Name: a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

Detta arbete stöds av den österrikiska forskningsfond (P31559-B20 till E.E.P.). Författarna tackar Sarah Bardakji med utmärkta tekniska bistånd inom produktion och beredning av mus UCP1 och UCP3 i proteoliposomes.

1. produktion av rekombinant Uncoupling proteiner (UCPs) och bildandet av Planar lipidens membran
<ol><li>Producera rekombinant UCP1 och UCP3 som beskrivs av Rupprecht o.a. 9 och Hilse o.a. 10
</li>
	<li>Bilda planar lipidens membran på tips av konventionella dispensable plast pipetter som beskrivs av Beck et al. 7
</li>
</ol>2. beredning av mikro-agar Salt Bridge elektroden
<ol><li>Justera microcapillary pipett spets (se Tabell för material) till lämplig längd.<ol>
<li>Markera en tom spets som buffert innehållande spetsen kommer att knytas till och använda en glidande skjutmått mäta längden på mikro-agar salt bridge elektroden. Varning: Microcapillary tipset måste vara tillräckligt lång för att ange buffertlösningen för mätningarna.</li>
		<li>Skär microcapillary spetsen med en vass kniv eller ett blad och rengör den skurna ytan med etanol och vatten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered Granulatfyllda-belagda elektroden.<ol>
<li>Skär av en Ag binder av ca 8 cm i längd och rengör den med etanol och vatten.</li>
		<li>Ta en bit sandpapper och jämna ner ytan av 1 cm längd i slutet av tråden, som bör vara i kontakt med saltlösningen.</li>
		<li>Doppa jämnas ut slutet i en 3 M KCl-lösning och päls det elektrokemiskt med klorid med likström 1,5 V för 10 s.</li>
		<li>Rengöra elektroden med vatten, torka den och justera längden på Granulatfyllda elektroden från obestruket sida så att det tränger igenom microcapillary spetsen så djupt som möjligt. Obs: Protokollet kan pausas här.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bered en 3 M KCl salt med 1% (v/v) agaros.<ol>
<li>Väg upp 4,47 g av KCl och lös upp det i 20 mL vatten genom omrörning det i en kolv.</li>
		<li>Ta bort omröraren, väg upp 0,2 g av agaros och lägga till kolven.</li>
		<li>Hetta upp lösningen till 100 ° C för att smälta Agarens och förhindra det från att levra. Varning: Kolven kommer att vara mycket heta. Inte röra den med händerna. Använd handskar för hantering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fyll microcapillary spets med agarosgelelektrofores saltlösningen. FÖRSIKTIGHET: Lösningen är heta. Skydda händer och arbete noggrant för att undvika stänk.<ol>
<li>Om Agarens börjar koagulering, värma upp salt lösningen att helt smälta Agarens igen.</li>
		<li>Blötlägg 10 µL agar saltlösningen i microcapillary spets. Blötlägg det långsamt och försiktigt att undvika luft bubblor i spetsen.</li>
		<li>Ta bort spetsen från pipetten och tryck i Granulatfyllda elektroden från den bredare sidan av spetsen. Säkerställa att elektroden tränger saltlösningen.</li>
		<li>Kyla ner elektroden till rumstemperatur och Anslut det till förstärkaren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbereda bufferten för mätningarna.<ol>
<li>Väg upp 0.710 g Na2SO4, 0,195 g mes, 0.121 g TRIS, och 0.023 g EGTA, sedan lägga till 100 mL destillerat vatten i en bägare och rör om lösningen.</li>
		<li>Kontrollera pH värdet i bufferten med hjälp av en pH-elektrod och justera pH-värdet till 7,32.</li>
		<li>Kontrollera att referenselektroden och agar salt bridge elektroden är i elektrisk kontakt.<ol>
<li>Tillsätt 1 mL buffert en plastdunk.</li>
			<li>Doppa i referenselektroden och agar salt bridge elektroden och kolla på en signal svar. Om signalen svaret är korrekt, Fortsätt till steg 2,7.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om det finns en falsk signal svar eller ingen elektrisk kontakt alls, utför följande felsökning.<ol>
<li>Kontrollera om elektroden är i kontakt med saltlösningen och skjut elektroden i lösningen. Obs: Om lösningen redan är alltför klibbig, ta bort mikro-agar salt bron och förbereda en ny microcapillary spets.</li>
		<li>Kontrollera om det finns luftbubblor i saltlösningen. Om ja, förbereda en ny microcapillary spets.</li>
		<li>Kontrollera om saltlösningen är i kontakt med buffertlösningen. Om så inte är fallet, sedan skära av en annan 1 mm tube ände spetsen. Varning: Glöm inte att spets är fortfarande tillräckligt länge för att penetrera buffert innehållande spetsen. Om det finns fortfarande ingen kontakt, förbereda en ny microcapillary spets.</li>
		<li>Om inget av dessa steg hjälpa, förbereda en ny microcapillary spets.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förvaring, doppa agar salt bridge elektroden i ett 3 M KCl-lösning. Obs: Protokollet kan stoppas här. För en paus över natten, lagra elektroden i 3 M KCl salt lösning vid 4 ° C.</li>
