Name: a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

Эта работа была поддержана австрийский научный фонд (P31559-B20 в E.E.P.). Авторы благодарят Сара Bardakji за отличную техническую помощь в производстве и воссоздание мышь UCP1 и UCP3 в proteoliposomes.

1. производство рекомбинантных расцеплять белков (UCPs) и формирование Вселенский бислоя мембран
<ol><li>Производить рекомбинантные UCP1 и UCP3, как описано Rupprecht et al. 9 и Hilse и др. 10
</li>
	<li>Формируют Вселенский бислоя мембраны на советы обычных расходные Пластиковые пипетки как описано Бек и др. 7
</li>
</ol>2. Подготовка микро агар соль Мост электрода
<ol><li>Отрегулируйте пипетки микрокапиллярной Совет (см. Таблицу материалы) для соответствующей длины.<ol>
<li>Отметьте положение на пустой оконечности на котором буфера содержащих подсказка будет прикреплен к и использовать раздвижные суппорта для измерения длины электрода микро агар соль мост. Предупреждение: Микрокапиллярной наконечник должен быть достаточно долго ввести буферный раствор для измерений.</li>
		<li>Отрежьте кончик микрокапиллярной с острым ножом или лезвием и чистота поверхности среза с этанол и вода.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовьте покрытием AgCl электродов.<ol>
<li>Cut off Ag проволока около 8 см в длину и очистить его с этанол и вода.</li>
		<li>Возьмите кусок наждачной бумаги и заглаживают поверхности длиной 1 см на конце провода, который должен быть в контакте с солевым раствором.</li>
		<li>DIP сглаженного конца в раствор хлористого калия 3 M и пальто электрохимически с хлоридом с помощью тока 1,5 V 10 s.</li>
		<li>Очистить электрод с водой, высушить его и отрегулировать длину AgCl электродов со стороны немелованной, таким образом, чтобы он проникает кончик микрокапиллярной так же глубоко, как это возможно. Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Приготовляют раствор соли KCl 3 М с агарозы 1% (v/v).<ol>
<li>Весят, 4.47 г KCl и растворяют в 20 мл воды, помешивая его в колбу.</li>
		<li>Снимите мешалку, весят, 0,2 г агарозы и добавить его в колбу.</li>
		<li>Нагревают раствор до 100 ° C до расплава агарозы и предотвратить его от свертывания. Предостережение: Фляга будет очень жарко. Не прикасайтесь к ней с голыми руками. Рекомендуется используйте перчатки для обработки.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Заполните кончик микрокапиллярной раствором соли агарозы. Предупреждение: Решение жарко. Защита рук и работу тщательно, чтобы избежать брызг.<ol>
<li>Если агарозы начинает свертывания, нагревают раствор соли снова таять полностью агарозы.</li>
		<li>Замочите 10 мкл раствора соли агар в кончик микрокапиллярной. Окуните его медленно и тщательно чтобы избежать воздушных пузырей в кончик.</li>
		<li>Удаление кончик из пипетки и нажать в AgCl электродов с широкой стороны наконечника. Убедитесь, что электрод проникает раствор соли.</li>
		<li>Охладить электрода до комнатной температуры и подключите его к усилителю.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовьте буфер для измерений.<ol>
<li>Весят в 0.710 g Na2т4, 0,195 г МЧС, 0,121 g трис и 0,023 g EGTA, затем добавить 100 мл дистиллированной воды в стакан и перемешать раствор.</li>
		<li>Проверьте значение пэ-аша буфера с помощью рН электрода и отрегулируйте значение рН 7,32.</li>
		<li>Проверьте, что электрод сравнения и агар соль Мост электрода электрического контакта.<ol>
<li>Добавьте 1 мл буфера в пластиковый контейнер.</li>
			<li>DIP в электрод сравнения и агар соль Мост электрода и проверить сигнал ответа. Если сигнал ответ правильно, переходите к шагу 2.7.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Если есть ложный сигнал ответа или без электрического контакта на всех, устранения следующих неполадок.<ol>
<li>Проверьте, если электрод находится в контакте с раствор соли и нажмите электрода в раствор. Примечание: Если решение уже слишком липкое, удалите микро агар соль мост и подготовить новый наконечник микрокапиллярной.</li>
		<li>Проверьте, если есть пузырьков воздуха в раствор соли. Если да, подготовьте новый наконечник микрокапиллярной.</li>
		<li>Проверьте, если раствор соли находится в контакте с буферным раствором. Если нет, то отрезали еще 1 мм конца трубки наконечника. Предупреждение: Убедитесь в том, что Совет все еще достаточно долго, чтобы проникнуть буфера содержащих кончик. Если еще нет контактов, подготовьте новый наконечник микрокапиллярной.</li>
		<li>Если ни один из этих шагов поможет, подготовьте новый наконечник микрокапиллярной.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Для хранения окуните агар соль Мост электрода в раствор хлористого калия 3 M. Примечание: Протокол может быть остановлено здесь. Для паузы в одночасье, храните электрода в солевом растворе KCl 3 М при 4 ° C.</li>
