Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

Bu eser NIAID 1K22AI118929-01 tarafından finanse edildi. EBP Old Dominion University, Norfolk, Virginia, ABD araştırma Office bir yaz Araştırma Bursu Programı hibe tarafından desteklenmiştir.

1. histidin öğesini protein indüklenebilir Overexpression
<ol><li>Rsh C. difficile R20291 genomik DNA dan yükseltmek.<ol>
<li>Yüksek sadakat polimeraz kullanın ve üreticinin yönergeleri izleyin.</li>
		<li>C. difficile rsh primerler kullanılarak yükseltmek rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) ve rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), C-terminal hexahistidine etiket tanıtır. Not: KpnI ve astar sekanslarında si...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

Burada onun öğesini RSH dan C. difficile arıtma raporu ve radiolabeled ince tabaka Kromatografi kullanarak faaliyet miktar için bir yöntem mevcut. Bu yöntem daha önce diguanylate cyclase enzim C. difficile, yanı sıra (p) ppGpp sentetaz, nükleotit cyclase, kinaz ve diğer organizmalar11,12 fosfodiesteraz enzim etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır ,13,21</s...

Enzimler kinaz ve pyrophosphokinase (veya diphospho-kinaz) fosfatlar substrat moleküllerine nükleotit trifosfat (NTP) öncüleri aktarmak. Yüzeyler diğer nükleotit, amino asitler veya proteinler, karbonhidratlar ve lipidler1içerebilir. Bioinformatic analizleri bazen bir enzim soydaş substrat veya yüzeylerde karakterize enzimler benzerlik dayalı tahmin edebilirsiniz, ancak deneysel doğrulama hala gereklidir. Benzer şekilde, onun substrate(s) ve hangi fosfor-devret tepki tromboksan oranı için bir enzim ilgi ve etkileri etkenler, inhibitörleri veya diğer enzim effectors deneysel olarak belirlenmelidir. Bakteriyel sitoplazma mevcut diğer ATP tüketen enzimler tarafından ATP habercisi tükenmesi önlemek için saf protein nicel etkinlik deneyleri gerektirir.
Protein Saflaştırma metal benzeşme Kromatografi tarafından iyice edebiyat2,3' te karşılanmıştır. N - veya C-terminus için Rekombinant protein eklenmiş altı ardışık histidin kalıntıları oluşan histidin Tag hızlı arıtma metal benzeşme Kromatografi4,5,6tarafından izin verir. Bu DNA dizileri bazen protein istikrar ve/veya enzim kinetiği7,8değiştirebilirsiniz, ancak onlar değiştirmek ve genellikle protein işlevi, en az bir etkisi proteinler karşılaştırıldığında küçüktür. Histidin Etiketler, N - ve C-termini aynı protein söz konusu protein yapısını bilmeden tahmin etmek zor farklı etkileri olabilir. Histidin Etiketler genellikle bir Rekombinant protein altı histidin kalıntıları, ya hemen kodlamak astar tasarlayarak 3' ATG başlama kodonu veya hemen 5'-kodonu açık okuma çerçevesi, klonlama sırasında dahil edilmiştir. Amplifikasyon sonra hexahistidine içeren gen indüklenebilir bir organizatörü kontrol altında bir vektör içine bakmaksızın ve ifade, genellikle E. colibir laboratuvar suşu. Rekombinasyon protein sonra immobilize divalent katyonlar (genellikle nikel veya kobalt)9içeren bir benzeşme reçine izole. Yerel metal bağlanıcı proteinler kirletici rekabetçi ilişkili protein2yerinden imidazole ile titrasyon tarafından kaldırılabilir. Son olarak, hedef protein imidazole daha yüksek konsantrasyonları ile sütun eluted. Çeşitli ticari kaynaklar için immobilize metal katyon reçineler ve üreticileri imidazole konsantrasyonları ve tampon koşulları için öneriler sağlar. Elüsyon sonra protein Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından analiz, diyaliz veya olabilir hemen içinde işlevsel testleri kullanılır.