	<li>Förbereda den buffert innehållande plastspets. Obs: Om elektroden lagrat över natten, ta ut och låt den värma upp till rumstemperatur i 30 min.<ol>
<li>Ta en microcapillary spets och böj röret, 2 cm från kanten av den smala delen, ungefärligt 90 grader med hjälp av en värme-tråd.</li>
		<li>Använder en mycket vass kniv eller ett blad och skär av röret runt 5 mm från böjen.</li>
		<li>Rengör ytan i slutet med etanol och vatten och Mät diametern på hålet i spetsen. Från detta, beräkna hur mycket av ytan.</li>
		<li>Täck ytan av spetsen med 85:15 (v: v) hexan: hexadecane.<ol>
<li>Pipettera 3 µL av lösningsmedlet och ta bort den från spets.</li>
			<li>Vänta 1 minut så att allt återstående lösningsmedel i spetsen har avdunstat.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fyll mätning spetsen med 3 µL buffert och Anslut den på salt bridge elektroden. Obs: Kontrollera igen om salt bridge elektroden och referenselektroden är i elektrisk kontakt genom att utföra steg 2.5.3.</li>
		<li>Om det finns ingen elektrisk kontakt, kontrollera följande:<ol>
<li>Kontrollera om salt bridge elektroden är i kontakt med buffertlösningen. Om inte, sedan antingen öka volymen av bufferten i spetsen eller förbereda en längre microcapillary spets.</li>
			<li>Om det finns en luftbubbla, bort spetsen från mikro-salt bridge elektroden, fylla bufferten i spetsen och Anslut den till elektroden igen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mätning av de elektriska parametrarna av membranet rekonstitueras med rekombinant Protein
<ol><li>Tillämpa en triangulär alternerande spänningssignal med maximal spänning Umax = 50 mV och ΔTramp = 50 ms, vilket skapar en rektangulär växelström svar. Från medelvärdena av de positiva och negativa strömmarna (jag+ och jag–), beräkna kapaciteten av membranet enligt följande formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>Tillämpa en spänning ramp alltifrån -50 mV + 50 mV och post nuvarande. Passar en linjär funktion till data - backen är konduktans - och beräkna x-axeln skärningspunkten av passformen.</li>
	<li>Fullgöra lösningen i plast spets och fylla en ny med en buffert som innehåller en ökad substrat koncentrationen.<ol>
<li>Om ingen membran bildas inom den första 20-30 s, ansvarsfrihet volymen och fylla den. Detta garanterar att koncentrationsgradient över membranet inte väsentligt förändras under membranet bildandet.</li>
		<li>Efter bildandet av ett membran, utför steg 3.1 och 3.2 igen för att bekräfta korrekt membran bildas och för att få x-axeln skärningspunkten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. beräkning av substrat Omsättningshastigheten
Obs: Se tidigare arbete för detaljer3,7.
<ol><li>Uppskatta mängden protein i membranet från det molekylära samlas av lipider och protein (MLipid och MProtein), området av membranet och av en lipid huvud grupp (ettmembran och enLipid) och massa förhållandet av protein per lipid (r). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Beräkna Nernst potential för transporteras substratet. R är gaskonstanten, T temperaturen, z laddningen av transporterade substratet, F i Faradays konstant, och c1 och c2 koncentrationerna av substrat för båda sidor av membranet. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>Av ström-spänning inspelningar, ta omvänt potentiella beräknas med skillnaden av x-axeln korsningen punkter från den linjära passar i närvaro och frånvaro på toningen som substrat.</li>
	<li>Beräkna andelen substrat konduktans, Gsubstrat, att den totala membran konduktans, Gtotalt, av förhållandet mellan omvänd potential att Nernst potentiella11. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Beräkna de substrat omsättning nummer ΔNsubstrat per tid enhet ΔT från de substrat konduktans (G-substrat), spänningen U och laddningen av de substrat z: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>Från förhållandet av transporterade substrat per gång till numrera av proteiner, beräkna den omsättning rate κ. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+research+in+drug+discovery.">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li><li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+chloride+electrode:+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents.">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li><li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+kinetics+of+uncoupling+proteins.+Analysis+of+UCP1+reconstituted+in+planar+lipid+bilayers.">Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+human+uncoupling+proteins+1+and+2+in+planar+lipid+bilayers.">Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers.</a> The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).</li><li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+intrapipette+salt+bridge.">A simple intrapipette salt bridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).</li><li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+technique+for+the+reconstitution+of+hydrophobic+proteins+into+planar+bilayer+membranes.+Studies+of+human+recombinant+uncoupling+protein+1.">A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li><li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate.">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li><li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak.">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li><li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue.">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li><li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology.">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li><li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices.">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Genomförandet av mikro-agar salt bron med elektroden minimerar dess potentiella diffusion och tillåter mer precisa mätningar av membranpotentialen genereras av en pH-gradient. I närvaro av olika transmembrana pH övertoningar, potentiella förskjutningen av båda elektroderna var acceptabelt på ΔpH = 0,35 när jämförande till det teoretiska värdet av Nernst equilibriumen potentiella (ΦNernst = 23,8 mV för ΔpH = 0,4). Men på mer Fysiologiskt pH lutningar, som för instans i mitokondrier mellan matrisen och intermembrane utrymme, standard Granulatfyllda elektroden misslyckades att exakt mäta det potentiella skiftet på ΔpH = 1 (figur 3A). Elektroden överbryggas med mikro-agar salt levereras de värden som var mycket mer jämförbara med teorin.
Diffusion potentiella kan också uppstå vid Granulatfyllda referenselektroden om buffertlösningen ändras under experimentet. Klorid-fri buffertlösning användes i experimenten sedan uncoupling protein föresloggs för att transportera kloridjoner, och pH justerades med Tris eller MES. Elektroden potential, i avsaknad av en betydande koncentration av klorid, beror främst på klorid orenheter i buffertlösningen. Dess sammansättning är oförändrad under experimenten, kommer det bara resultera i en konstant offset potential. För mätning av en absolut potentialskillnaden mellan de två elektroderna, kunde dock en enkel agar salt-bridge systemet (Ag/Granulatfyllda 3 M KCl) även användas för referenselektroden.
En mikro-agar salt bro balanserar den potentiella spridningen genom en Jämviktstiden av elektroden potentiella. För att stabilisera saltlösningen, lades 1% (w/v) agaros till förhindra blandning av saltlösningen med buffertlösningen. Salt jonerna K+ och Cl– har liknande mobiliteter i vätska och balansera elektroden potentiella. För att korrekt installera salt bron, har agar salt lösningen till vara tillräckligt värms upp att fylla den microcapillary spetsen utan eventuella luftbubblor och för att täcka Granulatfyllda elektroden. Innan ytterligare användning har elektrisk kontakt mellan salt bridge elektroden och referenselektroden skall kontrolleras. Beroende på vilken tid de salt överbryggar används, måste saltlösningen vara tillräckligt geléartad för att förhindra någon blandning av saltlösningen med bufferten. Detta är särskilt viktigt om K+ eller Cl– transportörer undersöks. Salt bron användes för en mycket kort tid och elueringen av agaros är försumbar i detta tidsintervall. En högre koncentration av agaros av upp till 5%, eller agar (3% - 5%), tillåter använder salt bron längre tid6,12.
Denna metod tillåter att fastställa transport kineticsen av membran transportör (i) med låg omsättning priser och (ii) mitokondrie proteiner av den inre membran, som knappast kan undersökas i standard patch clamp uppställningar13. Dess precision är främst beroende av omvänd potentiella mätning, vilken noggrannhet är minskade vid en låg total membran konduktans och liten koncentration övertoningar som inducerar en membranpotential nedanför bullret från inspelningen.
Med detta upplägg, mättes omsättning andelen UCP1 och UCP3 som producerats under samma förhållanden. På grund av den högre pH gradienten verkar de erhållna priserna vara mer exakt och ostörda av artefakter som följd av det mindre elektrod potentiella skiftet. Det kan användas för att ytterligare analysera och jämföra mitokondriella membranet transportörer produceras under liknande förhållanden.