	<li>Подготовьте буфера содержащих пластикового наконечника. Примечание: Если электрод хранилась на ночь, принять его и пусть он тепла до комнатной температуре в течение 30 мин.<ol>
<li>Возьмите микрокапиллярной наконечник и согнуть трубу, 2 см от края узкая часть, примерно 90 градусов с помощью Отопление проволоки.</li>
		<li>Используйте очень острым ножом или лезвием и отрезали трубку около 5 мм от сгиба.</li>
		<li>Очистить поверхность в конце с этанол и вода и измерить диаметр отверстия наконечник. Исходя из этого Вычислите площадь поверхности.</li>
		<li>Покройте поверхность наконечника с 85:15 (v: v) гексана: гексадекан.<ol>
<li>Пипетка 3 мкл растворителя и удалить его из наконечника.</li>
			<li>Подождите 1 мин, таким образом, чтобы все остаточного растворителя в кончик испарилась.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Заполните измерительный наконечник с 3 мкл буфера и подключите его на соль Мост электрода. Примечание: Проверьте снова если соль Мост электрода и электрод сравнения электрического контакта, выполнив шаг 2.5.3.</li>
		<li>Если нет электрического контакта, проверьте следующее:<ol>
<li>Проверьте, является ли соль Мост электрода при контакте с буферным раствором. Если нет, то увеличить объем буфера в кончик или подготовить больше кончик микрокапиллярной.</li>
			<li>Если пузырек воздуха, удалите наконечник из микро солевой мост электрода, заполнения буфера в кончик и снова подключите его электрода.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. измерения электрических параметров мембраны с рекомбинантных белков
<ol><li>Применить треугольной переменного напряжения сигнала с максимальное напряжение UМакс = 50 МВ и ΔTрамп = 50 мс, которые создает прямоугольный переменного тока ответ. Средние значения токов положительной и отрицательной (я+ и–) Вычислите потенциал мембраны по следующей формуле: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>Применить напряжения рамп, начиная от -50 мВ до 50 МВ и запись текущей. Соответствовать линейной функции для данных - наклон проводимости - и вычислить точку пересечения оси x fit.</li>
	<li>Выполнять решения в пластиковый наконечник и заполнить новую с буфер, содержащий расширение субстрата концентрации.<ol>
<li>Если не мембраны формируется в течение первых 20-30 s, выполнять объем и пополнить его. Это гарантирует, что градиент концентрации через мембрану существенно не изменяется во время формирования мембраны.</li>
		<li>После формирования мембраны выполните 3.1 и 3.2 снова для проверки правильного формирования мембраны и получить точку пересечения оси x.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Расчет оборачиваемости субстрата
Примечание: Смотрите предыдущие работы детали3,7.
<ol><li>Приблизительное количество белка в мембране от молекулярной массы липидов и белков (Mлипидов и Mбелок), площадь мембраны и начальник группы одной липидов (мембраны илипидов) и массе белка на липидов (r). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Вычислите потенциал для перевозимых субстрата Нернста. R-это константа газа, T-температура, z бесплатно перевозимого субстрата, F Фарадея постоянной и c1 и c2 концентрации субстрата обе стороны мембраны. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>С вольт амперных записей принимают обратное потенциальных рассчитывается с разницей точки пересечения оси от линейной вписывается в наличие и отсутствие градиента субстрата.</li>
	<li>Рассчитайте долю субстрата проводимости, Gсубстрат, чтобы общая мембраны проводимости, Gвсего, соотношение обратного потенциал Нернста потенциальных11. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Рассчитать число ΔN субстрат оборотсубстрата в время блока ΔT от субстрата проводимости (Gсубстрата), приложенного напряжения U и заряд субстрат z: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>От соотношения перевозимых субстрата за время количество белков Вычислите κ скорость оборота. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+research+in+drug+discovery.">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li><li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+chloride+electrode:+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents.">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li><li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+kinetics+of+uncoupling+proteins.