Name: a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den østrigske forskningsfond (P31559-B20 til E.E.P.). Forfatterne takke Sarah Bardakji for den fremragende teknisk bistand i produktionen og rekonstituering af mus UCP1 og UCP3 i proteoliposomes.

1. produktionen af rekombinant frakobling proteiner (UCPs) og dannelse af Planar tolagede membraner
<ol><li>Producere rekombinant UCP1 og UCP3 som beskrevet af Rupprecht et al. 9 og Hilse et al. 10
</li>
	<li>Udgør planar tolagede membraner på spidsen af konventionelle undværes plast pipetter, som beskrevet af Beck et al. 7
</li>
</ol>2. forberedelse af mikro-agar Salt bro elektrode
<ol><li>Justere en microcapillary pipette tip (Se Tabel af materialer) i passende længde.<ol>
<li>Mark positionen på en tom tip som buffer-holdige spidsen vil være knyttet til og bruge en glidende caliper til at måle længden af mikro-agar salt bro elektrode. Forsigtig: Microcapillary spidsen skal være lang nok til at angive bufferopløsning for målingerne.</li>
		<li>Skåret microcapillary spidsen med en skarp kniv eller blade og rense snitfladen med ethanol og vand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede den AgCl-beklædt elektrode.<ol>
<li>Afskære en Ag wire ca 8 cm i længden og rense det med ethanol og vand.</li>
		<li>Tag et stykke sandpapir og glat ned overfladen af 1 cm længde for enden af kablet, som skal være i kontakt med en saltopløsning.</li>
		<li>Dyppe den glattede ende i en 3 M KCl-opløsning og pels det elektrokemisk med klorid ved hjælp af en DC forsyning på 1,5 V for 10 s.</li>
		<li>Ren elektrode med vand, tør det og justere længden af AgCl-elektrode fra ubestrøget side, så det trænger microcapillary tip så dybt som muligt. Bemærk: Protokollen kan pause her.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede en 3 M KCl saltopløsning med 1% (v/v) agarosegelelektroforese.<ol>
<li>4.47 g af KCl der afvejes og opløses i 20 mL vand ved omrøring det i en kolbe.</li>
		<li>Fjerne omrøreren, afvejes 0,2 g af agarosegelelektroforese, og tilføje det til kolben.</li>
		<li>Varme op løsning til 100 ° C for at smelte Agarosen og forhindre det i at størkne. Forsigtig: Kolben vil være meget varmt. Rør ikke ved det med bare hænder. Brug handsker til håndtering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fyld microcapillary spidsen med Agarosen saltopløsning. Forsigtig: Løsningen er varmt. Beskytte hænder og arbejde omhyggeligt for at undgå stænk.<ol>
<li>Hvis Agarosen begynder clotting, varme op saltopløsning til fuldt smelte Agarosen igen.</li>
		<li>Suge 10 µL af agar saltopløsning ind i microcapillary spidsen. Suge det langsomt og omhyggeligt at undgå luft bobler i spidsen.</li>
		<li>Fjern spidsen fra pipetten og skubbe i AgCl-elektrode fra den bredere side af spidsen. Sikre, at elektroden trænger den saltopløsning.</li>
		<li>Køle ned elektrode til stuetemperatur og sætter det ind i forstærkeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede bufferen for målingerne.<ol>
<li>Afvejes 0.710 g Na2SO4, 0.195 g af MES, 0.121 g af TRIS og 0,023 g af EGTA, derefter tilsættes 100 mL destilleret vand til et bægerglas og opløsningen omrøres.</li>
		<li>Indskrive nemlig bufferen pH-værdi ved hjælp af en pH elektrode og justere pH-værdien til 7,32.</li>
		<li>Kontroller, at reference elektroden og agar salt bro elektrode i elektrisk kontakt.<ol>
<li>Der tilsættes 1 mL af buffer til en plastikbeholder.</li>
			<li>Dyp i referenceelektrode og agar salt bro elektrode og kontrollere et signal svar. Hvis signalet svar er korrekte, Fortsæt til trin 2.7.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hvis der er en falsk signal svar eller ingen elektrisk kontakt overhovedet, udføre den efter fejlfinding.<ol>
<li>Kontroller elektrode er i kontakt med den saltopløsning og skubbe elektroden i løsningen. Bemærk: Hvis løsningen er allerede alt for klistret, fjerne mikro-agar salt broen og forberede et nyt microcapillary tip.</li>
		<li>Kontrollere, om der er luftbobler i den saltopløsning. Hvis ja, forberede et nyt microcapillary tip.</li>
		<li>Kontrollere, om den saltopløsning er i kontakt med stødpudeopløsning. Hvis ikke, så afbrød en anden 1 mm tube ende af spidsen. Forsigtig: Sørg for at spidsen er stadig længe nok til at trænge igennem den buffer-holdige spids. Hvis der er stadig ingen kontakt, forberede et nyt microcapillary tip.</li>
		<li>Hvis ingen af disse trin hjælper, forberede et nyt microcapillary tip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Til opbevaring, dyppe agar salt bro elektrode i en 3 M KCl-opløsning. Bemærk: Protokollen kan standses her. For en pause natten, gemme elektroden i 3 M KCl saltopløsning ved 4 ° C.</li>
