Name: a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av den østerrikske Research Fund (P31559-B20 til E.E.P.). Forfatterne takker Sarah Bardakji for utmerket teknisk assistanse i produksjon og rekonstituering av mus UCP1 og UCP3 i proteoliposomes.

1. produksjon av rekombinant Uncoupling proteiner (UCPs) og dannelse av Plane Bilayer membraner
<ol><li>Produsere rekombinant UCP1 og UCP3 som beskrevet av Rupprecht et al. 9 og Hilse et al. 10
</li>
	<li>Danne planar bilayer membraner på tuppen av konvensjonelle unnværlig plast Pipetter som beskrevet av Beck et al. 7
</li>
</ol>2. utarbeidelse av mikro-agar Salt Bridge elektroden
<ol><li>Juster en microcapillary pipette tips (se Tabell of Materials) til riktig lengde.<ol>
<li>Merke posisjonen på en tom tips som buffer inneholder spissen knyttet til og bruke en glidende caliper for å måle lengden på mikro-agar salt bro elektroden. FORSIKTIG: Microcapillary spissen må være lang nok til å angi buffer løsning for målingene.</li>
		<li>Skjær microcapillary spissen med en skarp kniv- eller bladholderen og flaten kuttet med etanol og vann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede AgCl-belagt elektroden.<ol>
<li>Avskåret en Ag wire på ca 8 cm i lengde og rense den med etanol og vann.</li>
		<li>Ta en bit av sandpapir og glatt ned overflaten av 1 cm lengde på slutten av ledningen, som skal være i kontakt med salt løsning.</li>
		<li>Dyppe utjevnet slutten i en 3 M KCl løsning og belegge det electrochemically med chloride ved å bruke en DC tilførsel 1,5 V for 10 s.</li>
		<li>Rengjør elektroden med vann, tørk den og justere lengden på AgCl elektroden fra ubestrøket siden slik at den går microcapillary spissen så dypt som mulig. Merk: Protokollen kan pauses her.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede en 3 M KCl salt løsning med 1% (v/v) agarose.<ol>
<li>Veie ut 4.47 g KCl og oppløse den i 20 mL vann av rører i en bolle.</li>
		<li>Fjerne rørestang veie ut 0.2 g agarose og legge den til kolbe.</li>
		<li>Varme opp løsningen på 100 ° C for å smelte agarose og forhindre blodpropp. FORSIKTIG: Kolbe blir veldig varmt. Ikke berør den med bare hendene. Bruk hansker for håndtering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fyll microcapillary spissen med agarose salt løsning. FORSIKTIG: Løsningen er varmt. Beskytt hendene og arbeid nøye for å unngå sprut.<ol>
<li>Hvis agarose starter clotting, varme opp salt løsning å fullt smelte agarose igjen.</li>
		<li>Nyt 10 µL av agar salt løsning i microcapillary spissen. Nyt det sakte og forsiktig å unngå luft bobler i spissen.</li>
		<li>Fjerne tipset fra pipette og skyv inn AgCl elektroden fra bredere siden av spissen. Kontroller at elektroden trenger salt løsning.</li>
		<li>Avkjøl elektroden til romtemperatur og koble den til forsterkeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede bufferen for målingene.<ol>
<li>Veie ut 0.710 g Na2SO4, 0,195 g MES, 0.121 g TRIS og 0.023 g EGTA, deretter legge til 100 mL destillert vann i et beaker og rør løsningen.</li>
		<li>Se etter pH verdien av bufferen ved å bruke en pH-elektrode og justere pH verdien til 7.32.</li>
		<li>Sjekk at referanse elektroden og agar salt bro elektroden er elektrisk kontakt.<ol>
<li>Legge til 1 mL av bufferen i en plastbeholder.</li>
			<li>Dukkert i referanse elektroden og agar salt bro elektroden og sjekk på signalet svar. Hvis signalet svaret er riktig, går du til trinn 2.7.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hvis det er falske signal svar eller ingen elektrisk kontakt på alle, kan du utføre følgende feilsøking.<ol>
<li>Kontroller om elektroden er i kontakt med salt løsning og presse elektroden i løsningen. Merk: Hvis løsningen allerede for klissete, fjerne mikro-agar salt broen og forberede nye microcapillary tips.</li>
		<li>Sjekk om det er luftbobler i salt løsning. Hvis ja, klargjør nye microcapillary tips.</li>
		<li>Kontroller om salt løsning er i kontakt med buffer løsning. Hvis ikke, så kuttet en annen 1 mm rør etter spissen. Advarsel: Sørg for at spissen er fortsatt lenge nok til å trenge buffer inneholder spissen. Hvis det er fortsatt ingen kontakt, klargjør nye microcapillary tips.</li>
		<li>Hvis ingen av disse trinnene hjelper, klargjør nye microcapillary tips.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For lagring, dyppe agar salt bro elektroden i en 3 M KCl løsning. Merk: Protokollen kan stoppes her. For en pause over natten, lagre elektroden i 3 M KCl salt løsning på 4 ° C.</li>
