Name: a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 8 min 9 s
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Diese Arbeit wurde von der österreichischen Forschungsfonds (P31559-B20, E.E.P) unterstützt. Die Autoren danken Sarah Bardakji für die hervorragende technische Unterstützung bei der Herstellung und Wiederherstellung der Maus UCP1 und UCP3 in Proteoliposomes.

1. Produktion von rekombinanten Abkuppeln Proteinen (UCPs) und die Bildung von planaren Bilayer Membranen
<ol><li>Rekombinante UCP1 und UCP3 zu produzieren, wie von Rupprecht Et Al. beschrieben 9 und Hilse Et al. 10
</li>
	<li>Planare Bilayer Membranen an den Spitzen der konventionellen entbehrlich Kunststoff Pipetten zu bilden, wie von Beck Et Al. beschrieben 7
</li>
</ol>2. Vorbereitung der Mikro-Agar Salz Brücke Elektrode
<ol><li>Stellen Sie eine Microcapillary-Pipette auf die passende Länge tip (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Markieren Sie die Position auf einer leeren Spitze an dem der Puffer-haltigen Tipp wird zu angebracht werden und verwenden Sie eine gleitende Bremssattel messen Sie die Länge der Mikro-Agar Salzbrücke Elektrode. Achtung: Die Microcapillary Spitze lang genug, um für die Messungen die Pufferlösung eingeben muss.</li>
		<li>Schneiden Sie die Microcapillary-Spitze mit einem scharfen Messer oder einer Klinge und reinigen Sie die Schnittfläche mit Ethanol und Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die AgCl-beschichtete Elektrode.<ol>
<li>Ein Ag-Draht von ca. 8 cm in der Länge abgeschnitten und mit Ethanol und Wasser reinigen.</li>
		<li>Nehmen Sie ein Stück Schleifpapier und Glätten der Oberfläche von 1 cm Länge am Ende des Drahtes, die in Kontakt mit der Salzlösung sein sollte.</li>
		<li>Tauchen Sie die geglättete Ende in einer 3 M KCl-Lösung und streicht es elektrochemisch mit Chlorid mit DC-Versorgung bei 1,5 V für 10 s.</li>
		<li>Die Elektrode mit Wasser zu reinigen, trocknen, und passen Sie die Länge der AgCl Elektrode von der unbeschichteten Seite, so dass es dringt in die Microcapillary Spitze so tief wie möglich. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine 3 M KCl-Salz-Lösung mit 1 % (V/V) Agarose.<ol>
<li>Wiegen Sie 4,47 g KCl und durch Rühren in einem Kolben in 20 mL Wasser auflösen.</li>
		<li>Entfernen des Rührers, Abwiegen 0,2 g Agarose, und fügen Sie es in den Kolben.</li>
		<li>Die Lösung auf 100 ° C zu schmelzen die Agarose und verhindern, dass die Gerinnung erwärmen. Achtung: Die Küvette wird sehr heiß. Nicht mit bloßen Händen berühren. Benutzen Sie Handschuhe für das Handling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füllen Sie Microcapillary Tipp mit der Agarose Salzlösung. Achtung: Die Lösung ist heiß. Schutz der Hände und arbeiten sorgfältig, um Spritzer zu vermeiden.<ol>
<li>Wenn die Agarose beginnt, Gerinnung, erwärmen Sie die Salzlösung die Agarose vollständig wieder zu schmelzen.</li>
		<li>Tränken Sie 10 µL der Agar Salzlösung in die Microcapillary Spitze. Saugen sie langsam und sorgfältig zu Luft sprudelt in der Spitze.</li>
		<li>Entfernen Sie die Spitze aus der Pipette und drücken Sie die AgCl-Elektrode von der breiten Seite der Spitze. Sicherstellen Sie, dass die Elektrode dringt in die Salzlösung.</li>
		<li>Die Elektrode auf Raumtemperatur kühlen Sie ab und stecken Sie es in den Verstärker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie den Puffer für die Messungen.<ol>
<li>Wiegen, 0,710 g Na2SO4, 0,195 g MES, 0,121 g TRIS und 0,023 g EGTA, dann ein Becherglas 100 mL destilliertes Wasser hinzu und rühren Sie die Lösung.</li>
		<li>Überprüfen Sie für den pH-Wert des Puffers mit einer pH-Elektrode und passen Sie den pH-Wert auf 7,32.</li>
		<li>Prüfen Sie die Bezugselektrode und Agar Salzbrücke Elektrode in elektrischem Kontakt.<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL des Puffers zu einem Kunststoff-Behälter.</li>
			<li>Tauchen Sie ein in die Bezugselektrode und Agar Salzbrücke Elektrode und überprüfen Sie, ob eine Signalantwort. Wenn die Signalantwort korrekt ist, fahren Sie mit Schritt 2.7.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn überhaupt gibt es auch ein falsches Signalantwort oder kein elektrischer Kontakt, führen Sie die folgenden Problembehandlung.<ol>