	<li>Forberede den buffer-holdige plastik tip. Bemærk: Hvis elektroden blev gemt natten, tage det og lad det varme op til stuetemperatur i 30 min.<ol>
<li>Tage et microcapillary tip og bøje rør, 2 cm fra kanten af den smalle del, ca. 90 grader ved hjælp af en varme ledning.</li>
		<li>Brug en meget skarp kniv eller blade og skåret ud røret omkring 5 mm fra bøje.</li>
		<li>Ren overflade for enden med ethanol og vand og måle diameter af hullet i spidsen. Fra dette, beregne området i overfladen.</li>
		<li>Coat overfladen af tip med 85:15 (v: v) hexan: hexadecane.<ol>
<li>Tilsæt 3 µL opløsningsmiddel og fjerne det fra spidsen.</li>
			<li>Vent 1 min., således at alle de resterende opløsningsmiddel i spidsen er fordampet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fyld måling spidsen med 3 µL af buffer og sætte den ind på salt bro elektrode. Bemærk: Spørg igen hvis salt bro elektrode og referenceelektrode er elektrisk kontakt ved at udføre trin 2.5.3.</li>
		<li>Hvis der er ingen elektrisk kontakt, kontrollere, om følgende:<ol>
<li>Kontrollere, om salt bro elektrode er i kontakt med stødpudeopløsning. Hvis ikke, så enten øge mængden af buffer i spidsen eller forberede en længere microcapillary spids.</li>
			<li>Hvis der er en luftboble, fjerne spidsen fra mikro-salt bro elektrode, refill buffer i spidsen, og slut det til elektroden igen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. måling af de elektriske parametre af membranen rekonstitueres med rekombinante Protein
<ol><li>Anvende en trekantet skiftende spænding signal med maksimal spænding Umax = 50 mV og ΔTrampe = 50 ms, hvilket skaber en rektangulær vekselstrøm svar. Fra de gennemsnitlige værdier af positive og negative strømme (+ og jeg-), beregne kapacitet af membran efter følgende formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>Anvende en spænding rampe spænder fra -50 mV til + 50 mV og post aktuelt. Passer en lineær funktion til data - hældningen er ledningsevne - og beregne x-aksen skæringspunkt fit.</li>
	<li>Decharge løsning i den plastik tip og udfylde et nyt med en buffer, som indeholder en øget substratkoncentrationen.<ol>
<li>Hvis ingen membran er dannet inden for de første 20-30 s, decharge volumen og genopfylde det. Dette sikrer, at koncentration forløb på tværs af membranen ikke væsentligt ændrer under membran dannelse.</li>
		<li>Efter dannelsen af en membran, skal du udføre trin 3.1 og 3.2 igen for at bekræfte korrekte membran dannelse og at få x-aksen skæringspunkt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. beregning af substrat omsætningshastighed
Bemærk: Se tidligere arbejde for detaljer3,7.
<ol><li>Vurdere mængden af protein i membran fra molekylvægt af lipid og protein (MLipid og Mproteiner), området af membranen og et lipid hoved gruppe (enmembran og etLipid) og masse forholdet mellem protein pr. lipid (r). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Beregne Nernst potentiale for de transporterede substrat. R er konstanten gas, T temperatur, z afgift af den transporterede substrat, F Faradays konstant, og c1 og c2 koncentrationen af substratet i begge sider af membranen. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>Fra de nuværende spænding optagelser, tage omvendt potentielle beregnet med forskellen i x-aksen skæringspunkter fra de lineære passer i tilstedeværelse og fravær af substrat gradient.</li>
	<li>Beregne andelen af substrat ledningsevne, Gsubstrat, til den samlede membran ledningsevne, Gsamlede, af forholdet mellem omvendt potentiale til Nernst potentielle11. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Beregne substrat omsætning nummer ΔNsubstrat pr. gang enhed ΔT fra substrat ledningsevne (Gsubstrat), den anvendte spænding U og beregning af substrat z: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>Beregn omsætning sats κ fra forholdet mellem transporteres substrat pr. gang til antallet af proteiner. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+research+in+drug+discovery.">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li><li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+chloride+electrode:+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents.">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li><li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+kinetics+of+uncoupling+proteins.