+Analysis+of+UCP1+reconstituted+in+planar+lipid+bilayers.">Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+human+uncoupling+proteins+1+and+2+in+planar+lipid+bilayers.">Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers.</a> The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).</li><li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+intrapipette+salt+bridge.">A simple intrapipette salt bridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+technique+for+the+reconstitution+of+hydrophobic+proteins+into+planar+bilayer+membranes.+Studies+of+human+recombinant+uncoupling+protein+1.">A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li><li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate.">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li><li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak.">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li><li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue.">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li><li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology.">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li><li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices.">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Осуществление микро агар соль мост с электродом минимизирует его потенциал распространения и позволяет более точные измерения мембранного потенциала порожденных градиента рН. При наличии различных трансмембранного рН градиенты, потенциального сдвига обоих электродов является приемлемым на ΔpH = 0,35 при сравнении к значению теоретический потенциал уравновешения Нернста (ΦНернста = 23,8 mV для ΔpH = 0,4). Однако в более физиологических рН градиенты, как экземпляр в митохондриях между матрицей и межмембранное пространства, Стандартный AgCl электродов не позволяет точно измерить потенциал сдвига на ΔpH = 1 (рис. 3А). Электрод, мостовой с микро агар соли доставлены ценности, которые были гораздо более сопоставимы с теории.
Диффузия потенциал может возникнуть на электрод сравнения AgCl если буферный раствор изменяется во время эксперимента. Хлоридно свободный буферный раствор был использован в экспериментах с расцеплять белки были предложены для транспортировки хлорид-ионов, и pH была скорректирована с помощью трис или МЧС. Электродный потенциал, в отсутствие существенной концентрации хлорида, в первую очередь зависит от примесей хлорида в буферном растворе. Как его состав изменяется в ходе экспериментов, это просто приведет к постоянной смещения потенциал. Однако для измерения абсолютной разности потенциалов между двумя электродами, систему соли мост простой агар (Ag/AgCl 3 M KCl) может также использоваться для электрод сравнения.
Микро агар соль Мост остатки диффузии потенциал путем уравновешивания электродный потенциал. Для того чтобы стабилизировать раствор соли, агарозы 1% (w/v) был добавлен для предотвращения смешивания солевого раствора с буферным раствором. Соли ионов K+ и Cl– имеют аналогичные подвижности в жидкости и сбалансировать электродный потенциал. Чтобы правильно установить соль мост, солевой раствор Агар имеет достаточно нагревается заполнения кончик микрокапиллярной без каких-либо воздушных пузырьков и покрыть AgCl электродов. Перед дальнейшим использованием электрического контакта между электродом соль мост и электрод сравнения должна быть проверена. В зависимости от времени, которое используется соль Мост раствор соли должно быть достаточно загущенное для предотвращения любого смешивания солевого раствора с буфером. Это особенно важно, если расследование K+ или Cl– транспортеры. Соль мост был использован для очень короткое время и элюции агарозы незначительна в этот промежуток времени. Более высокую концентрацию агарозы до 5%, или агар (3% - 5%), позволяет использовать соль мост для более длительного периода времени6,12.
Этот метод позволяет определить транспорта кинетики мембраны транспортера (i) с низкой текучести и (ii) митохондриальных протеинов внутренней мембраны, которые вряд ли могут быть исследованы в структурах зажим Стандартный патч13. Его точность зависит главным образом от обратного измерение потенциала, точность которых уменьшается в проводимости низкой общей мембраны и небольших градиенты концентрации, которые вызывают мембранного потенциала ниже шум записи.
С помощью этой настройки, были измерены текучести UCP1 и UCP3, как производится на тех же условиях. Из-за более высоких рН градиента полученные показатели, как представляется, быть более точным и невозмущенной, артефакты, результате потенциального сдвига небольшие электродный. Он может использоваться для дальнейшего анализа и сравнения митохондриальной мембраны перевозчиков производится в аналогичных условиях.