Membranproteiner är riktade med upp till 60% av alla kända läkemedel1. Elektrofysiologiska mätningar av membranproteiner är en kraftfull men känsliga verktyg för att analysera electrogenic transport av substrat som medieras av transportören membranproteiner. Moduleringen av transmembrana strömmen genom tillämpning av konstant spänningar eller spänning ramper tillåter bedömning av de farmakologiska och fysiska egenskaperna hos bärarna, exempelvis aktivering och hämning av substrat eller transport kinetik. Av särskilt intresse är numret för omsättning substrat, som visar mängden substrat som är flyttad av ett membranprotein per tidsenhet. Det är en viktig parameter när man jämför kineticsen av olika membranproteiner. Om inrättande av en koncentrationsgradient laddade substratets över membranet genererar en elektromotorisk kraft som omsättning antalet substratet härleds.
Med en Granulatfyllda elektrod, skapar förekomsten av klorid-fri buffert en diffusion potential som förändrar elektrod potential och leder till en förskjutning i ström-spänning mätningar2. Även om det är alltid närvarande, är försumbara för standard konduktans och kapacitet mätningar eftersom dessa parametrar är antingen beroende på lutningen på den ström-spänning inspelning (konduktans) eller är skillnaden mellan en enda inspelning (kapacitet), som avbryter potential. Inspelningen av den omvända potential som skapas genom transport av substrat, kan dock störas betydligt av diffusionen potentiella. För exakta mätningar av omvänd potential alltså elektrod potential kan hållas konstant.
Diffusionen potentiella kan minimeras genom två metoder: (i) i närvaro av en lipidens membran, har ett substrat koncentrationen ökas på ena sidan av membranet3,4, eller (ii) en salt bro balanserar elektroden potentiella 5. den första metoden är starkt beroende av stabiliteten i mätningarna. Membranet måste överleva i flera minuter, från tillägg av substrat under omrörning tills underlaget är nästan jämt fördelad i lösningen. Om membranet spricker i mellan, substrat lutningen ändras genom ett fritt utbyte av laddade molekyler och mätningar slår felaktig. Den senare metoden balanserar diffusion potentiella men begränsas av storleken på set-up. Genomföra en liten men fungerande salt bridge i micro intervallet till en Elektrofysiologisk set-up är utmanande6. För den senare metoden, saltlösningen fylls i en microcapillary spets och stabiliseras genom tillsats av agaros att förhindra spridning av saltlösningen till buffertlösningen.
I detta protokoll beskrivs en enkel produktion av en mikro-agar salt bro och genomförandet i en Elektrofysiologisk set-up baserat på pipetten set-up7 . En microcapillary spets justeras både innehåller en 3 M KCl-lösning med 1 mol % (w/v) agaros och överbrygga en Granulatfyllda elektrod och buffert lösning. Fördelen med mikro-salt bron visas tid inspelningar av elektroden potentiella skiftet och mer exakta mätningar av membranpotential som vid olika pH lutningar. I modell-systemet av rekombinanta proteiner beredas i liposomer är omsättning mitokondriell transportföretag UCP1 och UCP3 produceras under liknande förhållanden förnyad undersökning och jämfört med tidigare resultat3,8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:325px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:345px;">5242956.003</td>
			<td style="width:167px;">Microcapillary pipette tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol 99%</td>
			<td>AustrAlco &#214;sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td>
			<td>AAAH-5020-07025-230317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kaliumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DC supply</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>V10/CPG 1940 -01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose Standard</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3810.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample tube</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>5863.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2SO4</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>8560.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MES</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>4256.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hexadecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating wire</td>
			<td>Voltcraft</td>
			<td>USPS-2250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micro-agar salt bridge electrode for analyzing the proton turnover rate of recombinant membrane proteins