+Analysis+of+UCP1+reconstituted+in+planar+lipid+bilayers.">Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+human+uncoupling+proteins+1+and+2+in+planar+lipid+bilayers.">Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers.</a> The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).</li><li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+intrapipette+salt+bridge.">A simple intrapipette salt bridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+technique+for+the+reconstitution+of+hydrophobic+proteins+into+planar+bilayer+membranes.+Studies+of+human+recombinant+uncoupling+protein+1.">A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li><li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate.">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li><li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak.">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li><li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue.">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li><li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology.">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li><li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices.">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Gennemførelsen af mikro-agar salt broen med elektroden minimerer sine potentielle diffusion og giver mere præcise målinger af membran potentiale genereret af en pH gradient. I nærværelse af forskellige transmembrane pH forløb, de potentielle skift af begge elektroderne var acceptabel på ΔpH = 0,35 hvor sammenligner hen til den teoretiske værdi af Nernst ligevægt potentielle (ΦNernst = 23,8 mV for ΔpH = 0,4). Dog på flere fysiologiske pH forløb, som for forekomst i mitokondrierne mellem matrix og intermembrane plads, den standard AgCl-elektrode undladt at nøjagtigt måle den potentielle skift på ΔpH = 1 (fig. 3A). Elektroden bro med mikro-agar salt leveret de værdier, som var meget mere sammenlignelig med teorien.
Diffusion potentielle kan også forekomme på AgCl referenceelektrode, hvis stødpudeopløsning er ændret under eksperimentet. Chlorid-fri stødpudeopløsning blev brugt i eksperimenterne, da frakobling proteiner blev foreslået for at transportere chloridioner, og pH var justeret ved hjælp af Tris eller MES. Elektrode potentiale, i mangel af en betydelig koncentration af chlorid, afhænger først og fremmest chlorid urenheder i stødpudeopløsning. Dens sammensætning er uændret under forsøgene, vil det blot resultere i en konstant offset potentiale. Dog til måling af en absolut potentielle forskel mellem de to elektroder, kunne en simpel agar salt-bridge system (Ag/AgCl 3 M KCl) også bruges til referenceelektrode.
En mikro-agar salt bro balancerer diffusion potentielle ved en ækvilibrering af elektrode potentielle. For at stabilisere den saltopløsning, blev 1% (w/v) Agarosen tilføjet for at forhindre blanding af saltopløsning med en stødpudeopløsning. Salt ioner K+ og Cl- har lignende mobilitetsophold i væske og afveje de potentielle elektrode. Til korrekt installere salt-broen, har agar saltopløsning til opvarmes tilstrækkeligt, at fylde microcapillary spidsen uden eventuelle luftbobler og dække AgCl-elektrode. Inden yderligere forbrug har elektrisk kontakt mellem salt bro elektrode og referenceelektrode skal kontrolleres. Afhængigt af den tid det salt bridge bruges, har den saltopløsning til at være tilstrækkeligt geléagtig for at forebygge enhver sammenblanding af den saltopløsning med bufferen. Dette er især kritisk, hvis K+ eller Cl- transportvirksomheder er undersøgt. Salt broen blev brugt for meget kort tid og eluering af Agarosen er ubetydelig i dette tidsinterval. En højere koncentration af Agarosen af op til 5% eller agar (3% - 5%), giver mulighed for ved hjælp af salt broen i en længere periode af tid6,12.
Metoden tillader bestemmelse af transport kinetik af en membran transporter (i) med lav omsætning satser og (ii) af mitokondrielle proteiner i den indre membran, der næppe kunne undersøges i standard patch klemme set-ups13. Dens præcision er primært afhængig af reverse potentielle måling, hvor nøjagtighed er faldet på en lav samlede membran ledningsevne og lille koncentration forløb, som inducerer en membran potentiale under støj af optagelse.
Med dette set-up, blev omsætning satser af UCP1 og UCP3 som produceres under samme betingelser målt. På grund af den højere pH gradient synes de opnåede priser at være mere præcise og uforstyrrede af artefakter som følge af mindre elektrode potentielle Skift. Det kan bruges til yderligere analysere og sammenligne mitokondrielle membran transportvirksomheder produceres under lignende forhold.