<li>Überprüfen Sie, ob die Elektrode in Kontakt mit der Salzlösung und drücken Sie die Elektrode in die Lösung. Hinweis: Wenn die Lösung bereits zu klebrig ist, entfernen Sie die Micro-Agar Salzbrücke und bereiten Sie eine neue Microcapillary-Spitze.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob Luftblasen innerhalb der Salzlösung. Wenn ja, bereiten Sie eine neue Microcapillary-Spitze.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob die Salzlösung in Kontakt mit der Pufferlösung. Wenn dies nicht der Fall ist, dann ein weiteres 1 mm vom Rohr-Ende der Spitze abschneiden. Vorsicht: Achten Sie darauf, dass die Spitze noch lange genug, um die Puffer-haltigen Spitze zu durchdringen. Wenn es noch keinen Kontakt, bereiten Sie eine neue Microcapillary-Spitze.</li>
		<li>Wenn keiner dieser Schritte helfen, bereiten Sie eine neue Microcapillary-Spitze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauchen Sie für die Lagerung die Agar Salzbrücke Elektrode in eine 3 M KCl-Lösung. Hinweis: Das Protokoll kann hier eingestellt werden. Für eine Pause über Nacht, Lagern Sie die Elektrode in 3 M KCl-Lösung bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Puffer-haltigen Kunststoffspitze. Hinweis: Wenn die Elektrode über Nacht gelagert wurde, nehmen Sie es aus und lassen sie Hitze bis zu 30 min bei Raumtemperatur.<ol>
<li>Werfen Sie einen Microcapillary Tipp und biegen Sie das Rohr 2 cm vom Rand des schmalen Teil, ungefähr 90 Grad mit einem Heizdraht.</li>
		<li>Verwenden Sie ein sehr scharfes Messer oder Messer und schneiden Sie den Schlauch ca. 5 mm von der Biegung.</li>
		<li>Reinigen Sie die Oberfläche am Ende mit Ethanol und Wasser und Messen Sie den Durchmesser der Bohrung der Spitze. Berechnen Sie aus diesem Grund die Fläche der Oberfläche.</li>
		<li>Bestreichen Sie die Oberfläche der Spitze mit 85:15 (V: V) Hexan: Hexadecan.<ol>
<li>Pipette 3 µL des Lösungsmittels und entfernen Sie es von der Spitze.</li>
			<li>Warten Sie 1 min, so dass alle das restliche Lösungsmittel in der Spitze verdampft.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Füllen Sie die Messspitze mit 3 µL Puffer und stecken Sie es auf die Salzbrücke Elektrode. Hinweis: Überprüfen Sie erneut, wenn die Salzbrücke Elektrode und die Bezugselektrode in elektrischem Kontakt mit Schritt 2.5.3.</li>
		<li>Wenn es keine elektrischen Kontakt, überprüfen Sie Folgendes:<ol>
<li>Überprüfen Sie, ob die Salzbrücke Elektrode in Kontakt mit der Pufferlösung ist. Wenn dies nicht der Fall ist, dann erhöhen Sie die Lautstärke des Puffers in der Spitze oder bereiten Sie einen längeren Microcapillary Tipp.</li>
			<li>Ist eine Luftblase, entfernen Sie die Spitze von der Mikro-Salz-Brücke-Elektrode, Nachfüllen des Puffers in der Spitze, und stecken Sie es wieder in die Elektrode.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Messung der elektrischen Parameter der Membran rekonstituiert mit rekombinanten Proteinen
<ol><li>Anwenden einer dreieckigen abwechselnd Spannungssignal mit maximaler Spannung Umax = 50 mV und ΔTRampe = 50 ms, schafft eine rechteckige Wechselstrom-Antwort. Aus den Mittelwerten der positiven und negativen Strömungen (ich+ und ich–) die Kapazität der Membran nach folgender Formel zu berechnen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>Gelten eine Spannungsrampe reicht von-50 mV bis + 50 mV und den aktuellen Datensatz. Eine lineare Funktion der Daten - die Steigung ist der Leitwert - fit und den x-Achse Schnittpunkt der Passung zu berechnen.</li>
	<li>Die Lösung in die Kunststoffspitze entladen und ein neues mit einem Puffer mit einer erhöhten Substratkonzentration zu füllen.<ol>
<li>Wenn innerhalb der ersten 20-30 s keine Membran gebildet wird, entladen Sie das Volumen und füllen Sie ihn. Dies garantiert, dass das Konzentrationsgefälle über die Membran nicht erheblich während der Membran Bildung ändert.</li>
		<li>Nach der Bildung einer Membran Schritte 3.1 und 3.2 wieder zu richtigen Membran Bildung zu überprüfen und um die x-Achse Schnittpunkt zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Berechnung der Substrat-Fluktuationsrate
Hinweis: Siehe Vorarbeiten für Details3,7.