	<li>Forberede buffer inneholder plast spissen. Merk: Hvis elektroden ble lagret over natten, ta den ut og la det varme opp til romtemperatur i 30 min.<ol>
<li>Ta en microcapillary tips og bøy røret, 2 cm fra kanten av smale delen, ca 90 grader ved hjelp av en oppvarming ledning.</li>
		<li>Bruke en veldig skarp kniv- eller bladholderen og kuttet av røret rundt 5 mm fra svingen.</li>
		<li>Rengjør overflaten på slutten med etanol og vann og måle diameteren på hullet tips. Fra dette, kan du beregne arealet av overflaten.</li>
		<li>Coat overflaten av spissen med 85:15 (v: v) Heksan: hexadecane.<ol>
<li>Pipetter 3 µL løsemiddel og fjerne den fra spissen.</li>
			<li>Vente 1 min slik at alle gjenværende løsemiddel i spissen har fordampet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fyll Måletips med 3 µL bufferen og koble den til salt bro elektroden. Merk: Sjekk igjen hvis salt bro elektroden og referanse elektroden er i elektrisk kontakt grepet 2.5.3.</li>
		<li>Hvis det er ingen elektrisk kontakt, kontroller følgende:<ol>
<li>Kontroller om salt bro elektroden i kontakt med buffer løsning. Hvis ikke, øke volumet av bufferen i spissen, eller Tilbered et lengre microcapillary tips.</li>
			<li>Hvis det er en luftboble, fjerne tipset fra mikro-salt bro elektroden, fylle bufferen i spissen, og koble den til elektroden igjen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. måling av elektriske parametrene av membranen rekonstitueres med rekombinante proteiner
<ol><li>Bruke en trekantet vekslende spenningen signalet med maksimal spenning UMaks = 50 mV og ΔTrampen = 50 ms, som skaper en rektangulær vekselstrøm respons. Fra mener verdiene av positive og negative strøm (jeg+ og jeg-), kan du beregne kapasiteten av membranen i henhold til følgende formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>Bruke en spenning rampe fra-50 mV til 50 mV og posten gjeldende. Passer en lineær funksjon til data - skråningen er konduktans - og beregne krysningspunktet x-aksen på plass.</li>
	<li>Utslipp løsningen i plast spissen og fylle en ny med en buffer som inneholder en økt substrat konsentrasjon.<ol>
<li>Hvis ingen membran er dannet i de første 20-30-s, utslipp volumet og fylle den. Dette garanterer at konsentrasjon gradient over membranen ikke vesentlig endrer under membranen dannelsen.</li>
		<li>Etter dannelsen av en membran, kan du utføre trinnene 3.1 og 3.2 igjen for å bekrefte riktig membran dannelse og få krysningspunktet x-aksen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. beregning av underlaget omløpshastighet
Merk: Se tidligere arbeid for detaljer3,7.
<ol><li>Estimere mengden protein i membranen molekylær masse lipid og protein (MLipid og MProtein), området av membranen og en lipid Hovedgruppe (enmembran og enLipid) og masse forholdet protein per lipid (r). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Beregne han potensial for transportert underlaget. R er gass konstant, T temperatur, z ansvaret for transportert underlaget, F Faradays konstant og c1 og c2 konsentrasjonen av underlaget på begge sider av membranen. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>Nåværende-spenning-opptak tar motsatt potensielle beregnet med forskjellen på x-aksen skjæringspunkter fra lineær passer i tilstedeværelse og fravær av underlaget graderingen.</li>
	<li>Beregne andelen substrat konduktans, Gsubstrat, til den totale membran konduktans, Gtotalt, av forholdet mellom omvendt potensial til han potensielle11. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Beregne substrat omsetning nummer ΔNsubstrat per gang enheten ΔT fra substrat konduktans (Gsubstrat), anvendt spenning U og ansvaret for substrat-z: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>På forholdet mellom transportert substrat per gang antall proteiner, beregne omsetning rate κ. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+research+in+drug+discovery.">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li><li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+chloride+electrode:+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents.">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li><li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+kinetics+of+uncoupling+proteins.