetteringsfel eller sönderfall av det radioaktiva substratet kan påverka den totala signalen i provet men inte påverkar enzymaktiviteten.Visas här är en faktisk TLC platta av en reaktion som utförs med hjälp av renad C.difficile RSH. En kontrollreaktion som innehåller inget protein tillåter kvantifiering av uncatalysed ATP hydrolys medan ett blankt körfält tillåter exakt signalkvantifiering. I ATP och guanosin-tetrafosfat fläckar, enzym överför radioaktivt fosfat från ATP substrat till BNP föregångare, skapa radioaktivt guanosin tetrafosfat.Detta bekräftar att den förmodade guanosin tetrafosfatsyntetas från C.difficile är ett aktivt enzym. Genom att provtagningen av reaktionen med intervall kan förloppet observeras. Här observeras det rått signalerar på varje tid pekar.ATP minskar och guanosintetrafosfat ökar. Visas här är den normaliserade data. Felstaplarna är mycket mindre eftersom normaliseringskonton för eventuella pipetteringsfel.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att vara noga med att inte repa harts på TLC-plattan, eftersom detta kan störa lösningsmedel migration. Detta är en mycket tillgänglig teknik med enkel dataanalys som snabbt kan ge robust kvantifiering av enzymaktivitet. Vi har använt det för att bekräfta att Clostridium difficile syntetiserar guanosin tetrafosfat, som aldrig tidigare har rapporterats.Glöm inte att det kan vara extremt riskfyllt att arbeta med radioaktivitet och du måste följa din institutions regler för lagring och användning av radioaktiva material när du utför detta förfarande. Denna metod kan ge insikt i guanosin tetrafosfat syntes men det kan också tillämpas på andra fosfotransfer reaktioner, inklusive protein kinas aktivitet och cykliska diguanylat syntes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilm bildning i en 8-brunnars avdelningen Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Mätning av Faktor V aktivitet i human plasma Med hjälp av en analys Microplate Koagulation

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliv, spottkörtel och hemolymfa Collection från Ixodes scapularis fästingar

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Odling och underhålla<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; I en anaerob miljö

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Kokulturanalys för att bedöma patogeninducerad neutrofil transeptelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Rening från Intracellulärt Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazon behandlade musmodell av kliniskt relevanta<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Stam R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Ett protokoll för att karaktärisera de morfologiska förändringarna av<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Som svar på antibiotisk behandling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...