Name: a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها "الصندوق البحوث النمساوية" (P31559-B20 إلى E.E.P.). يشكر المؤلفون بارداكجي سارة للمساعدة التقنية الممتازة في الإنتاج وإعادة تشكيل للماوس UCP1 و UCP3 في بروتيوليبوسوميس.

1-إنتاج البروتينات فصل المؤتلف (أوكبس)، وتشكيل أغشية بلير مستو
<ol><li>إنتاج UCP1 المؤتلف و UCP3 كما وصفها روبريشت et al. 9 وهيلس et al. 10
</li>
	<li>تشكل الأغشية بلير مستو على نصائح الماصات البلاستيكية يمكن الاستغناء عنها التقليدية كما وصفها بيك et al. 7
</li>
</ol>2-إعداد مسرى جسر الملح الصغرى-أجار
<ol><li>ضبط ماصة ميكروكابيلاري نصيحة (انظر الجدول للمواد) للطول المناسب.<ol>
<li>وضع علامة على موضع على تلميح فارغ الذي سيلحق بالتلميح الذي يحتوي على المخزن المؤقت واستخدام انزلاق قدمه ذات الورنيّة لقياس طول مسرى الجسر الصغير-أجار ملح. تنبيه: تلميح ميكروكابيلاري يجب أن تكون طويلة بما يكفي لإدخال الحل المخزن المؤقت للقياسات.</li>
		<li>نصيحة ميكروكابيلاري بسكين حادة أو شفرة قطع وتنظيف سطح قطع مع الإيثانول والمياه.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد مسرى المغلفة أجكل.<ol>
<li>قطع سلك Ag حوالي 8 سم في الطول وتنظيفه مع الإيثانول والماء.</li>
		<li>يأخذ قطعة من الصنفرة وأسفل سطح طول 1 سم في نهاية السلك، التي ينبغي أن تكون على اتصال مع الحل الملح على نحو سلس.</li>
		<li>تراجع نهاية متجانسة في حل بوكل 3 أمتار ومعطف اليكتروتشيميكالي الكلوريد باستخدام إمدادات العاصمة 1.5 V 10 s.</li>
		<li>مسرى مع المياه النظيفة والجافة وضبط طول مسرى AgCl من الجانب غير المصقول حيث أنها تخترق نصيحة ميكروكابيلاري العميق قدر الإمكان. ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد حل ملح بوكل م 3 مع [اغروس] 1% (v/v).<ol>
<li>تزن بها ز 4.47 من بوكل وتذوب في 20 مل الماء بإثارة ذلك في قارورة.</li>
		<li>إزالة محرض وزن إلى 0.2 جم من [اغروس]، وإضافة إلى قارورة.</li>
		<li>تصل الحل إلى 100 درجة مئوية الحرارة تذوب في [اغروس] وتمنع تخثر الدم. تنبيه: سوف يكون قارورة حار جداً. لا تلمس ذلك بأيديهم العارية. استخدام قفازات للمناولة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ملء نصيحة ميكروكابيلاري مع الحل الملح [اغروس]. تنبيه: أن الحل الساخنة. حماية الأيدي والعمل بعناية لتجنب البقع.<ol>
<li>إذا كان [اغروس] يبدأ تخثر، تسخين حل الملح تذوب تماما [اغروس] مرة أخرى.</li>
		<li>ينقع 10 ميليلتر من الحل الملح أجار إلى نصيحة ميكروكابيلاري. نقع عليه ببطء بعناية لتجنب الهواء فقاعات في التلميح.</li>
		<li>إزالة التلميح من ماصة ودفع في مسرى AgCl من الجانب الأوسع نطاقا للتلميح. التأكد من أن تخترق مسرى الحل الملح.</li>
		<li>تهدئة الكهربائي بدرجة حرارة الغرفة وتوصيله إلى مكبر للصوت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد المخزن المؤقت للقياسات.<ol>
<li>تزن بها ز 0.710 نا2هكذا4، ز 0.195 من مس، ز 0.121 من تريس، 0.023 ز لعطا، ثم إضافة 100 مل ماء المقطر إلى كوب وآثاره الحل.</li>
		<li>التحقق من وجود قيمة pH من المخزن المؤقت باستخدام قطب درجة حموضة وقم بضبط قيمة pH إلى 7.32.</li>
		<li>تحقق من مسرى المرجعية ومسرى جسر الملح أجار في تماس كهربائي.<ol>
<li>أضف 1 مل من المخزن المؤقت إلى وعاء من بلاستيك.</li>
			<li>وتراجع في مسرى المرجعية ومسرى جسر الملح أجار وتحقق استجابة إشارات. وإذا كانت الاستجابة إشارة صحيحة، انتقل إلى الخطوة 2.7.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>إذا كان هناك استجابة إشارة خاطئة أو لا تماس كهربائي على الإطلاق، القيام استكشاف الأخطاء وإصلاحها التالية.<ol>
<li>التحقق مما إذا كان مسرى على اتصال مع الحل الملح ودفع مسرى إلى الحل. ملاحظة: إذا كان الحل بالفعل جداً لزجة، إزالة الجسر الصغير-أجار ملح وإعداد تلميح ميكروكابيلاري جديدة.</li>
		<li>التحقق من ما إذا كان هناك فقاعات الهواء داخل الحل الملح. إذا كان الجواب نعم، تعد نصيحة ميكروكابيلاري جديدة.</li>
		<li>معرفة ما إذا كان الحل الملح على اتصال مع الحل المخزن المؤقت. إذا لم يكن كذلك، ثم قطع آخر 1 مم من نهاية أنبوب التلميح. تنبيه: يجب التأكد من أن هذه المعلومة لا تزال طويلة بما يكفي لاختراق التلميح الذي يحتوي على المخزن المؤقت. إذا كان لا يزال هناك أي اتصال، تعد نصيحة ميكروكابيلاري جديدة.</li>