Hittills har rikta mer än 50% av alla farmakologiska läkemedel transport kineticsen av membranproteiner. Elektrofysiologiska karakterisering av membran bärarproteiner beredas i lipid lipidens membran är en kraftfull men känslig metod för bedömning av sina fysikalisk-kemiska och farmakologiska egenskaper. Omsättning är substrat en unik parameter som tillåter jämförelse av aktiviteten av olika membranproteiner. I en electrogenic transport skapar gradient flyttade substratet en membranpotential som direkt korrelerar till substrat Omsättningshastigheten av protein. Med hjälp av silverklorid elektroder, induceras en diffusion potential, även kallad flytande junction potentiella, vilket förändrar elektrod potential och avsevärt stör exakt membran potentiella mätningar. Diffusion potentiella kan minimeras genom en salt bro, som balanserar elektrod potential. I den här artikeln är en mikro-agar salt bro för att förbättra elektrofysiologiska set-up, som använder Mikropipetter för membran bildandet. Saltlösningen är fylld till en microcapillary pipettspetsen, stabiliseras genom tillsats av agaros, och kan enkelt monteras till en standard elektrod. Elektrod potential av en mikro-salt bridge elektrod är stabilare jämfört med en standard elektrod. Genomförandet av detta system stabiliserar elektrod potential och ger mer exakta mätningar av membranpotentialen genereras av en pH-gradient. Med detta system, är proton omsättning de mitokondriella trafikföretag UCP1 och UCP3 föremål för en förnyad och jämfört med tidigare mätningar.