Membranproteiner er målrettet med op til 60% af alle kendte lægemidler1. Elektrofysiologiske målinger af membranproteiner er en kraftfuld, men delikat værktøj til at analysere electrogenic transport af substrater medieret af carrier Membranproteiner. Graduering af den transmembrane aktuelle ved anvendelse af konstante spændinger eller spænding ramper giver mulighed for vurdering af de farmakologiske og fysiske egenskaber af luftfartsselskaberne, for eksempel, aktivering og hæmning af substrater eller transport kinetik. Af særlig interesse er substrat omsætning tal, der viser mængden af substrat, der er omplantes af en membran protein pr. tidsenhed. Det er en vigtig parameter, når man sammenligner kinetik af forskellige Membranproteiner. Oprettelse af en koncentration graduering af ladede underlaget på tværs af membranen genererer en elektromotoriske kraft hvorfra omsætning antallet af substratet er udledt.
Brug en AgCl-elektrode, skaber tilstedeværelsen af en klorid-fri buffer en diffusion potentiale, der ændrer elektrode potentielle og fører til et skift i nuværende spænding målinger2. Skønt altid til stede, det er ubetydelig for standard ledningsevne og -kapacitet, da disse parametre er enten afhængig af hældning af den nuværende spænding optagelse (konduktans) eller er forskellen på en enkelt optagelse (kapacitet), som annullerer potentiale. Dog kan optagelsen af den omvendte potentiale, som er lavet af transport af substrat, forstyrres betydeligt ved diffusion potentielle. Således nøjagtige målinger af den omvendte potentiale skal elektrode-potentialer holdes konstant.
Diffusion potentielle kan minimeres ved hjælp af to metoder: (i) i deltagelse af et dobbeltlag membran, har en substratkoncentrationen øges på den ene side af membranen3,4, eller (ii) en salt bro saldi elektrode potentielle 5. den første metode er meget afhængige af stabilitet i målingerne. Membranen skal overleve i flere minutter ved tilsætning af substrat under omrøring indtil substratet er næsten jævnt fordelt på løsningen. Hvis membranen bristninger i mellem, substrat gradient er ændret af den frie udveksling af ladede molekyler, og målinger Drej unøjagtige. Sidstnævnte metode saldi diffusion potentielle men er begrænset af størrelsen af set-up. Gennemføre en lille men velfungerende salt broen i en mikro spænder til en elektrofysiologiske set-up er udfordrende6. For sidstnævnte metode er den saltopløsning fyldes i et microcapillary tip og stabiliseret ved tilsætning af Agarosen at forhindre udbredelsen af den saltopløsning til stødpudeopløsning.
I denne protokol, er der beskrevet en ligetil produktion af en mikro-agar salt bro og gennemførelsen i en elektrofysiologiske set-up baseret på pipette set-up7 . Et microcapillary tip er tilpasset både til at indeholde en 3 M KCl-opløsning med 1 mol % (w/v) Agarosen og at slå bro over en AgCl-elektrode og buffer løsning. Fordelen ved den mikro-salt bro vises tidsregistreringer af elektrode potentielle Skift og de mere præcise målinger af membran potentiale på forskellige pH forløb. I modelsystemet af rekombinante proteiner fremstillet i Liposomer, er omsætning satser af mitokondrie luftfartsselskaber UCP1 og UCP3 produceres under lignende forhold igen og i forhold til tidligere resultater3,8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:325px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:345px;">5242956.003</td>
			<td style="width:167px;">Microcapillary pipette tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol 99%</td>
			<td>AustrAlco &#214;sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td>
			<td>AAAH-5020-07025-230317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kaliumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DC supply</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>V10/CPG 1940 -01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose Standard</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3810.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample tube</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>5863.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2SO4</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>8560.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MES</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>4256.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexadecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating wire</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>USPS-2250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins

Til dato, målrette mere end 50% af alle farmakologiske stoffer transport kinetik af membranproteiner. Den elektrofysiologiske karakterisering af membran transportør proteiner fremstillet i lipid tolagede membraner er en kraftfuld, men delikat metode til vurdering af deres fysisk-kemiske, farmakologiske egenskaber. Substrat omsætning nummer er en unik parameter, der giver mulighed for sammenligning af forskellige Membranproteiner aktivitet. I en electrogenic transport skaber graduering af de omplantede substrat en membran potentiale, som direkte korrelerer til substrat omsætning sats af protein. Via sølvchloridelektrode elektroder, induceret en diffusion potentiale, også kaldet flydende junction potentielle, som ændrer elektrode potentiale og betydeligt forstyrrer præcise membran potentielle målinger. Diffusion potentielle kan minimeres ved en salt bro, som afvejer elektrode potentiale. I denne artikel, er en mikro-agar salt broen designet til at forbedre den elektrofysiologiske set-up, der bruger Mikropipetter til membran dannelse. Den saltopløsning fyldes i en microcapillary pipette tip, stabiliseret ved tilsætning af agarosegelelektroforese, og let kan monteres på en standard elektrode. Elektrode potentialet i en mikro-salt bro elektrode er mere stabil i forhold til en standard elektrode. Gennemførelsen af dette system stabiliserer elektrode potentielle og giver mere præcise målinger af membran potentiale genereret af en pH gradient. Ved hjælp af dette system, er proton omsætning satser mitokondrie luftfartsselskaber UCP1 og UCP3 igen og sammenlignet med tidligere målinger.