		<li>إذا كان أي من هذه الخطوات، تعد نصيحة ميكروكابيلاري جديدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>للتخزين، وتراجع مسرى جسر الملح أجار إلى حل بوكل م 3. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا. للإيقاف مؤقت بين عشية وضحاها، تخزين مسرى في 3 م بوكل الحل الملح في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>يعد طرف البلاستيك المحتوية على المخزن المؤقت. ملاحظة: إذا تم تخزين الكهربائي بين عشية وضحاها، أخذ بها والسماح لها بحرارة تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.<ol>
<li>نصيحة ميكروكابيلاري وينحني الأنبوب، 2 سم من حافة الجزء الضيق، ما يقرب من 90 درجة استخدام سلك تدفئة.</li>
		<li>استخدام سكين حادة جداً أو شفرة وقطع الأنبوب حوالي 5 مم من الانحناء.</li>
		<li>تنظيف السطح في النهاية مع الإيثانول والمياه وقياس قطر الثقب للحافة. من ذلك، حساب مساحة السطح.</li>
		<li>معطف سطح غيض مع 85:15 (الخامس: الخامس) الهكسين: هيكساديكان.<ol>
<li>"الماصة؛" 3 ميليلتر من المذيب وإزالته من الحافة.</li>
			<li>انتظر 1 دقيقة بحيث أن كل من المذيبات المتبقية في التلميح قد تبخرت.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ملء معلومات القياس مع 3 ميليلتر من المخزن المؤقت وتوصيله إلى مسرى جسر الملح. ملاحظة: التحقق مرة أخرى إذا مسرى جسر الملح ومسرى مرجع في الاتصال الكهربائية عن طريق إجراء خطوة 2.5.3.</li>
		<li>إذا لم يكن هناك لا تماس كهربائي، تحقق ما يلي:<ol>
<li>التحقق مما إذا كان مسرى الملح جسر اتصال مع الحل المخزن المؤقت. إذا لم يكن كذلك، ثم زيادة حجم المخزن المؤقت في التلميح أو إعداد تلميح ميكروكابيلاري أطول.</li>
			<li>إذا كان هناك فقاعة هواء، إزالة التلميح من مسرى الجسر الصغير-الملح وإعادة ملء المخزن المؤقت في التلميح وتوصيله الكهربائي مرة أخرى.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-قياس البارامترات الكهربائية للغشاء تشكيلها مع البروتين المؤتلف
<ol><li>تطبيق إشارة جهد ثلاثي متناوبة مع الجهد القصوى يوماكس = 50 أم و ΔTمنحدر = 50 مللي ثانية، مما يخلق استجابة تيار المتردد مستطيلة. من متوسط قيم التيارات الإيجابية والسلبية (+ وأنا–)، حساب قدرة الغشاء وفقا للصيغة التالية: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>تطبيق منحدر جهد تتراوح بين-50 أم أم + 50 والسجل الحالي. تناسب دالة خطية للبيانات-المنحدر هو الموصلية-ونقطة تقاطع المحور السيني يصلح لحساب.</li>
	<li>الاضطلاع بالحل في تلميح البلاستيكية وتعبئة واحدة جديدة مع مخزن مؤقت يتضمن بتركيز زيادة الركازة.<ol>
<li>إذا تم تشكيل لا غشاء داخل s 20-30 الأولى، أداء وحدة التخزين وإعادة شحنة. وهذا يضمن أن التدرج التركيز عبر الغشاء لا تتغير كثيرا أثناء تكوين غشاء.</li>
		<li>بعد تكوين غشاء، نفذ الخطوات 3.1 و 3.2 مرة أخرى للتحقق من تكوين غشاء سليم والحصول على نقطة تقاطع المحور س.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-حساب معدل دوران الركيزة
ملاحظة: انظر الأعمال السابقة لتفاصيل3،7.
<ol><li>تقدير كمية البروتين في الغشاء من الكتلة الجزيئية للدهن والبروتين (مالدهن ومالبروتين) ومنطقة الغشاء والدهن واحد رئيس الفريق (غشاء والمادة الدهنية) ونسبة البروتين الواحد الشامل دهن (r). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>حساب المحتملة للركيزة المنقولة] [نرنست]. R هو ثابت الغازات، T درجة الحرارة, z المسؤول عن الركيزة المنقولة، و فاراداي ثابتة، وج1 وجيم2 تركيزات الركيزة من كلا الجانبين من الغشاء. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>من التسجيلات الحالية الفولت، تأخذ العكس المحتملة المحسوبة مع اختلاف نقاط تقاطع المحور السيني من يناسب الخطي في وجود وغياب التدرج الركازة.</li>
	<li>حساب نسبة الموصلية الركازة، زالركازة، إلى الموصلية غشاء المجموع، زالإجمالي، بنسبة إمكانية عكس المحتملة] [نرنست]11. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>حساب الركازة دوران ΔN رقمالركيزة الواحدة مرة وحدة ΔT من الموصلية الركازة (زالركيزة)، والجهد التطبيقية يو، والمسؤول عن ي الركيزة <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>من نسبة الركازة تنقل كل مرة إلى عدد البروتينات، حساب κ معدل دوران. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+research+in+drug+discovery.">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li><li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+chloride+electrode:+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents.">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li><li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+kinetics+of+uncoupling+proteins.