Мембранные белки являются мишенью до 60% от всех известных фармацевтических препаратов1. Электрофизиологические измерения мембранных белков являются мощный, но тонкий инструмент для анализа electrogenic перевозки субстратов, посредничестве мембраны несущей белков. Модуляция трансмембранный ток приложением напряжения постоянного тока или напряжения рампы позволяет оценить фармакологических и физические свойства перевозчиков, например, активации и торможения субстратов или транспортом Кинетика. Особый интерес представляет номер оборота субстрат, который отображает количество субстрата, перемещен, мембранные белки в единицу времени. Это основной параметр, при сравнении кинетика различных мембранных белков. Создание градиента концентрации субстрата взимается через мембрану генерирует ЭДС, из которого выводится оборот количество субстрата.
С помощью AgCl электродов, наличие хлоридно свободный буфера создает потенциал диффузии, который изменяет электродный потенциал и приводит к смещению в измерения напряжения тока2. Хотя всегда присутствует, это незначительно для стандартных проводимости и измерения емкости, так как эти параметры являются либо зависимых на склоне вольт амперных запись (проводимость) или являются разница одной записи (мощности), который отменяет потенциал. Однако запись обратного потенциал, который создается на транспорте субстрата, может значительно встревожена диффузии потенциал. Таким образом для точного измерения обратного потенциал, электродных потенциалов должны быть неизменным.
Потенциального распространения могут быть уменьшиты двумя методами: (i) в присутствии из бислоя мембраны, концентрации субстрата должно быть увеличено на одной стороне мембраны3,4, или (ii) соль Мост остатки электродный потенциал 5. Первый способ заключается в значительной степени зависит от стабильности измерений. Мембрана имеет выжить в течение нескольких минут, от добавления субстрата при перемешивании до тех пор, пока субстрат почти равномерно распределены в решении. Если мембрана разрывов между ними, субстрат градиента изменяется путем свободного обмена заряженные молекулы, и измерения включите неточными. Последний метод остатки диффузии потенциальных, но ограничен размер структуры. Осуществление небольшой, но функционирования соль мост в микро диапазоне электрофизиологических настройки является сложным6. Для последнего метода раствор соли заполняется в кончик микрокапиллярной и стабилизированная добавлением агарозы для предотвращения диффузии соли раствора для буферного раствора.
В этом протоколе описан простой производства микро агар соль мост и внедрение в электрофизиологических настройки, основанные на пипетку set-up7 . Микрокапиллярной наконечник корректируется для содержать раствором KCl 3 M с 1 моль % (w/v) агарозы и преодоления AgCl электродов и буферной решение. Преимущество микро солевой мост отображается время записи электродный потенциал сдвига и более точные измерения мембранного потенциала в различных рН градиентов. В системе модель рекомбинантных белков в липосомах текучесть митохондриальной перевозчиков, UCP1 и UCP3, производится в аналогичных условиях связи и по сравнению с предыдущим результаты3,8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:325px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:345px;">5242956.003</td>
			<td style="width:167px;">Microcapillary pipette tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol 99%</td>
			<td>AustrAlco &#214;sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td>
			<td>AAAH-5020-07025-230317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kaliumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DC supply</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>V10/CPG 1940 -01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose Standard</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3810.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample tube</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>5863.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2SO4</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>8560.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MES</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>4256.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexadecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating wire</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>USPS-2250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins

На сегодняшний день, более 50% всех фармакологических препаратов целевой транспорта кинетика мембранных белков. Электрофизиологические характеристики мембранных белков перевозчик воссоздана в липидного бислоя мембраны это мощный, но тонкий метод для оценки их физико-химических и фармакологических свойств. Номер оборота субстрата является уникальный параметр, который позволяет сравнения деятельности различных мембранных белков. В electrogenic транспорта градиент translocated субстрата создает потенциал мембраны, которая напрямую коррелирует субстрата текучесть белка. С помощью электродов хлорид серебра, диффузии потенциал, также называется жидкий Джанкшен потенциал, наведено, который изменяет электродный потенциал и существенно мешает потенциальным измерения точные мембраны. Диффузия потенциальных могут быть уменьшиты соль мост, который уравновешивает электродный потенциал. В этой статье микро агар соль мост предназначен для улучшения электрофизиологических настройки, который использует micropipettes для формирования мембраны. Раствор соли заполняется в кончик микрокапиллярной пипетку, стабилизированная добавлением агарозы и может быть легко установлен Стандартный электрод. Электродный потенциал электрода микро солевой мост является более стабильным по сравнению с Стандартный электрод. Внедрение этой системы стабилизирует электродный потенциал и позволяет более точные измерения мембранного потенциала порожденных градиента рН. С помощью этой системы, Протон текучести митохондриальной перевозчиков, UCP1 и UCP3 связи и по сравнению с ранее измерений.