For at kontrollere minimering af potentielle diffusion, blev stabiliteten af de nuværende spænding målinger af en intakt membran målt. I figur 2A, er repræsentant-aktuelle spænding optagelser afbildet i tilstedeværelse (hvide prikker) og fravær (sorte prikker) på en graduering, pH. Ifølge Nernst-ligningen inducerer pH gradient et skift i spænding. Den potentielle Skift er beregnet ud fra skæringspunktet x-aksen i en lineær passer til dataene. For at teste både elektroder, blev skift i x-aksen skæringspunkt analyseret for en standard AgCl-elektrode (figur 2B, hvide prikker) og mikro-agar salt bro (figur 2B, sorte prikker). En spænding rampe var optaget ti gange i træk og den gennemsnitlige skift i x-aksen er afbildet mod tiden. Paa agar salt bro elektrode havde en maksimal skift af mindre end 5 mV selv efter 300 sekunder af måling, den standard elektrode varierede op til 30 mV i uforudsigelige, tilfældige adfærd.
Næste, begge elektroder blev testet på forskellige pH forløb (fig. 3A). For standard elektroden, blev en pH gradient 0,35 og 1,0 (hvide prikker) genereret; agar salt bro elektrode, pH gradienter 0,35, 0,7 og 1,0 (sorte prikker). Skift i potentiale blev analyseret i tre uafhængige målinger. I modsætning til en graduering af 0,35, hvor den målte Skift kun varierer lidt, ændrer spænding Skift væsentligt på pH graduering af 1.0 i mangel af mikro-agar salt broen. Fra en lineær passer til dataene er hældningen af funktionen 26,4 ± 2.3 mV/ΔpH for den standard elektrode og 50.1 ± 4,6 mV/ΔpH for mikro-agar salt bro elektrode. Ifølge Nernst-ligningen, er den beregnede potentielle Skift 60,7 mV/ΔpH til T = 32 ° C.
Ved hjælp af mikro-agar salt broen, nummeret proton omsætning blev κ af mitokondrie UCP1 og UCP3 målt og sammenlignet med tidligere målinger (fig. 3B). Svarende til figur 3A, ΔpH = 1,0 blev genereret og omvendt potentiale blev målt. Mængden af protein i membranen blev anslået ud fra formlen i afsnit 4 i protokollen, protein lipid-forhold på 4 µg / (mg af lipid), en molekylvægt 33.000, og 750 Da for proteiner og lipid, en membran areal af 3.53 x 10 -4 cm2, og et areal pr. lipid af 7,8 x 10-15 cm2. De opnåede κwas 5,56 ± 0,38 s-1 og 4,10 ± 0,71 s-1 for UCP1 og UCP3, henholdsvis (fig. 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> Figur 1 : Den elektrofysiologiske set-up med mikro-agar salt broen. (A) dette panel viser en skitse over set-up. Microcapillary spidsen indeholdende agar saltopløsning (afbildet i orange) er placeret mellem elektrode (sort) og den buffer-holdige spids (blå). Membranen er dannet på overfladen ved slutningen af den buffer-holdige spids (angivet med pilen). (B) dette panel viser et billede af den elektrofysiologiske set-up med gennemførelsen af mikro-agar salt broen. Pilene peger på elektroden, mikro-agar salt broen, referenceelektrode og container med bufferopløsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> Figur 2 : Sammenligning af en mikro-agar salt bro og en standard AgCl-elektrode. (A) dette panel viser en repræsentativ nuværende spænding måling i tilstedeværelse (grå prikker) og fravær (hvide prikker) på en pH graduering af 1. Linjerne repræsenterer en lineær passer til de data, fra hvilke ledningsevne og x-aksen skæringspunktet værdier er opnået. Spænding Skift er evalueret af forskellen på skæringspunktet værdier af begge optagelser. (B) dette panel viser skift af membran potentiale i en standard AgCl-elektrode (hvide prikker) til en mikro-agar salt bro elektrode (sorte prikker) i gang. Ti aktuelle spænding målinger blev indspillet i en række og den gennemsnitlige spænding Skift ved diffusion potentielle afbildes som funktion af tiden. I alle eksperimenter, blev membranen foretaget af 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueres med 15 mol % arachidonic syre i en koncentration på 1,5 mg/mL. Bufferen, der indeholdt 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS og 0,6 mM EGTA ved pH = 7.34 og T = 32 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> Figur 3 : Proton omsætning antal UCP1 og UCP3 beregnes ud fra den omvendte potentiale i overværelse af en pH gradient. (A) dette panel viser skiftet i potentialet i en UCP1-holdige membran af forskellige pH forløb af en standard AgCl-elektrode (hvide prikker) og en mikro-agar salt bro elektrode (sorte prikker). Linjerne repræsenterer en lineær passer til dataene. (B) dette panel viser proton omsætning antallet af UCP1 (første datasæt) og UCP3 (andet datasæt) som beregnet fra forholdet mellem spænding Skift til Nernst potentiale overensstemmelse med formlerne i punkt 4 i protokollen. Den første bar i hvert sæt repræsenterer omsætning satser målt med mikro-agar salt broen. Den anden søjle af hvert datasæt repræsenterer tidligere målinger ved hjælp af en standard AgCl-elektrode. Værdier for UCP1 og UCP3 blev taget fra Urbankovaet al. 3 og Macher et al. 8. alle målinger, membranen blev foretaget af 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueres med 15 mol % AA og UCP1/UCP3. Koncentrationen af lipid og protein var 1,5 mg/mL og 4 µg/mg af lipid, henholdsvis. Bufferen, der indeholdt 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS og 0,6 mM EGTA ved pH = 7.34 og T = 32 ° C. PH buffer for gradient målingerne var steget til 7,66, 8,00 eller 8.33 ved at tilføje TRIS og blev ændret i den løsning-holdige pipette. Værdierne er gennemsnit ± standardafvigelse af tre uafhængige målinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