+Analysis+of+UCP1+reconstituted+in+planar+lipid+bilayers.">Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+human+uncoupling+proteins+1+and+2+in+planar+lipid+bilayers.">Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers.</a> The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).</li><li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+intrapipette+salt+bridge.">A simple intrapipette salt bridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+technique+for+the+reconstitution+of+hydrophobic+proteins+into+planar+bilayer+membranes.+Studies+of+human+recombinant+uncoupling+protein+1.">A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li><li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate.">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li><li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak.">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li><li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue.">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li><li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology.">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li><li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices.">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تنفيذ الجسر الصغير-أجار الملح مع مسرى يقلل نشر المحتملة ويسمح قياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة الناتجة عن تدرج درجة حموضة. حضور مختلف الأس الهيدروجيني transmembrane التدرجات، التحول المحتملة لكل أقطاب مقبول في ΔpH = 0.35 عند مقارنة بالقيمة النظرية للتوازن] [نرنست] المحتملة (Φ] [نرنست] = 23.8 mV ل ΔpH = 0.4). ومع ذلك، في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي تدرجات إضافية، كما لفشل مثيل في الميتوكوندريا بين المصفوفة والفضاء intermembrane، مسرى AgCl القياسية دقة قياس التحول المحتملة في ΔpH = 1 (الشكل 3أ). وألقى مسرى سدها بالملح الصغرى-أجار القيم التي أكثر بكثير مماثلة للنظرية.
نشر محتملة قد تحدث أيضا في مسرى مرجع AgCl إذا تم تغيير الحل المخزن المؤقت أثناء التجربة. الحل عازلة خالية من كلوريد استخدمت في التجارب حيث يفصل البروتينات واقترح نقل أيونات الكلوريد، وتم ضبط درجة الحموضة استخدام تريس أو مس. مسرى المحتملة، نظراً لعدم وجود تركيز كبير من الكلوريد، أساسا يعتمد على شوائب كلوريد في الحل المخزن المؤقت. كما لم يتغير تشكيلها خلال التجارب، أنه سيؤدي ببساطة إلى إمكانية إزاحة ثابتة. ومع ذلك، لقياس مطلقة الاختلاف المحتملة قطبين، نظام ملح-جسر أجار بسيط (Ag/AgCl 3 م بوكل) أيضا يمكن لمسرى مرجع.
جسر ملح الصغرى-أجار أرصدة نشر المحتملة بالموازنة القطب المحتملة. بغية تثبيت الحل الملح، تمت إضافة 1% (w/v) [اغروس] لمنع اختلاط الحل الملح مع الحل المخزن المؤقت. أيونات الملح ك+ و Cl– موبيليتيس مماثلة في السائل والتوازن الكهربائي المحتملة. تثبيت الجسر الملح بشكل صحيح، لا الحل الملح أجار يمكن تسخينه بما فيه الكفاية لملء نصيحة ميكروكابيلاري دون أي فقاعات الهواء وتغطية مسرى AgCl. قبل مواصلة الاستخدام، قد تماس كهربائي بين مسرى جسر الملح ومسرى مرجع لفحصها. وقد حل الملح حسب الوقت الذي يستخدم الجسر الملح، أن تبلور بما فيه الكفاية لمنع أي خلط الحل الملح مع المخزن المؤقت. هذا أمر بالغ الأهمية خاصة إذا كان يتم التحقيق ك+ أو الناقلين Cl– . واستخدمت الجسر الملح لفترة زمنية قصيرة جداً وشطف من [اغروس] لا يكاد يذكر في هذا النطاق الزمني. تركيز أعلى من [اغروس] ليصل إلى 5 في المائة، أو أجار (3 ٪-5 ٪)، يسمح باستخدام جسر الملح لفترة أطول من الوقت6،12.
يسمح هذا الأسلوب تحديد حركية النقل الناقل غشاء (ط) مع معدلات دوران منخفضة و (ثانيا) mitochondrial البروتينات الغشاء الداخلي، الذي لا يمكن أن يحقق في التصحيح القياسي المشبك التكوينات13. دقتها تعتمد أساسا على قياس إمكانية عكس، يتناقص فيه دقة الموصلية غشاء إجمالي منخفض والتدرجات تركيز الصغيرة التي تحفز غشاء محتملة أدناه ضوضاء تسجيل.
باستخدام هذا الإعداد، تم قياس معدلات دوران UCP1 و UCP3 كما أنتجت في نفس الظروف. بسبب ارتفاع درجة الحموضة التدرج، تبدو المعدلات التي تم الحصول عليها تكون أكثر دقة ودونما قلاقل بالآثار الناجمة عن التحول المحتملة طفيفة القطب. يمكن استخدامه لزيادة تحليل ومقارنة الناقلين غشاء الميتوكوندريا المنتجة في ظروف مماثلة.