+Analysis+of+UCP1+reconstituted+in+planar+lipid+bilayers.">Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+human+uncoupling+proteins+1+and+2+in+planar+lipid+bilayers.">Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers.</a> The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).</li><li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+intrapipette+salt+bridge.">A simple intrapipette salt bridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+technique+for+the+reconstitution+of+hydrophobic+proteins+into+planar+bilayer+membranes.+Studies+of+human+recombinant+uncoupling+protein+1.">A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li><li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate.">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li><li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak.">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li><li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue.">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li><li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology.">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li><li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices.">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Gjennomføringen av mikro-agar salt broen med elektroden minimerer sin diffusjon potensielle og gir mer nøyaktige mål av membran potensial generert av pH gradering. I nærvær av ulike transmembrane pH graderinger, potensielle skifte av begge elektrodene var akseptabelt på ΔpH = 0,35 når sammenligne den teoretiske verdien av han likevekt potensielle (Φhan = 23.8 mV for ΔpH = 0,4). Imidlertid på flere fysiologisk pH graderinger, som for forekomst i mitokondrier mellom matrix og intermembrane plass, standard AgCl elektroden mislyktes å presist måle potensielle Skift på ΔpH = 1 (Figur 3A). Elektroden bro med mikro-agar salt levert verdiene som var mye mer sammenlignes teorien.
Diffusjon potensielle kan også oppstå på AgCl referanse elektrode hvis buffer løsning endres under eksperimentet. Flammehemmende buffer løsning ble brukt i eksperimentene siden uncoupling proteiner ble foreslått for å transportere kloridioner, og pH ble justert med Tris eller MES. Elektroden potensial, i fravær av en betydelig konsentrasjon av klorider, avhenger først og fremst klorid urenheter i buffer løsning. Komposisjonen er uendret under forsøkene, vil det bare resultere i en konstant offset potensial. Men for måling av en absolutt potensielle forskjellen mellom de to elektrodene, kan en enkel agar salt-broen system (Ag/AgCl 3 M KCl) også brukes for referanse elektroden.
En mikro-agar salt bro balanserer spredningen potensielle ved en balanse av elektroden potensielle. For å stabilisere salt løsning, ble 1% (w/v) agarose lagt til hindre blanding av salt løsning med buffer løsning. De salt ionene K+ og Cl- har lignende mobilities i væske og balansere elektroden potensielle. For å installere riktig salt broen, må agar salt løsning være tilstrekkelig varmet opp å fylle microcapillary spissen uten noen luftbobler og å dekke AgCl elektroden. Før videre behandling har elektrisk kontakt mellom salt bro elektroden og referanse elektroden sjekkes. Avhengig salt broen brukes, må salt løsning være tilstrekkelig gelled for å hindre en blanding av salt løsning med bufferen. Dette er spesielt viktig hvis K+ eller Cl- transportører er undersøkt. Salt broen ble brukt for en svært kort tid og tilsettes av agarose er ubetydelig i dette tidsintervallet. En høyere konsentrasjon av agarose inntil 5% eller agar (3% - 5%), kan bruke salt broen i lengre tid6,12.
Denne metoden kan bestemme transport kinetics av en membran transporter (i) med lav Omsetningshastigheten og (ii) mitokondrie proteiner av interne membran, som kan knapt bli undersøkt i standard patch klemme set-ups13. Sin presisjon er hovedsakelig avhengig omvendt potensielle måling, der nøyaktighet er redusert på en lav total membran konduktans og små konsentrasjon forløpninger som induserer en membran potensial under lyden av innspillingen.
Bruker dette oppsettet, ble omsetning PR av UCP1 og UCP3 som produseres under samme vilkår målt. På grunn av høyere pH gradient synes innhentet priser å være mer presis og Uaffisert av gjenstander som følge av mindre elektrode potensielle skiftet. Det kan brukes å analysere og sammenligne mitokondrie membran transportører produsert under like forhold.