<ol><li>Schätzen Sie die Menge an Protein in der Membran von der molekularen Masse von Lipid und Protein (MLipid und M-Protein), Bereich der Membran und der Kopfgruppe ein Lipid (eineMembran und einLipid) und das Massenverhältnis des Proteins pro Lipid (R). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Berechnen Sie die Nernst-Potenzial für das transportierte Substrat. R ist Gaskonstante, T die Temperatur, Z die Ladung des transportierten Substrats, F der Faradays konstante und C1 und c2 die Konzentrationen des Substrates auf beiden Seiten der Membran. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>Nutzen Sie von den Strom-Spannungs-Aufnahmen das Gegenteil potential mit dem Unterschied von der x-Achse Schnittpunkte von der linearen passt in an- und Abwesenheit des Substrats Gradienten berechnet.</li>
	<li>Berechnen Sie den Anteil der Substrat Leitwert GSubstrat, um der gesamten Membran Leitwert, Ginsgesamt, durch das Verhältnis der umgekehrte Potenzial, Nernst potenzielle11. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Berechnen Sie das Substrat Umsatz Nummer ΔNSubstrat pro Zeit Einheit ΔT von der Substrat-Leitwert (GSubstrat), die angelegte Spannung U und die Ladung der Substrat-z: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>Berechnen Sie aus dem Verhältnis der transportierten Substrat pro Zeit, um die Zahl der Proteine die Umsatz-Rate κ. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+research+in+drug+discovery.">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li><li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+chloride+electrode:+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents.">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li><li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li><li>Kleene, S. 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Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li><li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate.">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li><li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak.">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li><li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue.">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li><li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology.">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li><li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices.">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Implementierung der Mikro-Agar Salzbrücke mit der Elektrode minimiert mögliche Verbreitung und ermöglicht präzisere Messungen des Membranpotentials durch ein pH-Gradient erzeugt. In Anwesenheit von verschiedenen transmembranen pH-Gradienten, die mögliche Verschiebung der beiden Elektroden war akzeptabel bei ΔpH = 0.35 beim Vergleich mit den theoretischen Wert der potenziellen Nernst-Gleichgewicht (ΦNernst = 23,8 mV für ΔpH = 0,4). Jedoch bei mehr physiologische pH-Gradienten als Instanz in den Mitochondrien zwischen der Matrix und Intermembran Raum, der standard AgCl-Elektrode nicht genau messen die Potenzialverschiebung bei ΔpH = 1(Abbildung 3). Die Elektrode überbrückt mit Mikro-Agar Salz geliefert die Werte, die die Theorie viel mehr vergleichbar waren.
Mögliche Verbreitung kann auch an die AgCl-Referenzelektrode auftreten, wenn die Pufferlösung während des Experiments geändert wird. Chlorid-freie Pufferlösung wurde in den Experimenten verwendet, da abkoppeln Proteine vorgeschlagen wurden, um Chlorid-Ionen zu transportieren, und der pH-Wert wurde mit Tris oder MES angepasst. Die Elektrode Potenzial, in Ermangelung einer erheblichen Konzentration von Chlorid, hängt vor allem von Chlorid Verunreinigungen in der Pufferlösung. Wie seine Zusammensetzung während der Experimente unverändert ist, wird es einfach in einem konstanten Offset Potential führen. Für die Messung von einer absoluten Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden, könnte ein einfaches Agar-Salz-Bridge-System (Ag/AgCl 3 M KCl) jedoch auch für die Bezugselektrode verwendet werden.
Ein Mikro-Agar Salzbrücke Salden die mögliche Verbreitung durch ein Gleichgewicht der potenziellen Elektrode. Um die Salzlösung zu stabilisieren, wurde 1 % (w/V) Agarose hinzugefügt, um zu verhindern, dass die Vermischung der Salzlösung mit der Pufferlösung. Die Salzionen K+ und Cl– haben ähnliche Mobilitäten in Flüssigkeit und das Gleichgewicht der Elektrode Potenzial. Um die Salzbrücke ordnungsgemäß zu installieren, muss die Agar-Salzlösung ausreichend, die Microcapillary Spitze ohne Luftblasen gefüllt und decken die AgCl-Elektrode erwärmt werden. Elektrischer Kontakt zwischen der Salzbrücke Elektrode und die Bezugselektrode muss vor der weiteren Verwendung geprüft werden. Abhängig von der Zeit, die die Salzbrücke verwendet wird, muss die Salzlösung ausreichend geliert werden, um zu verhindern, dass eine Vermischung der Salzlösung mit dem Puffer. Dies ist besonders wichtig, wenn K+ oder Cl– Transporter untersucht werden. Die Salzbrücke diente für eine sehr kurze Zeit und die Elution von Agarose ist in diesem Zeitbereich zu vernachlässigen. Eine höhere Konzentration der Agarose von bis zu 5 % oder Agar (3 % - 5 %), erlaubt die Verwendung der Salzbrücke für eine längere Zeit6,12.