Dolaylı olarak serbest bırakır veya Kemiluminesan oluşturur veya bir fluorophore heyecanlandıran ikinci bir tepki ATP fosfat bağı hidroliz kaplin tarafından kinaz etkinliğini izlemek için birkaç yöntem vardır, ama bu tepkiler birden çok hareketli parçalar ve -ebilmek var olmak Lojistik10zor. Özellikle fosfor-devret etkinliği ölçmek için en kolay yolu doğrudan radiolabeled fosfat grubu transferi bir piyasada bulunan γ -32-P izlemektir bir sigara radiolabeled substrat11 NTP habercisi , 12 , 13. karışımları radiolabeled yüzeylerde ve ürünleri ayrılmış ve ince tabaka Kromatografi (TLC) sayılabilir. TLC solutes verilen bir çözücü içinde fark hareketliliğini kılcal eylem tarafından üzerine adsorbe14solutes karışımı olmuştur bir yüzey üzerinde (katı faz) geçirmek çözücü (sıvı faz) izin vererek kullanır. Küçük ve/veya eksikliği katı faz ile olumlu etkileşimler solutes göç solutes daha yüksek moleküler ağırlık veya masif büyük benzeşim ile daha ilk konumlarından daha uzun mesafeler. Fosfor-devret sınavına fosfat moieties eklenir ve nötr veya asidik pH11,12,14, negatif iyon yük eklemek molekül molekül ağırlığı artırmak. Bu onların hareketlilik PEI-selüloz gibi temel bir yüzeyi azaltır. Asidik potasyum fosfat arabellekte zaman, karışımları mono-, di-, tri-, tetra-ve pentaphosphate türler PEI-selüloz üzerinde miktar her türün (Şekil 2, Şekil 3) izin, kolayca ayrılabilir. Faiz enzim içeren hücre lysates kullanarak bu tür deneyleri yapılabilir ama bu substrat ve/veya ürün tüketmek için diğer kinaz, fosfatazlar ve genel ATPases aktivite olasılığını içerir. Enzim aktivitesinin kantitatif vitro değerlendirilmesi için faiz enzim arındırmak gereklidir.
Guanozin tetrafosfat (ppGpp) ve guanozin pentaphosphate (pppGpp) olan, sırasıyla, bir pirofosfat havalesi ile oluşan moleküller grup bir adenozin trifosfat (ATP) öncül bir guanozin nükleotittir (GSYİH) sinyal ribonucleotide veya guanozin tetrafosfat (GTP) substrat15. Topluca (p) ppGpp bilinen bu tek ribonucleotide sinyaller, çevresel stres farklı bakteri türleri15,16katı yanıt olarak bilinen bir hücre genelinde yanıt aracılık. Enzimlerin iki korunmuş sınıf katalizler oluşumu (p) ppGpp15,17 ' Rel/DPT homolog (RSH) enzimlerdir 'uzun' bifonksiyonel (p) ppGpp sentetaz/Hidrolazlar onların benzerlik Real ve SpoT (p) adlı ppGpp metabolik küçük alarmone sentetaz (SAS) enzimler sadece Gram pozitif bakteri15' te, bulunan kısa monofunctional sentetaz iken sentetaz, hidrolaz ve Düzenleyici etki alanlarını içeren enzimler Escherichia coli üzerinden 17 , 18. spor oluşturmayan gram-pozitif bakteri Clostridium difficile sözde RSH ve SA'ları genler19kodlar. Burada, C. difficile RSH enzim catalytically etkin (p) ppGpp sentetaz olduğundan emin olun ilk etkinlik deneyleri mevcut.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