Membran proteiner er rettet opp til 60% av alle kjente legemidler1. Elektrofysiologiske målinger av membran proteiner er en kraftig men delikat verktøy for å analysere electrogenic transport av underlag mediert av membran carrier proteiner. Modulering av transmembrane gjeldende ved anvendelse av konstant spenninger eller spenning ramper kan vurdere de farmakologiske og fysiske egenskapene av bærere, for eksempel aktivisering og hemming av underlag eller transport Kinetics. Av spesiell interesse er substrat omsetning tall, som viser hvor mye substrat som er translocated av en membran protein per tidsenhet. Det er en viktig parameter når du sammenligner kinetics av membran. Etablere en konsentrasjon gradient ladet underlaget over membranen genererer en Elektromotorisk kraft som omsetning antall underlaget er utledet.
Bruke en AgCl elektrode, skaper tilstedeværelsen av en flammehemmende buffer et diffusjon potensial som endrer elektrode potensielle og fører til en endring i nåværende-spenning mål2. Selv om det er alltid til stede, det er ubetydelig for standard konduktans og kapasitet målinger siden disse parameterne er avhengig av skråningen av gjeldende-spenning innspilling (konduktans) eller er forskjellen på en enkelt innspilling (kapasitet), som avbryter potensial. Imidlertid kan innspillingen av omvendt potensial, som opprettes av transport av underlaget, bli betydelig forstyrret av spredningen potensielle. Dermed for nøyaktige målinger av omvendt potensialet må elektrode potensialene holdes konstant.
Spredningen potensielle kan reduseres ved to metoder: (i) i nærvær av en bilayer membran, en substrat konsentrasjon har økes på én side av membran3,4, eller (ii) en salt bro balanserer elektroden potensielle 5. den første metoden er svært avhengig av stabiliteten av målinger. Membranen må overleve i flere minutter, fra tillegg av underlaget under omrøring til underlaget er nesten like distribuert i løsningen. Hvis membranen brudd i mellom, substrat forløpningen endres av den frie utvekslingen av ladet molekyler og målinger slå unøyaktig. Sistnevnte balanserer spredningen potensial, men er begrenset av størrelsen på oppsettet. Implementere en liten men virker salt broen i mikro området til en elektrofysiologiske oppsett er utfordrende6. For den sistnevnte, salt løsning fylles inn et microcapillary tips og stabilisert med tillegg av agarose å hindre spredning av salt løsning til buffer løsning.
En enkel produksjon av en mikro-agar salt bro og implementering i et elektrofysiologiske oppsett basert på pipette oppsett7 er beskrevet i denne protokollen. En microcapillary tips justeres både inneholder en 3 M KCl løsning med 1 mol % (w/v) agarose og bygge en AgCl elektrode og buffer løsning. Fordelen av mikro-salt broen vises tidsregistreringer av elektroden potensielle skiftet og mer presise målinger av membran potensial på ulike pH graderinger. I modellen systemet rekombinante proteiner rekonstituert i liposomer, er omsetning PR av mitokondrie bærere UCP1 og UCP3 produsert under like forhold reinvestigated og i forhold til tidligere resultater3,8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:325px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:345px;">5242956.003</td>
			<td style="width:167px;">Microcapillary pipette tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol 99%</td>
			<td>AustrAlco &#214;sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td>
			<td>AAAH-5020-07025-230317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kaliumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DC supply</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>V10/CPG 1940 -01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose Standard</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3810.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample tube</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>5863.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2SO4</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>8560.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MES</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>4256.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexadecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating wire</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>USPS-2250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins

Hittil mål mer enn 50% av alle farmakologiske narkotika transport kinetics membran proteiner. Elektrofysiologiske karakterisering av membran carrier proteiner rekonstituert i lipid bilayer membraner er en kraftig men delikat metode for vurdering av mekanisk- og Farmakologiske egenskaper. Omsetning er underlaget en unik parameter som gjør sammenligning av aktiviteten til forskjellige membran proteiner. I et electrogenic transport skaper gradient av translocated underlaget en membran potensial som direkte korrelerer til underlaget omløpshastighet av protein. Ved hjelp av sølv klorid elektroder, er en diffusjon potensial, også kalt flytende krysset potensial, indusert, som endrer elektrode potensial og betydelig forstyrrer presis membran potensielle mål. Diffusjon potensielle kan reduseres ved en salt bro, som balanserer elektrode potensial. I denne artikkelen er en mikro-agar salt bro utformet for å forbedre elektrofysiologiske satt opp, som bruker Mikropipetter for membran dannelsen. Salt løsning er fylt inn i en microcapillary pipette tips, stabilisert med tillegg av agarose, og lett kan monteres på et standard elektroden. Elektroden potensialet i en mikro-salt bro elektrode er mer stabilt sammenlignet med en standard elektrode. Gjennomføringen av dette systemet stabiliserer elektrode potensielle og gir mer nøyaktige mål av membran potensial generert av pH gradering. Bruke dette systemet, er proton omsetning PR av mitokondrie bærere UCP1 og UCP3 reinvestigated og i forhold til tidligere målinger.