Diese Methode ermöglicht die Bestimmung der Kinetics der Transport eines Membran-Transporters (i) mit niedrigen Umsatzraten und (Ii) der mitochondrialen Proteine der inneren Membran, die kaum in standard-Patch Clamp-Setups13untersucht werden können. Ihre Präzision ist hauptsächlich abhängig von der umgekehrte mögliche Messung, welche Genauigkeit verringert wird, auf eine niedrige Gesamt-Membran-Leitfähigkeit und kleine Konzentration Steigungen die Membranpotential unter dem Lärm der Aufzeichnung auslösen.
Mit diesem Set-up, gemessen wurden die Umsatzraten UCP1 und UCP3 wie unter den gleichen Bedingungen hergestellt. Die gewonnenen Preise scheinen aufgrund der höheren pH Steigung präziser und unbeirrt von Artefakten aus der kleineren Elektrode Potenzialverschiebung sein. Es lässt sich weiter analysieren und vergleichen Mitochondrien-Membran-Transporter, die unter ähnlichen Bedingungen produziert.

Membranproteine sind um bis zu 60 % von allen bekannten Arzneimitteln1ausgerichtet. Elektrophysiologische Messungen der Membranproteine sind ein mächtig aber feine Tool zur Analyse des elektrogenes Transports von Substraten durch Träger Membranproteine vermittelt. Die Modulation des transmembranen Stromes durch die Anwendung von ständigen Spannungen oder Spannung Rampen ermöglicht die Beurteilung der pharmakologischen und physikalischen Eigenschaften der Träger, zum Beispiel die Aktivierung und Hemmung von Substraten oder den transport Kinetik. Von besonderem Interesse ist die Substrat-Umsatz-Nummer, die die Menge des Substrats anzeigt, die durch eine Membranprotein pro Zeiteinheit umgesiedelt ist. Es ist ein wichtiger Parameter, vergleicht man die Kinetik der verschiedenen Membranproteinen. Einrichtung ein Konzentrationsgradient geladener Substrat durch die Membran erzeugt eine elektromotorische Kraft die Umsatz-Anzahl des Substrats abgeleitet.
Mit Hilfe einer AgCl-Elektrode, entsteht die Anwesenheit von Chlorid-freie Puffer ein Diffusion-Potenzial, die Elektrode potenzielle verändert und führt zu einer Verschiebung der Strom-Spannungs-Messungen2. Zwar immer vorhanden, es ist für standard Leitwert und Kapazität Messungen vernachlässigbar, da diese Parameter entweder sind abhängig von der Neigung der Strom-Spannungs-Aufnahme (Leitfähigkeit) oder der Unterschied einer einzigen Aufnahme (Kapazität), die hebt das Potenzial. Jedoch kann die Aufnahme die umgekehrte Potential, das durch den Transport des Substrats erstellt wird, durch die mögliche Verbreitung erheblich gestört werden. Müssen uns daher für genaue Messungen des umgekehrten Potentials, die Elektrode Potenziale konstant gehalten werden.
Die mögliche Verbreitung kann durch zwei Methoden minimiert werden: (i) in Anwesenheit von einem Bilayer Membran hat eine Substratkonzentration auf der einen Seite der Membran3,4erhöht werden, oder (Ii) eine Salzbrücke gleicht die Elektrode potenzielle 5. die erste Methode ist stark abhängig von der Stabilität der Messungen. Die Membran muss überleben für einige Minuten durch die Zugabe von Substrat unter Rühren, bis das Substrat in der Lösung fast gleichmäßig verteilt ist. Falls die Membran zwischen Brüche, das Substrat Gefälle wird durch den freien Austausch von geladene Moleküle verändert und Messungen wieder ungenau. Die letztere Methode gleicht die mögliche Verbreitung aber ist begrenzt durch die Größe des Aufbaus. Umsetzung eines kleines aber funktionieren Salzbrücke im Mikrobereich eine elektrophysiologische Set-up ist eine6Herausforderung. Für die letztere Methode ist die Salzlösung in ein Microcapillary Tipp gefüllt und stabilisiert durch die Zugabe von Agarose, Verbreitung der Salzlösung die Pufferlösung zu verhindern.