I elektrofysiologiske målinger forstyrrer tilstedeværelsen af en diffusion potentielle den præcise måling af den omvendte potentiale ved at ændre den potentielle elektrode. Ved hjælp af en mikro-agar salt bro, er betydning af diffusion potentielle minimeret, som giver mulighed for en mere præcis måling af substrat omsætning numre af rekonstitueret rekombinant Membranproteiner.

En mikro-agar Salt bro elektrode til at analysere Proton omsætning sats af rekombinant Membranproteiner

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Denne metode kan hjælpe med undersøgelse af membran proteiner såsom transportører og kanaler. Oplysningerne om tab af substratomet omsætningshastighed, der sammenligner proteinaktivitet og specificitet og de forskellige fysiologiske og patologiske forhold. Den største fordel ved denne teknik er, at den minimerer potentielle skiftvariationer og kloridfrie bufferbetingelser.Og øger præcisionen af omsætningshastighedsbestemmelsen på grund af mere nøjagtige membranpotentialemålinger. Saml elementerne til knytnævetrinnene. Disse omfatter to mikro-kapillær pipettespidser, en skarp klinge og en glidende caliper.For elektroden har sølvtråd, sandpapir og en tre molar kaliumchloridopløsning ved hånden. Derudover har ethanol og vand til rengøring og en DC strømforsyning. Fortsæt ved at arbejde med de to mikropipettespidser.Start med det tip, der skal indeholde bufferen. Placer det andet tip ved siden af den første. Flyt den anden spids, så når den indsættes, vil den smalle del strække sig mindst fem millimeter ind i den smalle del af den første.Marker den position, hvor den første buffer, der indeholder spidsen, vil blive fastgjort. Brug derefter caliper til at måle længden af mikro-agar salt bro elektrode. Brug klingen til at skære spidsen til den rette længde.Rengør snitoverfladen med ethanol efterfulgt af vand. Dernæst får en længde på cirka otte centimeter sølvtråd til elektroden. Rengør tråden på klude med ethanol efterfulgt af vand.Efter rengøring, bruge sandpapir til at glatte overfladen på en en centimeter længde i den ene ende. Denne ledning med sin glattede ende er klar til at blive elektro-kemisk belagt. Sæt den glattede ende i kaliumchloridopløsningen med den anden ende tilsluttet en DC strømforsyning til overfladebehandling.Når elektroden er belagt, skal den afbrydes, og den rengøres med vand. Efter tørring det, bestemme den længde, der gør det muligt at trænge ind i mikro kapillær spids så dybt som muligt. Skær elektroden fra den ubestrøget side til den rette længde.Nu, gå videre til at forberede en saltopløsning med agarose. I en kolbe, der indeholder vand opløse kaliumchlorid og bruge en magnetisk omrører til at støtte blanding. Efter fjernelse af omrøreren tilsættes agarose til kolben.Tag kolben til en mikrobølgeovn og varme den til at smelte agarose på omkring 100 grader Celsius. Tag den ud for visuelt at kontrollere, at agarose er opløst helt. Når agarose er opløst pipette 10 mikroliter i mikro-kapillær langsomt for at undgå luftbobler.Det er vigtigt omhyggeligt at pipette agar saltopløsningen i mikrokapillær spidsen, især ved høje agarkoncentrationer. Hvis ikke gjort ordentligt luftbobler er let produceres i spidsen og blokere elektrisk flow. Når du har fjernet spidsen fra pipetten, skubbes elektroden ind i den.Sørg for, at elektroden trænger ind i saltopløsningen. Når elektroden er ved stuetemperatur, sættes den i en referenceelektrode i en forstærker. Støt referenceelektroden, så den kan sænkes ned i en plastbeholder med en en milliliter buffer.Derefter dyppe saltbro elektroden i opløsningen. Anvend en spænding, og kontroller, at der er et aktuelt svar, før du fortsætter. Hvis testen lykkes, skal elektroderne afbrydes.Hvis det er nødvendigt, opbevares saltbroelektroden ved at dyppe den i en tre molarkalumchloridopløsning. Derefter forberedes bufferen, der indeholder plastspids. Tag en mikro kapillær spids og identificere et punkt to centimeter fra den smalle del.Brug en varmeledning til at bøje røret 90 grader i denne position. Med en skarp kniv skære røret fem millimeter fra bøjet. Rengør det område, der blev skåret med ethanol efterfulgt af vand.Før du fortsætter, skal du bruge et