وتستهدف بروتينات الغشاء تصل إلى 60 في المائة من جميع العقاقير الصيدلانية المعروفة1. القياسات الكهربية من البروتينات الغشاء أداة قوية ولكن حساسة لتحليل النقل وآﻻت من ركائز توسط بروتينات الغشاء الناقل. يسمح التعديل الحالي ترانسميمبراني من تطبيق الفولتية ثابتة أو سلالم الجهد تقييم الخصائص الدوائية والفيزيائية من شركات النقل، وعلى سبيل المثال، تفعيل وتثبيط من ركائز أو النقل حركية. الاهتمام الخاص هو عدد دوران الركازة، الذي يعرض مقدار الركيزة التي يتم ذوبانها بروتين غشاء كل وحدة وقت. أنها معلمة رئيسية عند مقارنة حركية مختلف البروتينات الغشاء. إنشاء تدرج تركيز من الركازة المشحونة عبر الغشاء يولد قوة الدافعة الكهربائية يستخلص منها عدد دوران الركازة.
استخدام قطب AgCl، وجود منطقة عازلة خالية من كلوريد يخلق إمكانية نشرها أن يغير مسرى المحتملة ويؤدي إلى تحول في قياسات الجهد الحالي2. على الرغم من أن هذا دائماً، فإنه لا يكاد يذكر الموصلية القياسية وقياس القدرات منذ هذه المعلمات أما تعتمد على المنحدر من الجهد الحالي تسجيل (الموصلية) أو هي الفرق بين تسجيل واحد (القدرات)، التي يلغي إمكانية. بيد تسجيل إمكانية عكس، الذي يتم إنشاؤه بواسطة نقل الركازة، يمكن أن تكون إلى حد كبير انزعاج نشر المحتملة. وهكذا، للحصول على قياسات دقيقة لإمكانية عكس، إمكانات قطب كهربائي يجب أن تبقى ثابتة.
يمكن التقليل من انتشار محتمل بطريقتين: (ط) بحضور كل من غشاء بلير، تركيز الركيزة يجب أن يزاد على جانب واحد من3،الغشاء4، أو أرصدة (ثانيا) جسر ملح مسرى المحتملة 5. الطريقة الأولى تعتمد اعتماداً كبيرا على استقرار القياسات. وقد الغشاء البقاء على قيد الحياة لعدة دقائق، من إضافة الركازة تحت إثارة حتى الركيزة هي موزعة بالتساوي تقريبا في الحل. إذا كان الغشاء تصدعات في بين، هو تغيير التدرج الركيزة بالتبادل الحر للجزيئات المشحونة، وتحويل القياسات غير دقيقة. الأسلوب الأخير أرصدة نشر المحتملة غير محدودة الحجم للإنشاء. تحدي تنفيذ صغيرة ولكن عمل جسر الملح في طائفة الجزئي لإعداد الكهربية6. للأسلوب الأخير، هو الحل الملح شغلها في تلميح ميكروكابيلاري واستقرت بالإضافة [اغروس] لمنع نشر الحل الملح إلى الحل المخزن المؤقت.
ويرد في هذا البروتوكول، إنتاج مباشرة الجسر الصغير-أجار ملح والتنفيذ في إعداد الكهربية استناداً إلى إعداد ماصة7 . يتم ضبط نصيحة ميكروكابيلاري لاحتواء حل بوكل م 3 مع جزئ 1% (w/v) [اغروس] ولسد حلاً AgCl القطب والمخزن المؤقت. يتم عرض في استفادة الجسر الصغير-الملح بتسجيلات وقت التحول المحتملة القطب وقياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة في مختلف الأس الهيدروجيني التدرجات. في النظام النموذجي للبروتينات التوليفية التي أعيد تشكيلها في الدهنية، بإغﻻقها معدلات دوران الناقلين المتقدرية UCP1 و UCP3 المنتجة في ظروف مماثلة ومقارنة بالنتائج السابقة3،8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:325px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:345px;">5242956.003</td>
			<td style="width:167px;">Microcapillary pipette tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol 99%</td>
			<td>AustrAlco &#214;sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td>
			<td>AAAH-5020-07025-230317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kaliumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DC supply</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>V10/CPG 1940 -01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose Standard</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3810.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample tube</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>5863.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2SO4</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>8560.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MES</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>4256.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexadecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating wire</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>USPS-2250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins

وحتى الآن، تستهدف أكثر من 50 في المائة من جميع العقاقير الدوائية حركية النقل من غشاء بروتينات. توصيف الكهربية من البروتينات الناقل غشاء تشكيلها في الأغشية الدهنية بلير وسيلة قوية ولكن حساسة لتقييم الخصائص الفيزيائية الكيميائية والصيدلانية الخاصة بهم. عدد دوران الركيزة هو معلمة فريدة من نوعها تتيح المقارنة بين نشاط البروتينات الغشاء مختلفة. في نقل وآﻻت، يخلق تدرج الركازة ذوبانها غشاء محتملة الذي يرتبط مباشرة بمعدل دوران الركيزة من البروتين. باستخدام أقطاب كلوريد الفضة، هو فعل إمكانية نشرها، كما دعا تقاطع السائل المحتملة،، الذي يغير إمكانات القطب وتزعج القياسات المحتملة غشاء دقيق إلى حد كبير. يمكن التقليل من انتشار محتمل عن طريق جسر ملح، الذي يوازن بين الإمكانات قطب كهربائي. في هذه المقالة، جسر ملح الصغرى-أجار تهدف إلى تحسين البنية الكهربية، الذي يستخدم ميكروبيبيتيس لتشكيل الغشاء. الحل الملح يتم ملؤها في تلميح ماصة ميكروكابيلاري، استقرت بالإضافة [اغروس]، ويمكن تركيبة بسهولة على قطب قياسية. إمكانات القطب القطب الجسر الصغير-الملح أكثر استقرارا مقارنة قطب قياسية. تنفيذ هذا النظام استقرار القطب المحتملة ويسمح قياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة الناتجة عن تدرج درجة حموضة. باستخدام هذا النظام، بإغﻻقها معدلات دوران بروتون الناقلين المتقدرية UCP1 و UCP3 ومقارنة بالقياسات السابقة.