Чтобы проверить минимизации потенциальных диффузии, была измерена стабильность измерений-амперных нетронутыми мембраны. Рисунок 2Aпредставитель-амперных записи изображены в присутствии (белые точки) и отсутствие (черных точек) градиента рН. Согласно уравнению Нернста градиента рН вызывает сдвиг в напряжения. От точки пересечения оси линейного подходят к данным рассчитывается потенциального сдвига. Чтобы протестировать оба электродов, сдвиг в точке пересечения оси были проанализированы для стандартного AgCl электродов (рис. 2B; белые точки) и микро агар соль мост (рис. 2B; черные точки). Рампа напряжения был записан в десять раз подряд и означает сдвиг по оси x изображен против времени. В то время как электрод агар соль Мост был максимальный сдвиг менее 5 МВ даже после 300 секунд измерения, Стандартный электродный варьируется до 30 МВ в непредсказуемой, случайные, поведение.
Далее оба электроды были протестированы в различных рН градиентов (рисA). Для стандартных электродных был создан градиента рН 0,35 и 1.0 (белые точки); для агар соль Мост электрода, рН градиенты 0,35, 0,7 и 1.0 (черные точки). Сдвиг в потенциал был проанализирован в трех независимых измерений. В отличие от градиент 0.35, где измеренное сдвиг только слегка меняется, напряжения сдвига значительно изменяет в градиента рН 1,0 в отсутствие микро агар соли моста. С линейной подходят к данным наклон функция является 26,4 ± 2.3 МВ/ΔpH для стандартных электродных и 50,1 ± 4,6 МВ/ΔpH для микро агар соль Мост электрода. Согласно уравнению Нернста, рассчитанные потенциальных сдвиг является 60.7 МВ/ΔpH при T = 32 ° C.
С помощью микро агар соль мост, оборот число протонов, κ митохондриального UCP1 и UCP3 был измеряется и сравнивается с предыдущих измерений (рис. 3B). Похож на Рисунок 3A, ΔpH = 1.0 была создана и была измерена обратный потенциал. Количество белка в мембране оценивалась по формуле, содержащейся в статье 4 протокола, с белками соотношение липидов 4 мкг / (мг липидов), молекулярной массой 33000 и 750 Да для белков и липидов, площадь поверхности мембраны 3,53 x 10 -4 см2и область за липидов 7.8 x 10-15 см2. Полученные κwas 5,56 ± 0,38 s-1 и 4.10 ± 0,71 s-1 для UCP1 и UCP3, соответственно (рис. 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> Рисунок 1 : Электрофизиологических set-up с микро агар соль мост. (A) Эта панель показывает эскиз set-up. Кончик микрокапиллярной, содержащих агар солевого раствора (изображены в оранжевый) помещается между электродом (черный) и кончик буфера содержащих (синий). Мембрана образуется на поверхности в конце буфера содержащих кончика (указано стрелкой). (B) Эта группа показывает изображение электрофизиологических set-up с осуществлением микро агар соли моста. Стрелки указывают на электроде, микро агар соль мост, электрод сравнения и контейнер с буферным раствором. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> Рисунок 2 : Сравнение микро агар соль мост и стандартный электродный AgCl. (A) Эта группа показывает представитель-амперных измерение в присутствии (серые точки) и отсутствие (белые точки) градиента рН 1. Линии представляют линейной подходят для данных, от которого проводимости и оси пересечения значения получаются. Напряжение сдвига оценивается по разности значения пересечения обеих записей. (B) Эта группа показывает смещение мембраны потенциал стандартного AgCl электрода (белые точки) для микро агар соль Мост электрода (черных точек) в времени. Десять-амперных измерения были записаны в ряд и среднее напряжение сдвига путем диффузии потенциальных заговор против времени. В всех экспериментов мембрана была сделана из 45:45:10 моль % с 15% мол арахидоновой кислоты в концентрации 1,5 мг/мл DOPC:DOPE:CL. Буфер содержит 50 мм Na2т4, 10 мм MES, 10 мм трис и 0,6 мм EGTA при pH = 7.34 и T = 32 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> Рисунок 3 : Протон оборот количество UCP1 и UCP3 рассчитывается от обратного потенциал при наличии градиента рН. (A) Эта группа показывает сдвиг в потенциал мембраны UCP1-содержащих различных градиентов рН Стандартный AgCl электродов (белые точки) и микро агар соль Мост электрода (черные точки). Линии представляют линейной подходят к данным. (B) Эта группа показывает количество UCP1 Протон оборот (первый набор данных) и UCP3 (второй набор данных) как вычисляемые от соотношение напряжения сдвига, Нернста потенциал по формулам в разделе 4 протокола. Первый бар каждого набора представляет текучесть, измеренная с микро агар соль мост. Второй бар каждого набора данных представляет предыдущих измерений с использованием стандартных AgCl электродов. Значения для UCP1 и UCP3 были взяты из Urbankovaи др. 3 и Мачер и др. 8. при всех измерениях, мембрана была сделана из 45:45:10 моль % DOPC:DOPE:CL с 15 моль % AA и UCP1/UCP3. Концентрацию липидов и белков был 1,5 мг/мл и 4 мкг/мг липидов, соответственно. Буфер содержит 50 мм Na2т4, 10 мм MES, 10 мм трис и 0,6 мм EGTA при pH = 7.34 и T = 32 ° C. PH буфера для градиентные измерения было увеличено до 7,66, 8.00 или 8.33, добавляя трис и было изменено в раствор, содержащий пипеткой. Значения являются среднее ± стандартное отклонение трех независимых измерений. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