In diesem Protokoll wird eine einfache Produktion eines Mikro-Agar Salzbrücke und Implementierung in eine elektrophysiologische Setup basierend auf die Pipette Set-up7 beschrieben. Ein Microcapillary Tipp ist eine 3 M KCl-Lösung mit 1 Mol % (w/V) Agarose enthalten und zur Überbrückung einer AgCl-Elektrode und Puffer-Lösung angepasst. Der Vorteil der Mikro-Salz-Brücke wird durch die präzisen Messungen des Membranpotentials an verschiedenen pH-Gradienten und Zeit Aufnahmen von der Elektrode Potenzialverschiebung angezeigt. Im Modellsystem von rekombinanten Proteinen rekonstituiert in Liposomen sind die Fluktuationsraten von mitochondrialen Carrier UCP1 und UCP3 unter ähnlichen Bedingungen produziert haben und im Vergleich zu früheren Ergebnisse3,8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:325px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:345px;">5242956.003</td>
			<td style="width:167px;">Microcapillary pipette tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol 99%</td>
			<td>AustrAlco &#214;sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td>
			<td>AAAH-5020-07025-230317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kaliumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DC supply</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>V10/CPG 1940 -01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose Standard</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3810.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample tube</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>5863.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2SO4</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>8560.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MES</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>4256.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexadecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating wire</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>USPS-2250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins

Bisher Ziel mehr als 50 % aller pharmakologische Medikamente Transport Kinetik von Membranproteinen. Die elektrophysiologische Charakterisierung von Membranproteinen Träger rekonstituiert in Lipid Bilayer Membranen ist mächtig, aber empfindliche Methode für die Bewertung ihrer physikalisch-chemischen und pharmakologischen Eigenschaften. Die Substrat-Umsatz-Zahl ist ein einzigartige Parameter, der den Vergleich der Aktivität von verschiedenen Membranproteinen ermöglicht. Der Gradient der translozierten Substrat schafft ein elektrogenes Transport ein Membranpotential, die direkt auf das Substrat Fluktuationsrate des Proteins korreliert. Mittels Silberchlorid Elektroden wird eine Diffusion Potenzial, auch namens liquid Junction potenzielle, induziert, die Elektrode Potenzial verändert und erheblich stört präzise Membran möglichen Messungen. Mögliche Verbreitung kann durch eine Salzbrücke minimiert werden, die Elektrode Potenzial ausgleicht. In diesem Artikel soll ein Mikro-Agar Salzbrücke die elektrophysiologische Setup zu verbessern, das Mikropipetten für die Membran-Bildung verwendet. Die Salzlösung in ein Microcapillary-Pipettenspitze, stabilisiert durch die Zugabe von Agarose, gefüllt und kann leicht mit einem standard Elektrode montiert werden. Das Potential der Elektrode einer Mikro-Salz-Brücke-Elektrode ist stabiler im Vergleich zu einer standard-Elektrode. Die Umsetzung dieses Systems Elektrode potenzielle stabilisiert und ermöglicht präzisere Messungen des Membranpotentials durch ein pH-Gradient erzeugt. Mit diesem System sind die Proton Fluktuationsraten der mitochondrialen Carrier UCP1 und UCP3 haben und im Vergleich zu früheren Messungen.

Um die Minimierung der möglichen Verbreitung zu überprüfen, wurde die Stabilität der Strom-Spannungs-Messungen eine intakte Membran gemessen. In Abbildung 2AVertreter-Strom-Spannungs-Aufnahmen in der Gegenwart (weiße Punkte) und Abwesenheit (schwarze Punkte) eines pH-Gradienten dargestellt. Gemäß der Nernst-Gleichung induziert der pH-Gradient eine Verschiebung in der Spannung. Von der x-Achse Schnittpunkt eine lineare Anpassung an die Daten errechnet sich die Potenzialverschiebung. Um beide Elektroden zu testen, wurde die Verschiebung der x-Achse Schnittpunkt für eine standard AgCl-Elektrode (Abbildung 2B; weiße Punkte) und ein Mikro-Agar Salzbrücke (Abbildung 2B; schwarze Punkte) analysiert. Eine Spannungsrampe wurde zehn Mal in Folge aufgezeichnet und die mittlere Verschiebung auf der x-Achse wird gegen die Zeit dargestellt. Während die Agar Salzbrücke Elektrode eine maximale Verschiebung von weniger als 5 hatte mV auch nach 300 Sekunden der Messung, die standard Elektrode variiert bis zu 30 mV in unvorhersehbaren, zufällig, Verhalten.
Als nächstes wurden beide Elektroden bei unterschiedlichen pH-Gradienten(Abbildung 3)getestet. Für die standard Elektrode wurde eine pH Steigung von 0,35 und 1,0 (weiße Punkte) erzeugt; für die Agar Salzbrücke Elektrode pH-Gradienten von 0,35, 0,7 und 1,0 (schwarze Punkte). Die Verschiebung der Potenzial wurde in drei unabhängige Messungen untersucht. Im Gegensatz zu einer Steigung von 0,35, wo die gemessenen Verschiebung nur leicht variiert, verändert die Spannung Verschiebung deutlich an der pH-Gradient der 1.0 in Ermangelung der Mikro-Agar Salzbrücke. Aus eine lineare Anpassung an die Daten ist die Steigung der Funktion 26,4 ± 2,3 mV/ΔpH für die standard-Elektrode und 50,1 ± 4,6 mV/ΔpH für die Mikro-Agar Salzbrücke Elektrode. Gemäß der Nernst-Gleichung ist die berechnete Potenzialverschiebung 60.7 mV/ΔpH bei T = 32 ° C.