lysmikroskop med en skala til at måle hullets diameter ved spidsen. Dernæst flytte pipetten til at være i nærheden af en beholder med opløsningsmiddel og en anden af buffer. Pipetter tre mikroliter af opløsningsmidlet ind og ud af spidsen.Dernæst fylde målingen spidsen med tre mikroliter af buffer. Hent saltbroen fra kaliumchloridopløsningen. Sæt målespidsen med bufferen på saltbroelektroden.Tilslut saltbroelektroden og referenceelektroden til en forstærker. På dette tidspunkt skal saltbroelektroden suspenderes i bufferopløsningen med referenceelektroden. En repræsentation af konfigurationen for eksperimentet findes i dette skematisk.Under forsøget dannes membranen for enden af den buffer, der indeholder pipettet. Indsaml data for at finde membrankapaciteten. Gør dette ved at anvende et trekantet vekselspændingssignal for at skabe et rektangulært vekselstrømsrespons.Find derefter ledningsevne og spænding ved nulstrøm. Automatiser anvendelsen af en spændingsrampe, der spænder fra minus 50 til 50 millivolt, og ler strømmen. Tilpas en lineær funktion til dataene.Hældningen er ledningsevne, x-skæring er spændingen ved nul strøm. Når du er færdig, skal målespidsen fjernes fra saltbroen. Fyld en ny målespids med buffer, juster det til forskellige pH-værdi for at oprette en protongradient på tværs af membranen.Genskab den eksperimentelle opsætning med en ny målespids og elektroder for at gentage målingerne. Her er repræsentative strømspændingsoptagelser i nærværelse af en pH-gradient. Og i mangel af en pH-gradient.Linjerne repræsenterer en lineær tilpasning til dataene. Skiftet i x-aksens skæringspunkt for de forskellige pH-værdier forudsiges af Nernst-ligningen. Disse data repræsenterer skiftet i membranpotentialet i tide til en standard sølvchloridelektrode i hvid og mikro-agar saltbroelektroden i sort.Agar salt bro elektrode var mere stabil med en maksimal skift på mindre end fem millivolts over 300 sekunders måling. I dette plot af det potentielle skift som en funktion af pH gradient de to elektroder ses at opføre sig væsentligt forskelligt som pH gradient stiger. Protonomsætningshastigheden kan findes og sammenlignes for de to elektrodetyper.Her er proton omsætning numre bestemmes for mitokondriel afkobling protein en UCP1 målt ved salt bro elektrode sammenlignet med en standard elektrode. Der er også data for tilsvarende forberedt UCP3. Satserne synes mere præcise med agar salt bro elektrode.Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske at sikre, at elektroden trænger ind i agar salt opløsning. Saltbroen skal også dyppes i bufferopløsningen. Endelig skal du sørge for, at agar salt opløsning indeholder ingen luftbobler.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Neuroscience

Unit 1

Direct-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analyse af Synaptic vesikel Pool Replenishment i dyrkede cerebellare Granule Neuroner bruger FM Farvestoffer

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion og exocytose af membranproteiner i dyrkede neuroner vurderes ved hjælp af Fluorescens Recovery og Fluorescens-tab fotoblegning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

En computer-assisteret Multi-elektrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

Design og fabrikation af Ultralight Vægt, Justerbare multi-elektrode Sonder til elektrofysiologiske målinger i mus

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Fremstilling af Synaptic plasmamembranen og postsynaptiske Density Proteiner hjælp af en Diskontinuerlig sucrosegradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsafhængig stigning i netværksresponset til stimulering af neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bestemmelse af celleoverfladeekspression og endocytisk proteinhastighed i primære astrocytkulturer ved anvendelse af biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Kronisk implantation af flere fleksible polymer elektrode systemer

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Let induceret Molekylær adsorption af proteiner ved hjælp af PRIMO-systemet til Mikromønster for at studere celle respons på ekstracellulære matrix proteiner

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...