För att verifiera minimering av diffusionen potentiella, mättes stabiliteten av ström-spänning mätningar av ett intakt membran. Figur 2Askildras representant-ström spänning inspelningar i närvaro (vita prickar) och frånvaro (svarta prickar) av en pH-gradient. Enligt Nernst ekvation inducerar pH gradient en förskjutning i spänning. Från x-axeln skärningspunkten för en linjär passform till data beräknas det potentiella skiftet. För att testa båda elektroderna, analyserades förskjutningen i x-axeln skärningspunkten för en standard Granulatfyllda elektrod (figur 2B; vita prickar) och en micro-agar salt bro (figur 2B, svarta prickar). En spänning ramp spelades tio gånger i rad och förskjutningen mot x-axeln är avbildad mot tiden. Medan den agar salt bridge elektroden hade en maximal förskjutning av mindre än 5 mV även efter 300 sekunder av mätning, standard elektroden varierade upp till 30 mV i oförutsägbara, slumpmässiga beteende.
Därefter testades båda elektroderna vid olika pH lutningar (figur 3A). För standard elektroden genererades en pH gradient av 0,35 och 1,0 (vita prickar); för agar salt bridge elektrod, pH övertoningar 0,35, 0,7 och 1,0 (svarta prickar). Förskjutningen i potential analyserades i tre oberoende mätningar. I motsats till en gradient av 0,35, där det uppmätta skiftet endast varierar något, förändrar spänning skiftet betydligt på pH gradient 1.0 i avsaknad av mikro-agar salt bron. Från en linjär passform till data är lutningen av funktionen 26,4 ± 2.3 mV/ΔpH för standard elektroden och 50,1 ± 4,6 mV/ΔpH för mikro-agar salt bridge elektroden. Enligt Nernst ekvation, det beräknade potentiella skiftet är 60,7 mV/ΔpH vid T = 32 ° C.
Med hjälp av mikro-agar salt bron, numret för proton-omsättning, var κ, mitokondriella UCP1 och UCP3 mätt och jämfört med tidigare mätningar (figur 3B). Liknar figur 3A, ΔpH = 1.0 genererades och omvänd potential mättes. Mängden protein i membranet var beräknad enligt formeln i avsnitt 4 i protokollet, med ett protein-lipid-förhållande på 4 µg / (mg lipid), ett molekylärt samlas av 33.000 och 750 Da för protein och lipid, en membran yta 3,53 x 10 -4 cm2, och ett område per lipid på 7,8 x 10-15 cm2. Den erhållna κwas 5,56 ± 0,38 s-1 och 4,10 ± 0,71 s-1 för UCP1 och UCP3, respektive (figur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> Figur 1 : Elektrofysiologiska set-up med mikro-agar salt bron. (A) denna panel visar en skiss av set-up. Microcapillary spets som innehåller den agar salt lösning (skildras i orange) placeras mellan elektroden (svart) och buffert innehållande spetsen (blå). Membranet bildas på ytan i slutet av buffert innehållande spetsen (indikeras av pilen). (B) denna panel visar en bild av elektrofysiologiska set-up med genomförandet av mikro-agar salt bron. Pilarna pekar på elektroden, mikro-agar salt bron, referenselektroden och behållaren med buffertlösningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> Figur 2 : Jämförelse av en mikro-agar salt bro och en standard Granulatfyllda elektrod. (A) denna panel visar en representativ ström-spänning mätning i närvaro (grå prickar) och frånvaro (vita prickar) av en pH-gradient av 1. Linjerna representerar en linjär passform till data, från vilka konduktans och x-axeln korsningen värden erhålls. Spänning skiftet utvärderas av skillnaden av båda inspelningarna korsningen värden. (B) denna panel visar förskjutningen av membranet potential av en standard Granulatfyllda elektrod (vita prickar) till en mikro-agar salt bridge elektrod (svarta prickar) i tid. Tio ström-spänning mätningar registrerades i rad och medelvärdet spänning övergången genom diffusion potentiella plottas mot tiden. I alla experiment, var membranet gjord av 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueras med 15 mol % arakidonsyra vid en koncentration på 1,5 mg/mL. Bufferten innehöll 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS och 0.6 mM EGTA vid pH = 7.34 och T = 32 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> Figur 3 : Proton omsättning antal UCP1 och UCP3 beräknas från omvänd potential i närvaro av en pH-gradient. (A) denna panel visar övergången i potentialen av UCP1-innehållande membran av olika pH lutningar av en standard Granulatfyllda elektrod (vita prickar) och en micro-agar salt bridge elektrod (svarta prickar). Linjerna representerar en linjär passform till data. (B) denna panel visar proton omsättning antalet UCP1 (första datauppsättningen) och UCP3 (andra data set) som beräknas från förhållandet mellan spänning Skift till Nernst potential enligt formlerna i avsnitt 4 i protokollet. Den första stapeln av varje uppsättning representerar omsättning priser mätt med mikro-agar salt bron. Det andra fältet av varje datauppsättning representerar tidigare mätningar med en standard Granulatfyllda elektrod. Värden för UCP1 och UCP3 togs från Urbankovaet al. 3 och Macher o.a. 8. i alla mätningar, membranet var gjord av 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueras med 15 mol % AA och UCP1/UCP3. Koncentrationen av lipider och protein var 1,5 mg/mL och 4 µg/mg lipid, respektive. Bufferten innehöll 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS och 0.6 mM EGTA vid pH = 7.34 och T = 32 ° C. PH-värdet i bufferten för gradient mätningar ökades till 7,66, 8.00 eller 8,33 genom att lägga till TRIS och bytte i lösning innehållande pipetten. Värdena är medelvärde ± standardavvikelsen för tre oberoende mätningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins at JoVE.com