Mit Mikro-Agar Salzbrücke, die Proton-Umsatz-Anzahl, wurde κ, mitochondriale UCP1 und UCP3 gemessen und im Vergleich zu früheren Messungen (Abb. 3B). Ähnlich wie Abbildung 3A, ΔpH = 1.0 wurde generiert und das umgekehrte Potenzial gemessen wurde. Die Menge an Protein in der Membran wurde geschätzt, nach der Formel gemäß Abschnitt 4 des Protokolls, mit einem Protein, Lipid-Verhältnis von 4 µg / (mg Lipid), eine Molekülmasse von 33.000 und 750 Da für die Protein- und Lipid, eine Membranfläche von 3,53 x 10 -4 cm2und einer Fläche pro Lipid von 7,8 x 10-15 cm2. Die κwas 5.56 ± 0,38 s-1 und 4.10 ± 0.71 s-1 für UCP1 und UCP3, bzw. zu erhalten (Abb. 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> Abbildung 1 : Die elektrophysiologische Set-up mit der Mikro-Agar Salzbrücke. (A) dieses Panel zeigt eine Skizze des Aufbaus. Die Microcapillary-Spitze mit der Agar-Salzlösung (in Orange dargestellt) befindet sich zwischen der Elektrode (schwarz) und die Puffer-haltigen Spitze (blau). Die Membran bildet sich an der Oberfläche am Ende der Puffer-haltigen Spitze (Pfeilrichtung). (B) dieses Panel zeigt ein Bild des elektrophysiologischen Set-up mit der Implementierung der Mikro-Agar Salzbrücke. Die Pfeile zeigen auf die Elektrode, die Mikro-Agar Salzbrücke, Bezugselektrode und den Behälter mit Pufferlösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> Abbildung 2 : Der Vergleich der Salzbrücke eine Mikro-Agar und einer standard AgCl Elektrode. (A) dieses Panel zeigt eine repräsentative Strom-Spannungs-Messung in der Gegenwart (graue Punkte) und Abwesenheit (weiße Punkte) eines pH-Gradienten von 1. Die Linien repräsentieren eine lineare Anpassung der Daten, aus denen Leitwert und x-Achse Kreuzung Werte erhalten werden. Die Verschiebung der Spannung wird durch die Differenz der Kreuzung Werte der beiden Aufnahmen ausgewertet. (B) dieses Panel zeigt die Verschiebung der Membran einer standard AgCl-Elektrode (weiße Punkte), ein Mikro-Agar Salzbrücke Elektrode (schwarze Punkte) in der Zeit. Zehn Strom-Spannungs-Messungen hintereinander aufgenommen wurden und die mittlere Spannung Verschiebung durch Diffusion möglichen aufgetragen gegen die Zeit. In allen Versuchen wurde die Membran 45:45:10 Mol-% DOPC:DOPE:CL rekonstituiert mit 15 Mol % Arachidonsäure in einer Konzentration von 1,5 mg/mL. Der Puffer enthalten 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS und 0,6 mM EGTA bei pH = 7,34 und T = 32 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> Abbildung 3 : Proton Umsatz UCP1 und UCP3 berechnet aus dem umgekehrten Potenzial im Beisein eines pH-Gradienten. (A) dieses Panel zeigt die Verschiebung im Potenzial einer UCP1-haltigen Membran von verschiedenen pH-Gradienten aus einer standard AgCl-Elektrode (weiße Punkte) und ein Mikro-Agar Salzbrücke Elektrode (schwarze Punkte). Die Linien repräsentieren eine lineare Anpassung der Daten. (B) dieses Panel zeigt die Proton Umsatz Anzahl der UCP1 (erste Datensatz) und UCP3 (zweite Datensatz) als berechnet aus dem Verhältnis von Spannung Verschiebung Nernst-Potential nach den Formeln in Abschnitt 4 des Protokolls. Der erste Balken eines jeden Satzes stellt Umsatzraten gemessen mit der Mikro-Agar Salzbrücke. Der zweite Balken jeder Datensatz stellt vorherigen Messungen mit einer standard AgCl-Elektrode. Werte für UCP1 und UCP3 stammen aus UrbankovaEt al. 3 und Macher Et al. 8. in allen Messungen, setzte die Membran aus 45:45:10 Mol % DOPC:DOPE:CL mit 15 Mol % AA und UCP1/UCP3 rekonstituiert. Die Konzentration von Lipid und Protein betrug 1,5 mg/mL bzw. 4 µg/mg Lipid. Der Puffer enthalten 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS und 0,6 mM EGTA bei pH = 7,34 und T = 32 ° C. Der pH-Wert des Puffers für die Gradienten-Messungen wurde durch Zugabe von TRIS 7,66, 8,00 oder 8,33 erhöht und änderte sich in der Lösung-haltigen Pipette. Die Werte sind der Mittelwert ± Standardabweichung der drei unabhängige Messungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

Elektrophysiologische Messungen stört das Vorhandensein von einer möglichen Verbreitung die genaue Messung des umgekehrten Potenzials durch Veränderung der Elektrode Potenzial. Mit einem Mikro-Agar Salzbrücke, wird die Auswirkungen der möglichen Verbreitung minimiert, wodurch eine genauere Messung des Substrat Umsatz Zahlen der rekonstituierten rekombinante Membranproteine.