В электрофизиологические измерения наличие потенциальных диффузии мешает точное измерение обратной потенциал, изменяя электродный потенциал. С помощью микро агар соль мост, влияние диффузии потенциальных сводится к минимуму, что позволяет более точное измерение субстрата оборот чисел восстановленный рекомбинантных мембранных белков.

Микро агар соль Мост электрод для анализа текучести Протон рекомбинантных мембранных белков

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Этот метод может помочь с исследованием мембранных белков, таких как транспортеры и каналы. Информация о потере оборота субстрата сравнивает белковую активность и специфичность и различные физиологические и патологические состояния. Основным преимуществом этого метода является то, что он сводит к минимуму потенциальные изменения сдвига и условия буфера без хлорида.И значительно повышает точность определения скорости оборота за счет более точных мембранных потенциальных измерений. Соберите элементы для кулачных шагов. К ним относятся два микро-капиллярных пипетки советы, резкое лезвие и раздвижной калипер.Для электрода есть серебряная проволока, песчаная бумага и три молярного раствора хлорида калия под рукой. Кроме того, этанол и вода для очистки и питания постоянного тока. Продолжить работу с двумя микро-пипетки советы.Начните с наконечника, который будет содержать буфер. Поместите второй наконечник рядом с первым. Перемести второй наконечник, так что при вставке его узкая часть будет простираться не менее пяти миллиметров в узкую часть первой.Отметте положение, в котором будет прикреплен первый буфер, содержащий наконечник. Затем используйте калипер для измерения длины микро-агар соляной мост электрода. Используйте лезвие, чтобы сократить кончик до соответствующей длины.Очистите срезаную поверхность этанолом, за которым последует вода. Далее, получить длину около восьми сантиметров серебряной проволоки для электрода. Очистите проволоку на салфетках этанолом, за которым последует вода.После очистки используйте песчаную бумагу, чтобы сгладить поверхность на один сантиметр длиной на одном конце. Эта проволока с ее сглажеженным концом готова к электрохимическому покрытию. Положите сглаженый конец в раствор хлорида калия с другим концом, подключенным к источнику питания для покрытия.При покрытии отключите электрод и очистите его водой. После высыхания определите длину, которая позволяет ему проникать в микро капиллярный кончик как можно глубже. Отрежьте электрод с неокрашенной стороны до соответствующей длины.Теперь, перейти к подготовке соленого раствора с агарозой. В колбе, содержащей воду растворить хлорид калия и использовать магнитный мешалка для оказания помощи смешивания. После снятия мешалки добавить агарозу в колбу.Возьмите колбу в микроволновую печь и нагреть его, чтобы расплавить агарозу при температуре около 100 градусов по Цельсию. Возьмите его, чтобы визуально проверить, что агароза растворяется полностью. После того, как агароза растворяется пипетка 10 микролитров в микро-капилляр медленно, чтобы избежать пузырьков воздуха.Важно тщательно пипетки агар солевой раствор в микро капиллярный кончик, особенно при высоких концентрациях агара. Если не сделано должным образом пузырьки воздуха легко производятся в кончике и блокировать электрический поток. После снятия наконечника с пипетки нажмите электрод в него.Убедитесь, что электрод проникает в соляной раствор. Когда электрод находится при комнатной температуре, подключите его к эталону электрода в усилитель. Поддержите эталонный электрод, чтобы его можно было опустить в пластиковый контейнер с одним миллилитров буфера.Затем окуните электрод соленого моста в раствор. Нанесите напряжение и убедитесь, что есть текущий ответ, прежде чем продолжить. Если тест будет успешным, отключите электроды.При необходимости храните электрод соленого моста, окуная его в трехялолярный раствор хлорида калия. Затем подготовьтесь к буферу, содержащем пластиковый наконечник. Возьмите микро капиллярный наконечник и определите точку в двух сантиметрах от узкой части.Используйте нагревательный провод, чтобы согнуть трубку на 90 градусов в этом положении. Острым ножом вырезали трубку в пяти миллиметрах от изогнутой. Очистите область, которая была сокращена с этанолом следуют воды.