للتحقق من حد انتشار محتمل، وتم قياس استقرار قياسات الجهد الحالي الغشاء سليمة. في الشكل 2أ، يصور تسجيلات الجهد الحالي الممثل في الوجود (النقاط البيضاء) وغياب التدرج الأس الهيدروجيني (النقاط السوداء). طبقاً للمعادلة [نرنست]، يستحث التدرج درجة الحموضة تحولاً في الجهد. من نقطة تقاطع المحور السيني لنوبة الخطي للبيانات، يتم حساب التحول المحتملة. من أجل اختبار الأقطاب على حد سواء، وقد تم تحليل التحول في نقطة تقاطع المحور س AgCl قياسية قطب كهربائي (الشكل 2ب؛ النقاط البيضاء) وجسر ملح الصغرى-أجار (الشكل 2ب؛ النقاط السوداء). منحدر جهد سجلت عشر مرات في صف واحد وهو يصور التحول يعني في المحور س ضد الوقت. بينما كان مسرى جسر الملح أجار تحولاً الحد أقصى من أقل من 5 mV حتى بعد 300 ثانية للقياس، ومسرى القياسية متنوعة تصل إلى 30 أم في سلوك لا يمكن التنبؤ بها، وعشوائي.
بعد ذلك، جرى اختبارها كلا أقطاب في تدرجات مختلفة من الأس الهيدروجيني (الشكل 3أ). من أجله مسرى القياسية، الانحدار درجة حموضة من 0.35 و 1.0 (النقاط البيضاء)؛ أجار ملح جسر القطب، والتدرجات الأس الهيدروجيني من 0.35 و 0.7 و 1.0 (النقاط السوداء). وقد تم تحليل هذا التحول في الإمكانات في ثلاثة مقاييس مستقلة. على عكس رج 0.35، حيث تحول يقاس فقط يختلف قليلاً، يغير التحول الجهد إلى حد كبير في التدرج درجة الحموضة من 1.0 في غياب الجسر الصغير-أجار ملح. من نوبة خطي للبيانات، هو منحدر الدالة 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH للقطب القياسية و 50.1 ± 4.6 السيارات/ΔpH لمسرى الجسر الصغير-أجار ملح. طبقاً للمعادلة [نرنست]، هو التحول المحتملة المحسوبة 60.7 mV/ΔpH في T = 32 درجة مئوية.
استخدام الجسر الصغير-أجار الملح، عدد دوران بروتون، κ، UCP1 الميتوكوندريا و UCP3 كان قياس ومقارنة بالقياسات السابقة (الشكل 3ب). مشابه ل الرقم 3ألف، ΔpH = 1.0 تم إنشاؤها، وتم قياس إمكانية عكس. وقدرت كمية البروتين في الغشاء وفقا للصيغة الواردة في المادة 4 من البروتوكول، مع بروتين إلى نسبة الدهن 4 ميكروغرام/(مغ من المادة الدهنية)، كتلة جزيئية دا 33,000، و 750 للبروتين والدهن، غشاء مساحة 3.53 × 10 -4 سم2، ومساحة كل الدهن 7.8 × 10-15 سم2. الحصول على κwas 5.56 ± 0.38 s-1 و 4.10 ± 0.71 s-1 UCP1 و UCP3، على التوالي (الشكل 3ب).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> الشكل 1 : تركيب الكهربية بالجسر الصغير-أجار ملح. (أ) هذا الفريق يظهر الرسم التقريبي للإنشاء. نصيحة ميكروكابيلاري التي تحتوي على الحل الملح أجار (المبينة باللون البرتقالي) يوضع بين مسرى (أسود) والذي يحتوي على المخزن المؤقت (أزرق). ويتكون الغشاء على السطح في نهاية الحافة الذي يحتوي على المخزن المؤقت (المشار إليها بالسهم). (ب) هذا الفريق يظهر صورة لطريقة إعداد الكهربية مع تنفيذ الجسر الصغير-أجار ملح. الأسهم تشير إلى مسرى والجسر الصغير-أجار ملح ومسرى مرجعية والحاوية مع المخزن المؤقت للحل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> الشكل 2 : مقارنة جسر ملح أجار الصغرى ومسرى AgCl قياسية. (أ) هذا الفريق قياس يظهر الفولت الحالي ممثل في الوجود (النقاط الرمادية) وغياب (النقاط البيضاء) التدرج درجة الحموضة من 1. تمثل الخطوط نوبة خطي للبيانات، ويتم الحصول عليها من الموصلية والمحور السيني التي تقاطع القيم. يتم تقييم التحول الجهد بالفرق بين قيم تقاطع كل التسجيلات. (ب) هذا الفريق يظهر التحول في غشاء المحتملة للقطب AgCl القياسية (النقاط البيضاء) إلى قطب جسر الصغير-أجار ملح (النقاط السوداء) في الوقت المناسب. وسجلت قياسات الجهد الحالي عشرة في صف والمرسومة التحول الجهد يعني بنشر المحتملة ضد الوقت. وفي جميع التجارب، قدم الغشاء 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL تشكيلها مع حمض اراسيدونيك % مول 15 بتركيز 1.5 ملغ/مل. المخزن المؤقت الوارد 50 مم نا2هكذا4، 10 مس، 10 مم تريس، و 0.6 ملم عطا في درجة الحموضة = 7.34 و T = 32 درجة مئوية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> الشكل 3 : حساب عدد دوران بروتون UCP1 و UCP3 من إمكانية عكس حضور تدرج pH. (أ) هذا الفريق يظهر التحول في إمكانات غشاء المحتوية على UCP1 مختلف التدرجات الأس الهيدروجيني قطب AgCl قياسية (النقاط البيضاء) وجسر ملح الصغرى-أجار قطب (النقاط السوداء). تمثل الخطوط نوبة خطي للبيانات. (ب) هذا الفريق ويبين عدد دوران بروتون UCP1 (مجموعة البيانات الأولى) و UCP3 (مجموعة البيانات الثانية) كما محسوبة من نسبة الجهد العالي لإمكانات] [نرنست] وفقا للصيغ الموجودة في القسم 4 من البروتوكول. أول شريط لكل مجموعة تمثل معدلات الدوران يقاس بالجسر الصغير-أجار ملح. يمثل شريط الثاني لكل مجموعة بيانات القياسات السابقة استخدام قطب AgCl قياسية. وقد أخذت القيم UCP1 و UCP3 من أوربانكوفاet al. 3 وماخر et al. 8-في كل القياسات، جرى الغشاء 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL تشكيلها مع مول 15% AA و UCP1/UCP3. وكان تركيز الدهن والبروتين 1.5 ملغ/مل و 4 ميكروغرام/ملغ من الدهن، على التوالي. المخزن المؤقت الوارد 50 مم نا2هكذا4، 10 مس، 10 مم تريس، و 0.6 ملم عطا في درجة الحموضة = 7.34 و T = 32 درجة مئوية. الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت للقياسات التدرج زاد إلى 7.66 أو 8.00 8.33 بإضافة تريس وتم تغيير في ماصة المحتوية على الحل. أن القيم هي ± متوسط الانحراف المعياري للقياسات المستقلة الثلاثة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