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

I elektrofysiologiska mätningar stör närvaron av en diffusion potentiella exakt mätning av omvänd potential genom att ändra elektroden potentiella. Med en mikro-agar salt bridge minimeras effekterna av diffusion potentiella, vilket ger en mer exakt mätning av substrat omsättning antalet ombildade rekombinant membranproteiner.

En mikro-agar Salt Bridge elektrod för att analysera Proton Omsättningshastigheten av rekombinant membranproteiner

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Denna metod kan hjälpa till med utredning av membranproteiner som transportörer och kanaler. Informationen om substrat omsättningshastighet förlust jämföra protein aktivitet och specificitet och de olika fysiologiska och patologiska förhållanden. Den största fördelen med denna teknik är att det minimerar potentiella skift variation och klorid fria buffertförhållanden.Och avsevärt ökar precisionen i omsättningshastigheten bestämning på grund av mer exakta membran potentiella mätningar. Samla elementen för näven steg. Dessa inkluderar två mikro-kapillärpipetsspetsar, ett vasst blad och ett skjutbart bromsok.För elektroden har silvertråd, sandpapper och en tre molig kaliumkloridlösning till hands. Dessutom har etanol och vatten för rengöring och en dc-strömförsörjning. Fortsätt med att arbeta med de två mikropipettsspetsarna.Börja med spetsen som kommer att innehålla bufferten. Placera det andra tipset bredvid det första. Flytta den andra spetsen, så, när den sätts in det smala delen kommer att sträcka sig minst fem millimeter i den smala delen av den första.Markera den position där den första bufferten innehållande spets kommer att fästas. Använd sedan bromsoket för att mäta längden på mikro-agar saltbroelektroden. Använd bladet för att skära spetsen till lämplig längd.Rengör snittytan med etanol följt av vatten. Därefter får du en längd på cirka åtta centimeter silvertråd för elektroden. Rengör tråden på våtservetter med etanol följt av vatten.Efter rengöring, använd sandpapper för att jämna ut ytan på en centimeters längd i ena änden. Denna tråd med sin utjämnade ände är redo att elektro-kemiskt belagda. Sätt den utjämnade änden i kaliumkloridlösningen med den andra änden ansluten till en likströmsförsörjning för beläggning.När du är belagd, koppla bort elektroden och rengör den med vatten. Efter torkning av den, bestämma längden som gör det möjligt att tränga in i mikro kapillärspetsen så djupt som möjligt. Skär elektroden från den obelagda sidan till lämplig längd.Nu, gå vidare för att förbereda en saltlösning med agaros. I en kolv som innehåller vatten lös kaliumklorid och använda en magnetisk omrörare till stöd blandning. Efter att du har tagit bort omröraren tillsätt agaros till kolven.Ta kolven till en mikrovågsugn och värm den för att smälta uppstod vid ca 100 grader Celsius. Ta ut den för att visuellt kontrollera att agaros är upplöst helt. När agaros är upplöst pipett 10 mikroliter i mikro-kapillären långsamt för att undvika luftbubblor.Det är viktigt att noggrant pipettera agarsaltlösningen i mikrokafillärspetsen, särskilt vid höga agarkoncentrationer. Om inte gjort ordentligt luftbubblor är lätt produceras i spetsen och blockera elektriska flöde. Efter att spetsen tagits bort från pipetten tryck in elektroden i den.Se till att elektroden tränger in i saltlösningen. När elektroden är i rumstemperatur plugga in den i en referenselektrod i en förstärkare. Stöd referenselektroden så att den kan sänkas ner i en plastbehållare med en milliliter buffert.Därefter doppa saltbron elektroden i lösningen. Applicera en spänning och kontrollera att det finns ett aktuellt svar innan du fortsätter. Om testet lyckas, koppla bort elektroderna.Lagra vid behov saltbrons elektrod genom att doppa den i en tre molar kaliumkloridlösning. Därefter förbereder bufferten som innehåller plast spets. Ta en mikro kapillär spets och identifiera en punkt två centimeter från den smala delen.Använd en värmetråd för att böja röret 90 grader vid denna position. Med en vass kniv skära röret fem millimeter från böjda. Rengör området som skars med etanol följt av vatten.Innan du fortsätter, använd ett ljusmikroskop med en skala för att mäta diametern på hålet i spetsen. Därefter flytta pipetten att vara