Прежде чем приступить, используйте световой микроскоп с шкалой для измерения диаметра отверстия на кончике. Затем перемести пипетки рядом с контейнером растворителя и еще одним буфером. Pipette три микролитров растворителя в и из кончика.Затем заполните наконечник измерения тремя микролитров буфера. Теперь извлечения соляного моста из раствора хлорида калия. Подключите наконечник измерения буфером к электроду соляного моста.Подключите электрод соляного моста и эталонный электрод к усилителю. На этом этапе приостанавливаем электрод соляного моста в буферный раствор со эталонным электродом. Представление конфигурации для эксперимента находится в этой схеме.В ходе эксперимента мембрана сформируется в конце буфера, содержащего пипетку. Соберите данные, чтобы найти емкость мембраны. Сделайте это, применяя треугольный переменный сигнал напряжения для создания прямоугольной реакции переменного тока.Далее, найти проводимость и напряжение при нулевом токе. Автоматизировать применение рампы напряжения в диапазоне от минус 50 до 50 милливольт и зафиксировать ток. Подходит для линейной функции данных.Склон является проводимость, x-перехват напряжения при нулевом токе. После этого удалите наконечник измерения с соляного моста. Заполните новый наконечник измерения буфером, отрегулируйте его под различное значение рН, чтобы настроить протонный градиент по всей мембране.Восстановить экспериментальный набор с новым наконечником измерения и электродами для того, чтобы повторить измерения. Вот репрезентативные текущие записи напряжения в присутствии градиента рН. И, при отсутствии градиента рН.Линии представляют собой линейное подгонки к данным. Сдвиг точки пересечения х оси для различных значений рН прогнозируется уравнением Нернста. Эти данные представляют собой сдвиг в мембранном потенциале во времени для стандартного электродела хлорида серебра в белом, и микро-агар солевой мост электрод в черном.Электрод моста соли агара был более стабилен с максимальным переносом меньш чем 5 милливольт над 300 секундами измерения. В этом участке потенциального сдвига в качестве функции градиента рН два электрода, как видно, ведут себя значительно по-разному по мере увеличения градиента рН. Скорость оборота протонов может быть найдена и сравнена для двух типов электродов.Здесь номера оборота протона определенные для митохондриального uncoupling протеина одного UCP1 измеренного электродом моста соли сравненным к стандартному электроду. Имеются также данные по аналогично подготовленной ОГП3. Тарифы кажутся более точными с электродом моста соли агара.При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы электрод проникает в раствор соли агара. Соляной мост должен также окунуться в буферный раствор. Наконец, убедитесь, что раствор соли агара не содержит пузырьков воздуха.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Neuroscience

Unit 1

Direct-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Боковая диффузия и экзоцитоз мембранных белков в культивируемых нейронов оценивали по флуоресценции и флуоресценции восстановления потерь фотообесцвечивания

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Компьютерный многоэлектродной патч-зажим система

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

Проектирование и изготовление Ultralight Вес, Регулируемые многоэлектродной Зонды для Электрофизиологические записи в мышах

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Подготовка Synaptic плазматической мембраны и Постсинаптических белков плотности с использованием разрывной градиента сахарозы

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Зависящее от времени увеличение ответа сети на стимуляцию нейронных клеточных культур на микроэлектродных массивах

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Определение экспрессии клеточной поверхности и эндоцитарной скорости белков в культурах первичных астроцитов с использованием биотинилирования

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Хроническая имплантация нескольких гибких полимерных электродов

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Светиндуцированная молекулярная адсорбция белков с использованием системы PRIMO для микро-паттернинга для изучения реакции клеток на внеклеточные матричные белки

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...