في القياسات الكهربية، تزعج وجود انتشار محتمل القياس الدقيق لاحتمال عكس بتغيير مسرى المحتملة. استخدام جسر ملح الصغرى-أجار، يتم تصغير أثر نشر المحتملة، التي تتيح قياس أكثر دقة من الركازة دوران أرقام من البروتينات الغشاء المؤتلف المعاد تشكيلها.

قطب الصغير-أجار ملح جسر لتحليل معدل دوران بروتون بروتينات الغشاء المؤتلف

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فحص بروتينات الأغشية مثل الناقلين والقنوات. المعلومات حول فقدان معدل دوران الركيزة مقارنة نشاط البروتين وخصوصية والظروف الفسيولوجية والمرضية المختلفة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقلل من احتمال تغير التحول والظروف العازلة الحرة للكلوريد.ويزيد بشكل كبير من دقة تحديد معدل الدوران بسبب قياسات محتملة أكثر دقة للغشاء. جمع العناصر للخطوات قبضة. وتشمل هذه اثنين من نصائح ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة، شفرة حادة والفرجار انزلاق.لأقطاب لديها الأسلاك الفضية، ورقة الرمل وثلاثة محلول كلوريد البوتاسيوم المولر في متناول اليد. وبالإضافة إلى ذلك الإيثانول والماء لتنظيف وإمدادات الطاقة DC. المضي قدما من خلال العمل مع اثنين من نصائح الصغيرة ماصة.ابدأ بالتلميح الذي يحتوي على المخزن المؤقت. ضع الطرف الثاني بجوار الأول. نقل الطرف الثاني، لذلك، عندما إدراجه سوف تمتد على الأقل خمسة ملليمترات جزء ضيق في الجزء الأول.وضع علامة على الموضع الذي سيتم إرفاق أول مخزن مؤقت يحتوي على تلميح. ثم استخدام الفرجر لقياس طول القطب جسر الملح الصغيرة أجار. استخدام شفرة لقطع الطرف إلى الطول المناسب.تنظيف السطح مع قطع الإيثانول تليها المياه. بعد ذلك، الحصول على طول ما يقرب من ثمانية سنتيمترات من الأسلاك الفضية للالكترود. تنظيف السلك على مناديل مع الإيثانول تليها المياه.بعد التنظيف، استخدم ورق الرمل لتنعيم السطح على طول سنتيمتر واحد في نهاية واحدة. هذا السلك مع نهايته ممهدة على استعداد لتكون المغلفة كهربائيا كيميائيا. وضع نهاية ممهدة في محلول كلوريد البوتاسيوم مع الطرف الآخر متصلة إمدادات الطاقة DC للطلاء.عندما المغلفة، فصل القطب وتنظيفه بالماء. بعد تجفيفه، وتحديد الطول الذي يسمح لها لاختراق طرف الشعرية الصغيرة أعمق قدر الإمكان. قطع القطب الكهربائي من الجانب غير المصقول إلى الطول المناسب.الآن، انتقل إلى إعداد محلول الملح مع agarose. في قارورة تحتوي على الماء تذوب كلوريد البوتاسيوم واستخدام الستيرر المغناطيسي للمساعدة في خلط. بعد إزالة المُحرك أضف أغاروز إلى القارورة.خذ القارورة إلى الميكروويف وتسخينها لإذابة الأذانوز عند حوالي 100 درجة مئوية. أخرجه للتحقق بصريا من أن agarose يذوب تماما. مرة واحدة يتم حل أجاروز ماصة 10 ميكرولترات في الشعيرات الدموية الصغيرة ببطء لتجنب فقاعات الهواء.من المهم أن الماصة بعناية محلول ملح أجار في طرف الشعيرات الدموية الصغيرة ، خاصة عند تركيزات agar العالية. إذا لم يتم ذلك بشكل صحيح يتم إنتاج فقاعات الهواء بسهولة في الطرف وكتلة التدفق الكهربائي. بعد إزالة طرف من ماصة دفع القطب في ذلك.تأكد من أن القطب يخترق محلول الملح. عندما يكون القطب في درجة حرارة الغرفة سده في القطب المرجعي في مكبر للصوت. دعم القطب المرجعي بحيث يمكن خفضها في حاوية بلاستيكية مع واحد ملليلتر من العازلة.بعد ذلك، تراجع القطب جسر الملح في الحل. تطبيق الجهد والتحقق من أن هناك استجابة الحالية قبل المتابعة. إذا نجح الاختبار، افصل الأقطاب الكهربية.إذا لزم الأمر، قم بتخزين قطب جسر الملح عن طريق غمسه في محلول كلوريد البوتاسيوم المولاري الثلاثة. بعد ذلك، قم بإعداد المخزن المؤقت الذي يحتوي على طرف بلاستيكي. خذ طرف الشعرية الصغيرة وتحديد نقطة اثنين من سنتيمترين من الجزء الضيق.استخدام سلك التدفئة لثني أنبوب 90 درجة في هذا الموقف. بسكين حاد قطع الأنبوب خمسة ملليمترات من عازمة. تنظيف المنطقة التي تم قطعها بالإيثانول تليها المياه.