Enzimler kinaz ve pyrophosphokinase gama fosfat veya beta-gamma pirofosfat yan yüzeyler için fosforile ürünler üretebilmek için nükleotit trifosfat öncüleri aktarın. Kullanımı γ -32- P NTP öncüleri etiketli eşzamanlı substrat kullanımı ve ürün oluşumu radyografi tarafından izleme sağlar. Selüloz tabaklarda ince tabaka Kromatografi (TLC) hızlı ayırma ve substrat ve ürün hassas miktar sağlar. Biz saf (p) ppGpp sentetaz pyrophosphokinase etkinliği tahlil için ince katmanlı Kromatografi kullanan bir yöntem mevcut. Bu yöntem daha önce etkinliği döngüsel nükleotit ve dinükleotit sentetaz ile karakterize etmek için kullanılan ve geniş bir nükleotit trifosfat bağ hidrolize veya bir terminal aktarır herhangi bir enzim aktivitesinin karakterize için uygundur başka bir molekül fosfat fosfat donörden.

Biz Clostridium difficile ve enzimatik faaliyete değerlendirilmesi (p) ppGpp sentetaz benzeşme arıtma için bir yöntem mevcut. Şekil 1 metal benzeşme Kromatografi tarafından elde protein saflaştırma gösterir. Bu arıtma üzerinden ikinci elüsyon (E2) kesir diyaliz ve enzimatik aktivite tayini için kullanılan. Şekil 2 hazırlamak ve ince tabaka Kromatografi tarafından pyrophosphotransferase deneyleri taşı...

Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Bu yöntem, enzim substrat özgüllüğü ve reaksiyon kinetiği de dahil olmak üzere fosfotransfer enzimleri ile ilgili anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, enzim aktivitesinin istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçülmesini sağlayarak çok tutarlı birden fazla veri kümesinin hızlı bir şekilde toplanmasına olanak sağlamasıdır. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü TLC plakaları üzerindeki reaksiyonları tespit etmek ve reaksiyonlarda radyoaktif türlerin ölçülmesi açıklamaktan çok daha kolaydır.Astha'ya ek olarak, prosedürü gösteren asia Poudel, laboratuvarımdaki başka bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Bu protokolü metin protokolünde açıklandığı gibi histidin etiketli bir proteinin indükedilemez aşırı ekspresyonu ile başlayın. Proteini arındırmak için bir mililitre nikel nitriloasetik asit reçinesini yerçekimi sütununda hazırlayın.Kullanımdan bir gün önce, iki mililitre denge tamponu ile sütunu bir gecede dört santigrat derecede dengeleyin. Ertesi gün, kolondört santigrat dereceden oda sıcaklığına getirilince, açıklık lısatı yüklemeden önce yaklaşık 2-3 saat bekletin. Daha sonra lysis tampon undaki peleti yeniden askıya alın.Darbeler arasında 30 saniye duraklatarak, 10 kez 10 saniyelik aralıklarla buzdaki hücreleri sonicate. Mikrosantrifüj kullanarak 3, 080 kez g 30 dakika 4 santigrat derecede santrifüj ile lysate netleştirin. Eşit hacimlerde lisis arabelleği ile açıklığa kavuşturulan lysate'yi hazırlayın, sonra hazır, açıklıklı lysate'yi sütuna uygulayın ve akış tanbirini toplayın.Açıklığa kavuşturulan akış akışını sütuna yeniden uygulayın ve ikincil akışı toplayın. Sonra yıkama tampon bir beş mililitre ile sütun yıkayın ve akış toplamak. Sütunu beş mililitre yıkama tamponu iki ile tekrar yıkayın ve akışı toplayın.Şimdi iki mililitre elüsyon tamponu uygulayın. Her biri bir mililitrenin iki fraksiyonu halinde akış-through toplamak. Protein saflaştırma sırasında, magnezyum klorür saflaştırma tamponlar dahil, üreticinin protokolü bir değişiklik, enzimatik aktivite için gereklidir.SDS-PAGE ile protein saflaşmasını nitel olarak değerlendirmek için, tüm sütun fraksiyonlarının 20 mikrolitre aliquot'larını %4 istifleme, %10'u 170 voltta 60 dakika boyunca poliakrilamid jel çalıştırın. Beş saat boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Coomassie mavi ile jel Leke, bir tezgah üstü rocker hafifçe sallanan. Sonra oda sıcaklığında bir gecede% 40 metanol-10% buzul asetik asit jel destain, benchtop rocker üzerinde sallanan.Diyaliz tamponuna karşı eluted fraksiyonu 200:1 oranında bir mililitrediyaliz cihazı ile bir gecede 20 kilodalton moleküler ağırlık kesme ile dört derece santigrat de eluted kesir 2. 280 nanometrede emiciliği ölçerek ve hesaplanan molar yok olma katsayısını kullanarak diyaliz protein numunesinin konsantrasyonu belirleyin. 100 mikrolitrelik diyaliz protein örneğini kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Reaksiyonu gerçekleştirmeden önce, PEI selüloz ince tabaka kromatografi plakalarını deiyonize suda yıkayarak hazırlayın. Yaklaşık 0,5 santimetre derinliğe çift distile su ile bir cam odasına plakaları yerleştirin. Suyun plakanın üstüne çıkmasına izin verdikten sonra, tabakları cam hazneden çıkarve bir tezgah üstü rafta bekletin.Kurutulmuş tabakları bir kenardan iki santimetre yumuşak bir kalemle işaretleyin ve örneklerin TLC için nereye uygulanacağını belirtin. İki mikrolitrelik numuneler için, numuneleri en az bir santimetre arayla uygulayın. Denemeler planlarken, her plakaüzerinde her zaman bir nokta bırakın örnek nicelleştirme için boş bir şerit olarak hizmet vermek için kullanılmaz.Enzim aktivitesi testini gerçekleştirmek için metin protokolünde açıklandığı gibi gamma P32 ATP kullanarak bireysel reaksiyonlar hazırlayın. Diğer bileşenler karıştırıldıktan sonra RSH'yi ekleyin, nükleotit içeren karışıma RSH ilavesi enzimatik aktivite yitirir. ATP hidrolizininnü nükleaz aktivitesini kirletmekten kontrol etmek için, protein içermeyen 10 mikrolitrelik bir reaksiyon uyguluyor ve paralel olarak kuluçkaya yatırın.