For å bekrefte minimering av spredningen potensielle, ble stabiliteten av nåværende-spenning målinger av en intakt membran målt. I figur 2A, er representant gjeldende spenning innspillinger avbildet i nærvær (hvite prikker) og fravær (svarte prikker) av pH gradering. Ifølge han ligningen induserer pH graderingen en endring i spenning. Fra x-aksen krysningspunktet for en lineær passer til dataene beregnes det potensielle skiftet. For å teste begge elektrodene, ble skifte i x-aksen skjæringspunkt analysert for en standard AgCl elektrode (figur 2B, hvite prikker) og en mikro-agar salt bro (figur 2B, svarte prikker). En spenning rampe ble innspilt ti ganger på rad og mener skifte i x-aksen er avbildet mot tiden. Mens agar salt bro elektroden hadde en maksimal forskyvning av mindre enn 5 mV selv etter 300 sekunder av måling, standard elektroden variert 30 mV uforutsigbar, tilfeldig, oppførsel.
Deretter er begge elektrodene testet på ulike pH graderinger (Figur 3A). Standard elektroden, ble en pH gradient 0,35 og 1.0 (hvite prikker) generert; agar salt bro elektrode, pH graderinger 0,35, 0,7 og 1.0 (svarte prikker). Skifte i potensielle ble analysert i tre uavhengige målinger. I motsetning til en forløpning på 0,35, der målt skiftet bare varierer litt, endrer spenning skiftet vesentlig ved pH gradient 1,0 i fravær av mikro-agar salt broen. Fra en lineær passer til dataene er skråningen av funksjonen 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH for standard elektroden og 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH for mikro-agar salt bro elektroden. Ifølge han ligningen, beregnet potensielle skiftet er 60,7 mV/ΔpH på T = 32 ° C.
Bruke mikro-agar salt broen, hvor proton omsetning ble κ, mitokondrie UCP1 og UCP3 målt og sammenlignet med tidligere målinger (Figur 3B). Ligner på Figur 3A, ΔpH = 1.0 ble generert og omvendt potensialet ble målt. Hvor mye protein i membranen ble beregnet i henhold til formelen i del 4 av protokollen, med et protein lipid-forhold på 4 µg / (mg av lipid), molekylær masse 33.000 og 750 Da for protein og lipid, en membran areal på 3.53 x 10 -4 cm2og et område per lipid av 7,8 x 10-15 cm2. Den fikk κwas 5,56 ± 0,38 s-1 og 4.10 ± 0.71 s-1 for UCP1 og UCP3, henholdsvis (Figur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> Figur 1 : Elektrofysiologiske satt opp med mikro-agar salt broen. (A) dette panelet viser en skisse av opplegget. Microcapillary tips med agar salt løsning (avbildet i oransje) er plassert mellom elektroden (svart) og buffer inneholder spissen (blå). Membranen er dannet ved overflaten på slutten av bufferen inneholder spissen (angitt med pilen). (B) dette panelet viser et bilde av elektrofysiologiske satt opp med gjennomføringen av mikro-agar salt broen. Pilene peker til elektroden, mikro-agar salt broen, referanse elektroden og beholderen med buffer løsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> Figur 2 : Sammenligning av mikro-agar salt bro og en standard AgCl elektrode. (A) dette panelet viser et representativt nåværende-spenning mål i nærvær (grå prikker) og fravær (hvite prikker) av pH gradering av 1. Linjene representerer en lineær passer til dataene, krysset verdiene hentes fra hvilke konduktans og x-aksen. Spenning skiftet vurderes ved forskjellen av skjæringspunktet verdiene i begge innspillinger. (B) dette panelet viser skifte av membran potensialet i en standard AgCl elektrode (hvite prikker) til en mikro-agar salt bro elektrode (svarte prikker) i tid. Ti nåværende-spenning målinger ble innspilt på rad og mener spenning skifte av diffusjon potensielle tegnes mot tiden. Alle eksperimenter, ble membranen laget av 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueres med 15 mol % arakidonsyre i en konsentrasjon på 1,5 mg/mL. Bufferen inneholdt 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS og 0.6 mM EGTA ved pH = 7.34 og T = 32 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> Figur 3 : Proton omsetning flere UCP1 og UCP3 beregnet fra omvendt potensialet i nærvær av pH gradering. (A) dette panelet viser skiftet i potensialet i en UCP1 som inneholder membran av ulike pH graderinger av en standard AgCl elektrode (hvite prikker) og en mikro-agar salt bro elektrode (svarte prikker). Linjene representerer en lineær plass til dataene. (B) dette panelet viser proton omsetning antall UCP1 (første datasettet) og UCP3 (andre datasettet) beregnet på forholdet mellom voltage Skift han ut i henhold til formlene i del 4 av protokollen. Den første linjen i hvert sett representerer Omsetningshastigheten målt med mikro-agar salt broen. Den andre linjen av hvert datasett representerer forrige mål med en standard AgCl elektrode. Verdier for UCP1 og UCP3 ble tatt fra Urbankovaet al. 3 og Macher et al. 8. i alle målinger, membranen var laget av 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueres med 15 mol % AA og UCP1/UCP3. Konsentrasjonen av lipid og protein var 1.5 mg/mL og 4 µg/mg av lipid, henholdsvis. Bufferen inneholdt 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS og 0.6 mM EGTA ved pH = 7.34 og T = 32 ° C. PH i bufferen for gradient målingene ble økt 7,66, 8.00 eller 8.33 ved å legge TRIS og ble endret i løsningen inneholder pipette. Verdiene er gjennomsnittlig ± standardavviket for tre uavhengige målinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