قبل المضي قدما، واستخدام المجهر الخفيفة مع مقياس لقياس قطر الثقب في الطرف. المقبل، نقل ماصة لتكون بالقرب من حاوية من المذيبات وآخر من العازلة. الماصات ثلاثة ميكروليترس من المذيبات داخل وخارج الطرف.المقبل، وملء غيض القياس مع ثلاثة ميكرولترات من العازلة. الآن، إسترِدْ الجسر الملحِ مِنْ محلول كلوريد البوتاسيومِ. قم بتوصيل طرف القياس بالمخزن المؤقت على قطب جسر الملح.قم بتوصيل قطب الملح وكهربة الأقطاب المرجعية بمكبر للصوت. عند هذه النقطة، تعليق القطب جسر الملح في حل العازلة مع القطب المرجعي. يوجد تمثيل للتكوين الخاص بالتجربة في هذا التخطيطي.خلال التجربة، سوف تتشكل الغشاء في نهاية العازلة التي تحتوي على ماصة. جمع البيانات للعثور على قدرة الغشاء. القيام بذلك عن طريق تطبيق إشارة الجهد الثلاثي بالتناوب لإنشاء استجابة مستطيلة بالتناوب الحالية.بعد ذلك ، العثور على تسيير والجهد في صفر الحالية. أتمتة تطبيق منحدر الجهد تتراوح بين ناقص 50 إلى 50 millivolts وتسجيل التيار. احتواء دالة خطية للبيانات.المنحدر هو الاتّار، تقاطع x هو الجهد عند مستوى الصفر. عند الانتهاء من إزالة طرف القياس من جسر الملح. املأ طرف قياس جديد بالمخزن المؤقت، وقم بضبطه مع قيمة pH مختلفة لإعداد تدرج بروتوني عبر الغشاء.إعادة إنشاء مجموعة تجريبية مع طرف قياس جديدة وأقطاب من أجل تكرار القياسات. وهنا تمثل التسجيلات التيار الجهد في وجود التدرج درجة الحرارة. و، في غياب التدرج في مستوى الـ (PH).تمثل الخطوط تناسب خطي للبيانات. يتم توقع التحول في نقطة تقاطع المحور س لقيم درجة PH مختلفة بواسطة Nernst المعادلة. وتمثل هذه البيانات التحول في إمكانية الغشاء في الوقت المناسب لأقطاب كلوريد الفضة القياسية باللون الأبيض، وكهربة جسر الملح الصغير أجار باللون الأسود.وكان قطب جسر الملح أجار أكثر استقرارا مع تحول الحد الأقصى من أقل من خمسة ملليفولت على مدى 300 ثانية من القياس. في هذه المؤامرة من التحول المحتمل كدالة للتدرج pH وينظر إلى اثنين من الأقطاب تتصرف بشكل مختلف بشكل كبير كما يزيد التدرج pH. ويمكن العثور على معدل دوران البروتون ومقارنتها لأنواع القطبين.هنا أرقام دوران البروتون المحددة للبروتين الميتوكوندريا فك البروتين واحد UCP1 تقاس بواسطة القطب جسر الملح مقارنة القطب القياسي. وهناك أيضا بيانات عن UCP3 أعدت بالمثل. معدلات تبدو أكثر دقة مع القطب جسر الملح أجار.أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تتأكد من أن القطب يخترق محلول الملح أجار. يجب أن جسر الملح أيضا تراجع في حل العازلة. وأخيرا، تأكد من أن محلول الملح أجار لا يحتوي على فقاعات الهواء.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Neuroscience

Unit 1

Direct-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

A-متعدد القطب نظام التصحيح، المشبك بمساعدة الحاسوب

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

تصميم وتصنيع وخفيفة الوزن، قابل للتعديل تحقيقات متعددة القطب للتسجيلات الكهربية في الفئران

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

إعداد متشابك غشاء البلازما والبروتينات الكثافة بعد المشبكي باستخدام التدرج السكروز متقطع

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

تحديد التعبير عن سطح الخلية ومعدل إندوسيتيك من البروتينات في الثقافات أستروسيت الابتدائية باستخدام بيوتينيلاتيون

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

الزرع المزمن للصفائف متعددة البوليمرات المرنة

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

الامتزاز الجزيئي المستحث بالضوء من البروتينات باستخدام نظام بريمو لزخرفه الصغرى لدراسة استجابات الخلايا للبروتينات المصفوفة خارج الخلية

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...