nära en behållare av lösningsmedel och en annan av buffert. Pipettera tre mikroliter av lösningsmedlet in i och ut ur spetsen.Därefter fyller du mätspetsen med tre mikroliter av buffert. Hämta saltbron från kaliumkloridlösningen. Koppla in mätspetsen med bufferten på saltbryggans elektrod.Anslut saltbryggans elektrod och referenselektroden till en förstärkare. Vid denna punkt, suspendera saltbrons elektrod i buffertlösningen med referenselektroden. En representation av konfigurationen för experimentet är i den här schematisk.Under experimentet kommer membranet att bildas i slutet av bufferten som innehåller pipetten. Samla in data för att hitta membranet kapacitet. Gör detta genom att applicera en trekantig växelspänningssignal för att skapa ett rektangulärt växelströmssvar.Nästa, hitta ledningsansen och spänningen vid nollström. Automatisera tillämpningen av en spänningsramp som sträcker sig från minus 50 till 50 millivolt och spela in strömmen. Anpassa en linjär funktion till data.Lutningen är kondutan, x-intercept är spänningen vid nollström. När du är klar ta bort mätspetsen från saltbryggan. Fyll en ny måttspets med buffert, justera den till olika pH-värde för att ställa in en protongradient över membranet.Återupprätta det experimentella uppställda med en ny mätspets och elektroder för att kunna upprepa mätningarna. Här är representativa strömspänningsinspelningar i närvaroen av en pH-lutning. Och, i avsaknad av ett pH-gradient.Raderna representerar en linjär passform till data. Skiftet i x-axelns skärningspunkt för de olika pH-värdena förutsägs av Nernst-ekvationen. Dessa data representerar förskjutningen i membranpotentialen i tid för en vanlig silverkloridelektrod i vitt, och mikro-agar saltbroelektroden i svart.Agar saltbron elektroden var mer stabil med en maximal förskjutning på mindre än fem millivolt över 300 sekunder av mätning. I denna täppa av den potentiella förskjutningen som en fungera av pH-lutning de två elektroderna ses för att uppföra markant olikt, som pH-lutningförhöjningarna. Protonomsättningshastigheten kan hittas och jämföras för de två elektrodtyperna.Här är protonomsättningen numrerar beslutsamt för mitochondrial uncouplingprotein en UCP1 mätt av salten överbryggar elektroden som jämförs till en standardelektrod. Det finns också uppgifter för likartat förberedda UCP3. Klasserna verkar mer exakta med agar saltbroelektroden.Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att se till att elektroden tränger in i agar saltlösning. Saltbryggan måste också doppa i buffertlösningen. Slutligen, se till att agarsaltlösningen inte innehåller några luftbubblor.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Neuroscience

Unit 1

Direct-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Ryggmärgen Elektrofysiologi II: Extracellulär Sug elektrod Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analys av Synaptic Blås Pool Påfyllnad i odlade Cerebellar Granule nervceller med hjälp av FM-färgämnen

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion och exocytos av membranproteiner i odlade nervceller utvärderas med hjälp av fluorescens återhämtning och fluorescens-förlust fotoblekning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Ett Datorstödd Multi-elektrod Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

Design och tillverkning av Ultralight Vikt, Justerbara flerelektrod Sonder för Elektro Inspelningar i möss

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Beredning av Synaptic plasmamembranet och Postsynaptiska Density Proteiner hjälp av en kontinuerliga sukrosgradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsberoende ökning av nätverkssvaret till stimulering av neuronala cellkulturer på mikroelektroder

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bestämning av cellytans uttryck och endocytisk hastighet för proteiner i primära astrocytkulturer med användning av biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Kronisk implantation av flera flexibla Polymerelektroder matriser

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Ljusinducerad molekylär adsorption av proteiner med hjälp av PRIMO-systemet för Mikromönkning för att studera Cellresponser till extracellulära matrix proteiner

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...