Eine Mikro-Agar-Salz-Brücke-Elektrode für die Analyse der Proton Fluktuationsrate von rekombinanten Membranproteine

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Diese Methode kann bei der Untersuchung von Membranproteinen wie Transportern und Kanälen helfen. Die Informationen über den Substratumsatzbeimgang beim Vergleich der Proteinaktivität und Spezifität und der unterschiedlichen physiologischen und pathologischen Bedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie potenzielle Verschiebungsschwankungen und chloridfreie Pufferbedingungen minimiert.Und erhöht die Präzision der Umsatzpreisbestimmung durch genauere Membranpotenzialmessungen deutlich. Sammeln Sie die Elemente für die ersten Schritte. Dazu gehören zwei mikrokapillare Pipettenspitzen, eine scharfe Klinge und ein Schiebesattel.Für die Elektrode haben Silberdraht, Sandpapier und eine drei Molkaliumchlorid-Lösung zur Hand. Darüber hinaus haben Ethanol und Wasser für die Reinigung und eine GLEICHstrom-Stromversorgung. Arbeiten Sie mit den beiden Mikropipettenspitzen.Beginnen Sie mit der Spitze, die den Puffer enthält. Platzieren Sie die zweite Spitze neben der ersten. Bewegen Sie die zweite Spitze, so dass, wenn es eingefügt wird, sein schmaler Teil mindestens fünf Millimeter in den schmalen Teil des ersten teilt.Markieren Sie die Position, an der der erste Puffer mit der Spitze angefügt wird. Verwenden Sie dann den Bremssattel, um die Länge der Mikro-Agar-Salzbrückenelektrode zu messen. Verwenden Sie die Klinge, um die Spitze auf die entsprechende Länge zu schneiden.Reinigen Sie die Schnittfläche mit Ethanol, gefolgt von Wasser. Als nächstes erhalten Sie eine Länge von etwa acht Zentimeter Silberdraht für die Elektrode. Reinigen Sie den Draht auf Tüchern mit Ethanol gefolgt von Wasser.Nach der Reinigung verwenden Sie Sandpapier, um die Oberfläche auf einer Länge von einem Zentimeter an einem Ende zu glätten. Dieser Draht mit seinem geglätteten Ende ist bereit, elektrochemisch beschichtet zu werden. Setzen Sie das geglättete Ende in die Kaliumchloridlösung, wobei das andere Ende mit einem Gleichstromnetzteil für die Beschichtung verbunden ist.Wenn Sie beschichtet sind, trennen Sie die Elektrode und reinigen Sie sie mit Wasser. Nach dem Trocknen bestimmen Sie die Länge, die es ermöglicht, die Mikrokapillarspitze so tief wie möglich zu durchdringen. Schneiden Sie die Elektrode von der unbeschichteten Seite auf die entsprechende Länge.Nun, um eine Salzlösung mit Agarose vorzubereiten. In einem Wasserkolben Kaliumchlorid auflösen und mit einem Magnetrührer beim Mischen unterstützen. Nach dem Entfernen des Rührers Agarose in den Kolben geben.Nehmen Sie den Kolben in eine Mikrowelle und erhitzen Sie ihn, um die Agarose bei etwa 100 Grad Celsius zu schmelzen. Nehmen Sie es heraus, um visuell zu überprüfen, ob die Agarose vollständig aufgelöst ist. Sobald die Agarose pipette 10 Mikroliter langsam in die Mikrokapillare gelöst wird, um Luftblasen zu vermeiden.Es ist wichtig, die Agarsalzlösung sorgfältig in die Mikrokapillarspitze zu pipetten, insbesondere bei hohen Agarkonzentrationen. Wenn nicht richtig gemacht Luftblasen sind leicht in der Spitze und Block elektrischen Fluss produziert. Nach dem Entfernen der Spitze aus der Pipette drücken Sie die Elektrode hinein.Stellen Sie sicher, dass die Elektrode in die Salzlösung eindringt. Wenn sich die Elektrode bei Raumtemperatur befindet, stecken Sie sie in eine Referenzelektrode in einen Verstärker. Stützen Sie die Referenzelektrode, so dass sie in einen Kunststoffbehälter mit einem Milliliter Puffer abgesenkt werden kann.Als nächstes tauchen Sie die Salzbrückenelektrode in die Lösung ein. Wenden Sie eine Spannung an, und überprüfen Sie, ob eine Stromantwort vor dem Fortfahren