I elektrofysiologiske målinger forstyrrer tilstedeværelsen av en diffusjon potensielle den presise målingen av omvendt potensialet ved å endre elektroden potensielle. Bruke en mikro-agar salt bro, er virkningen av spredningen potensielle minimert, noe som gir mer nøyaktig måling av underlaget omsetning antall rekonstituert rekombinant membran proteiner.

En mikro-agar Salt Bridge elektrode for å analysere Proton omløpshastighet av rekombinant membran proteiner

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Denne metoden kan hjelpe med undersøkelse av membranproteiner som transportører og kanaler. Informasjonen om substrat omsetning rate tap sammenligne protein aktivitet og spesifisitet og de ulike fysiologiske og patologiske forhold. Den største fordelen med denne teknikken er at den minimerer potensiell skiftvariasjon og kloridfrie bufferforhold.Og øker presisjonen av omsetningsraten fastsettelse på grunn av mer nøyaktige membran potensielle målinger. Samle elementene for knyttneve trinnene. Disse inkluderer to mikrokapilerte pipettespisser, et skarpt blad og en glidende kaliper.For elektroden har sølvtråd, sandpapir og en tre molarkaliumkloridløsning for hånden. I tillegg har etanol og vann for rengjøring og en dc strømforsyning. Fortsett med å arbeide med de to mikropipettespissene.Start med spissen som inneholder bufferen. Plasser det andre tipset ved siden av den første. Flytt den andre spissen, så når den settes inn, vil den smale delen strekke seg minst fem millimeter inn i den smale delen av den første.Merk posisjonen der den første bufferen som inneholder spissen, skal festes. Bruk deretter kaliperen til å måle lengden på mikro-agar salt bridge elektroden. Bruk bladet til å kutte spissen til riktig lengde.Rengjør den kuttede overflaten med etanol etterfulgt av vann. Deretter får du en lengde på omtrent åtte centimeter sølvtråd for elektroden. Rengjør ledningen på våtservietter med etanol etterfulgt av vann.Etter rengjøring, bruk sandpapir for å glatte overflaten på en centimeter lengde i den ene enden. Denne ledningen med sin glattede ende er klar til å være elektrokjemisk belagt. Sett den glatte enden inn i kaliumkloridoppløsningen med den andre enden koblet til en likestrømsforsyning for belegg.Når den er belagt, kobler du fra elektroden og rengjør den med vann. Etter tørking, bestemme lengden som gjør det mulig å trenge inn i mikro kapillær spissen så dypt som mulig. Skjær elektroden fra den ubestrøkede siden til riktig lengde.Nå går du videre for å lage en saltløsning med agarose. I en kolbe som inneholder vann oppløse kaliumklorid og bruke en magnetisk røre for å hjelpe blanding. Etter å ha fjernet røreren, legg til agarose til kolben.Ta kolben til en mikrobølgeovn og varme den for å smelte agarose på ca 100 grader Celsius. Ta det ut for å visuelt sjekke at agarose er oppløst helt. Når agarose er oppløst pipette 10 mikroliter inn i mikrokapillæren sakte for å unngå luftbobler.Det er viktig å nøye pipette agarsaltoppløsningen inn i mikrokapillærspissen, spesielt ved høye agarkonsentrasjoner. Hvis det ikke gjøres riktig luftbobler er lett produsert i spissen og blokkere elektrisk strømning. Etter at du har fjernet spissen fra pipetten, skyver du elektroden inn i den.Sørg for at elektroden trenger inn i saltoppløsningen. Når elektroden er ved romtemperatur, plugg den i en referanseelektrode til en forsterker. Støtt referanseelektroden slik at den kan senkes ned i en plastbeholder med en ett milliliter buffer.Deretter dypper du saltbroelektroden i løsningen. Påfør en spenning og kontroller at det er et strømrespons før du fortsetter. Hvis testen er vellykket, kobler du fra elektrodene.Om nødvendig, lagre saltbroelektroden ved å dyppe den i en tre molarkaliumkloridløsning. Deretter klargjør bufferen som inneholder plastspissen. Ta en mikrokapillær spiss og identifiser et punkt to centimeter fra den smale delen.Bruk en varmeledning til å bøye røret 90 grader i denne posisjonen. Med en skarp kniv kuttet røret fem millimeter fra bøyd. Rengjør området som ble kuttet med etanol etterfulgt av vann.Før du fortsetter, bruk et lett mikroskop med