İki mikrolitrelik numuneleri T'de sıfıra eşit olarak ve deney sonunda ATP'nin protein yokluğunda hidrolize edilmediğinden emin olmak için noktalandırın. RSH'nin eklenmesinden hemen sonra, iki mikrolitreyi çıkarın ve T sıfır dakika örneğine eşit olduğu için etiketli PEI-selüloz plakasına yerleştirin. Reaksiyonu 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, istenilen zaman noktalarında iki mikrolitrelik aliquotları çıkarın.Tüm aliquots toplandıktan sonra, 0.5 santimetre derinliğe 1.5 molar monobasic potasyum fosfat ile kromatografi odası doldurarak ince tabaka kromatografi yapmak. Plakanın alt kenarını çözücüye batırın ve çözücünün yaklaşık 90 dakika boyunca plakanın üst kısmına geçişini bekleyin. Plakayı kromatografi tankından çıkarın ve bir gece boyunca kuruması için tezgah üstü kurutma rafına yerleştirin.Plaka kuruduktan sonra, radyoaktif maddenin görüntüleme kasetine aktarılmasını önlemek için plakayı plastik filme sarın ve otoradyografi ile analiz edin. Oda sıcaklığında dört saat boyunca fosforimager kasete ayrılmış reaksiyonlar içeren PEI-selüloz plakasını açığa çıkarın. Pozlamayı takiben, kaseti fosforlu görüntüleyicinin üzerinde görüntüleyin.Grafik kullanıcı arabirimi ile görüntüleme yazılımı kullanarak, ilk bir Dikdörtgen Çiz'i seçerek ilgi bölgeleri veya ROI'lar çizin, ardından fareyi kullanarak tüm şerit etrafında dikdörtgen ROI'lar ve bu şeridin içinde bulunan ATP ve guanozin-tetrafosfat noktalarını çizin. ROI'ların her şeritteki aynı alanlarda sinyal ölçtüğünden emin olmak için diğer şeritler içinde aynı ROI'ları çizmek için Seç, Kopyala ve Yapıştır komutlarını kullanın. Boş olarak kullanılmak üzere kullanılmayan bir şeritten ROI'lar ekleyin.Analiz, Araçlar, Yatırım Getirisi Yöneticisi, Görüntüleme yazılımıkomutları ekleyin kullanarak, PEI-selüloz plaka üzerinde çizilmiş ROI'ların tümünü seçin. Şimdi her YG içindeki sinyal yoğunluğunu ölçmek ve ölçümleri spreadsheeet olarak dışa aktarmak için Analiz, Ölçümleri Ayarla, Ölçü komutlarını kullanın. Elektronik tabloda, boş YG değerlerini deneysel sinyallerden çıkarın.Verilerin sentezlenmiş yüzde guanozin-tetrafosfata dönüştürülmesi çok önemlidir, çünkü farklı günlerde farklı protein veya farklı gama P32 ATP ile toplanan veri kümelerinin tutarlı olmasını ve istatistiksel titizlik için bir araya getirilebilmesini sağlar. Bu karikatür, ilgi alanlarının, bir numunedeki toplam radyoaktif sinyali ve bileşen radyoaktif ATP'yi ve guanozin tetrafosfat bölgelerini içeren bir şeridi tanımlamak için nasıl kullanıldığını göstermektedir. ATP ve guanozin tetrafosfat sinyalleri mutlak değerleri bildirmek yerine toplam sinyale normalleştirilir, çünkü radyoaktif substrat borulama hatası veya çürümesi numunedeki toplam sinyali etkileyebilir, ancak enzim aktivitesini etkilemez.Burada gösterilen safLaştırılmış C.difficile RSH kullanılarak yapılan bir reaksiyonun gerçek bir TLC plaka. Protein içermeyen bir kontrol reaksiyonu katalize edilmemiş ATP hidrolizinin nicelleştirilmesine izin verirken, boş bir şerit doğru sinyal nicelemesine izin verir. ATP ve guanozin-tetrafosfat lekelerinde enzim radyoaktif fosfatı ATP substratından GSYİh öncüsörüne aktararak radyoaktif guanozin tetrafosfat oluşturur.Bu, C.difficile'den gelen putatif guanozin tetrafosfat sentezinin aktif bir enzim olduğunu doğrular. Reaksiyonun aralıklarla örneklendiği gibi, ilerleme gözlemlenebilir. Burada ham sinyal her zaman noktasında gözlenir.ATP azalıyor ve guanozin tetrafosfat artıyor. Burada normalleştirilmiş veriler gösterilmiştir. Normalleştirme herhangi bir pipetleme hatası için hesaplar, çünkü hata çubukları çok daha küçüktür.Bu yordamı denerken, TLC plakaüzerindeki rezorin çizilmemeye dikkat etmek önemlidir, çünkü bu solvent geçişini engelleyebilir. Bu hızlı bir şekilde enzim aktivitesinin sağlam niceleme sağlayabilir basit veri analizi ile çok erişilebilir bir tekniktir. Clostridium difficile'ın guanozin tetrafosfatsentezini doğrulamak için kullandık.Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken radyoaktif maddelerin depolanması ve kullanılması için kurumunuzun kurallarına uymanız gerekir. Bu yöntem guanozin tetrafosfat sentezine ışık verebilir, ancak protein kinaz aktivitesi ve siklik diguanylate sentezi de dahil olmak üzere diğer fosfotransfer reaksiyonlarına da uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Bir Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Kullanarak İnsan Plazma Faktör V Aktivitenin Ölçümü

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Kültürleme ve bakımı<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Bir Anaerobik Çevre

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Gerilme R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...