erfolgt. Wenn der Test erfolgreich ist, trennen Sie die Elektroden.Bei Bedarf die Salzbrückenelektrode aufbewahren, indem Sie sie in eine dreimolare Kaliumchloridlösung tauchen. Als Nächstes bereiten Sie den Puffer mit Kunststoffspitze vor. Nehmen Sie eine Mikrokapillarspitze und identifizieren Sie einen Punkt zwei Zentimeter vom schmalen Teil entfernt.Verwenden Sie einen Heizdraht, um das Rohr um 90 Grad an dieser Position zu biegen. Mit einem scharfen Messer schneiden Sie das Rohr fünf Millimeter vom Gebogenen. Reinigen Sie den Bereich, der mit Ethanol geschnitten wurde, gefolgt von Wasser.Bevor Sie fortfahren, verwenden Sie ein Lichtmikroskop mit einer Skala, um den Durchmesser des Lochs an der Spitze zu messen. Als nächstes bewegen Sie die Pipette in der Nähe eines Behälters mit Lösungsmittel und einem anderen Puffer. Drei Mikroliter des Lösungsmittels in die und aus der Spitze pipette.Als nächstes füllen Sie die Messspitze mit drei Mikroliter Puffer. Holen Sie nun die Salzbrücke aus der Kaliumchloridlösung. Stecken Sie die Messspitze mit dem Puffer an die Salzbrückenelektrode.Schließen Sie die Salzbrückenelektrode und die Referenzelektrode an einen Verstärker an. An dieser Stelle die Salzbrückenelektrode in der Pufferlösung mit der Referenzelektrode aufhängen. Eine Darstellung der Konfiguration für das Experiment ist in diesem Schaltplan.Während des Experiments bildet sich die Membran am Ende des Puffers, der eine Pipette enthält. Sammeln Sie Daten, um die Membrankapazität zu finden. Dazu wird ein dreieckiges Wechselspannungssignal verwendet, um eine rechteckige Wechselstromantwort zu erzeugen.Als Nächstes finden Sie die Leitfähigkeit und Spannung bei Nullstrom. Automatisieren Sie die Anwendung einer Spannungsrampe im Bereich von minus 50 bis 50 Millivolt und erfassen Sie den Strom. Passen Sie eine lineare Funktion an die Daten an.Die Steigung ist die Leitfähigkeit, der x-Intercept ist die Spannung bei Nullstrom. Entfernen Sie nach Getaner die Messspitze von der Salzbrücke. Füllen Sie eine neue Messspitze mit Puffer, passen Sie sie an einen anderen pH-Wert an, um einen Protonengradienten über die Membran einzurichten.Stellen Sie den Versuchsaufbau mit einer neuen Messspitze und Elektroden wieder her, um die Messungen zu wiederholen. Hier sind repräsentative Stromspannungsaufzeichnungen in Gegenwart eines pH-Gradienten. Und in Ermangelung eines pH-Gradienten.Die Linien stellen eine lineare Anpassung an die Daten dar. Die Verschiebung des x-Achsen-Schnittpunkts für die verschiedenen pH-Werte wird durch die Nernst-Gleichung vorhergesagt. Diese Daten stellen die Verschiebung des Membranpotentials rechtzeitig für eine Standard-Silberchloridelektrode in Weiß und die Mikro-Agar-Salzbrückenelektrode in Schwarz dar.Die Agar-Salzbrückenelektrode war stabiler mit einer maximalen Verschiebung von weniger als fünf Millivolt über 300 Sekunden Messung. In dieser Darstellung der Potentialverschiebung als Funktion des pH-Gradienten verhalten sich die beiden Elektroden bei zunehmendem pH-Verlauf deutlich unterschiedlich. Die Protonenumschlagsrate kann für die beiden Elektrodentypen gefunden und verglichen werden.Hier sind Protonenumsatzzahlen, die für das mitochondriale Entkopplungsprotein ein UCP1 ermittelt werden, das von der Salzbrückenelektrode im Vergleich zu einer Standardelektrode gemessen wird. Es gibt auch Daten für ähnlich vorbereitetes UCP3. Die Raten erscheinen mit der Agar-Salzbrückenelektrode präziser.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Elektrode in die Agarsalzlösung eindringt. Die Salzbrücke muss auch in die Pufferlösung eintauchen. Stellen Sie schließlich sicher, dass die Agarsalzlösung keine Luftblasen enthält.

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