en skala for å måle diameteren på hullet på spissen. Deretter flytter du pipetten for å være nær en beholder med løsemiddel og en annen buffer. Pipette tre mikroliter av oppløsningsvæsken inn og ut av spissen.Fyll deretter målespissen med tre mikroliter buffer. Hent nå saltbroen fra kaliumkloridoppløsningen. Plugg målespissen med bufferen på saltbroelektroden.Koble saltbroeelektroden og referanseelektroden til en forsterker. På dette tidspunktet, suspendere salt bridge elektroden i bufferløsningen med referanseelektroden. En representasjon av konfigurasjonen for eksperimentet er i denne skjematiske.Under forsøket vil membranen danne seg på enden av bufferen som inneholder pipette. Samle inn data for å finne membrankapasiteten. Gjør dette ved å bruke et trekantet vekslende spenningssignal for å skape en rektangulær vekselstrømrespons.Deretter finner du kondukasjon og spenning ved null strøm. Automatiser anvendelsen av en spenningsrampe fra minus 50 til 50 millivolt og registrer strømmen. Tilpass en lineær funksjon til dataene.Skråningen er ledningslinjen, x-intercept er spenningen ved null strøm. Når du er ferdig, fjern målespissen fra saltbroen. Fyll en ny målespiss med buffer, juster den til en annen pH-verdi for å sette opp en protongradient over membranen.Reetabler det eksperimentelle oppsettet med en ny målespiss og elektroder for å gjenta målingene. Her er representative strømspenningsopptak i nærvær av en pH-gradering. Og i fravær av en pH gradient.Linjene representerer en lineær tilpasning til dataene. Skiftet i x-aksekrysspunktet for de forskjellige pH-verdiene forutsies av Nernst-ligningen. Disse dataene representerer skiftet i membranpotensialet i tide for en standard sølvkloridelektrode i hvitt, og mikro-agar saltbroelektroden i svart.Agar salt bridge elektroden var mer stabil med et maksimalt skifte på mindre enn fem millivolt over 300 sekunder av målingen. I denne handlingen av det potensielle skiftet som en funksjon av pH gradient de to elektrodene anses å oppføre seg betydelig annerledes som pH gradient øker. Protonomsetningsraten kan bli funnet og sammenlignet for de to elektrodetypene.Her er protonomsetningstall bestemt for mitokondriefrakoblingsprotein en UCP1 målt ved saltbroelektroden sammenlignet med en standard elektrode. Det finnes også data for tilsvarende forberedt UCP3. Prisene virker mer presise med agar salt bridge elektroden.Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å sikre at elektroden trenger inn i agarsaltløsningen. Saltbroen må også dyppe inn i bufferløsningen. Til slutt må du sørge for at agarsaltoppløsningen ikke inneholder luftbobler.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Neuroscience

Unit 1

Direct-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analyse av Synaptic vesicle Pool Etterfylling i Cultured lillehjernen Granule Neurons bruker FM Fargestoffer

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusjon og eksocytose av membran proteiner i dyrkede Neurons vurdert ved hjelp av Fluorescens Recovery og fluorescens-tap photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

En datamaskin-assistert Multi-elektrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

Design og fabrikasjon av Ultralight Vekt, justerbare Multi-elektrode prober for Elektro Recordings i Mus

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Utarbeidelse av Synaptic Plasma Membran og postsynaptiske Density Proteiner Ved hjelp av en Discontinuous sukrosegradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsavhengig økning i nettverksresponsen til stimulering av neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bestemmelse av eksponering av celloverflate og endocytisk proteinprotein i primære astrocytkulturer ved bruk av biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Kronisk implantation av flere fleksible polymer elektrode rekker

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Lys-indusert molekylær absorpsjon av proteiner ved hjelp av PRIMO system for mikro-mønstre å studere Cell Svar å ekstracellulære Matrix proteiner

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...