Name: in vitro method to control concentrations of halogenated gases in cultured alveolar epithelial cells
Uploaded: 2018-10-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells at JoVE.com

Gli autori riconoscono il Consiglio regionale di Auvergne ("programma Nouveau Chercheur de la Région Auvergne" 2013) e la francese Agence Nationale de la Recherche e la direzione Générale de L'Offre de Soins ("programma de Recherche Translationnelle en Santé" ANR-13-PRTs-0010) per le sovvenzioni. I finanziatori non aveva alcuna influenza nel disegno dello studio, condotta e analisi o nella preparazione di questo articolo.

1. la cultura delle cellule epiteliali alveolari (hAELVi)
<ol><li>Lo scongelamento<ol>
<li>Dispensare 4 mL di medium di coltivazione ready-to-use umano alveolare epiteliali (huAEC) in un tubo di plastica da 15 mL e scongelare rapidamente il flacone in un bagno di acqua preriscaldata (37 ° C).</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare scongelati in una provetta di plastica di 15 mL contenente 4 mL di terreno prima centrifugazione il tubo a 200 x g per 5 min.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pe...

<ol>
	<li>Bellani, G., Laffey, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+Patterns+of+Care,+and+Mortality+for+Patients+With+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome+in+Intensive+Care+Units+in+50+Countries.">Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries.</a> JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).</li><li>Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Respiratory+Distress+Syndrome.">Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).</li><li>Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+estimation+of+the+global+volume+of+surgery:+a+modelling+strategy+based+on+available+data.">An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data.</a> The Lancet. (9633), 139-144 (2008).</li><li>Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+long-term+survival+after+major+surgery+and+the+adverse+effect+of+postoperative+complications.">Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications.</a> Annals of Surgery. 242 (3), 341-343 (2005).</li><li>De Conno, E., Steurer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic-induced+improvement+of+the+inflammatory+response+to+one-lung+ventilation.">Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation.</a> Anesthesiology. 110 (6), 1316-1326 (2009).</li><li>Fu, H., Sun, M., Miao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+concentrations+of+isoflurane+pretreatment+on+respiratory+mechanics,+oxygenation+and+hemodynamics+in+LPS-induced+acute+respiratory+distress+syndrome+model+of+juvenile+piglets.">Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets.</a> Experimental Lung Research. 41 (8), 415-421 (2015).</li><li>Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+isoflurane+pretreatment+in+endotoxin-induced+lung+injury.">Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury.</a> Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).</li><li>Uhlig, C., Bluth, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Volatile+Anesthetics+on+Mortality+and+Postoperative+Pulmonary+and+Other+Complications+in+Patients+Undergoing+Surgery:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124 (6), 1230-1245 (2016).</li><li>Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+preconditioning+ameliorates+endotoxin-induced+acute+lung+injury+and+mortality+in+rats.">Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).</li><li>Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sevoflurane+ameliorates+gas+exchange+and+attenuates+lung+damage+in+experimental+lipopolysaccharide-induced+lung+injury.">Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury.</a> Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).</li><li>Englert, J. A., Macias, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+Ameliorates+Acute+Lung+Injury+by+Preserving+Epithelial+Tight+Junction+Integrity.">Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity.</a> Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).</li><li>Jabaudon, M., Boucher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sevoflurane+for+Sedation+in+ARDS:+A+Randomized+Controlled+Pilot+Study.">Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study.</a> American Journal of Respiratory and Critical. , (2016).</li><li>Blondonnet, R., Audard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+inhibition+reduces+acute+lung+injury+in+mice.">RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li><li>Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Receptor+for+Advanced+Glycation+End-Products+Predicts+Impaired+Alveolar+Fluid+Clearance+in+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome.">Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192 (2), 191-199 (2015).</li><li>Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Forms+and+Ligands+of+the+Receptor+for+Advanced+Glycation+End-Products+in+Patients+with+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome:+An+Observational+Prospective+Study.">Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study.</a> PloS One. 10 (8), e0135857 (2015).</li><li>Kuehn, A., Kletting, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+expressing+tight+junctions+to+model+the+air-blood+barrier.">Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier.</a> ALTEX. 33 (3), 251-260 (2016).</li><li>Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postconditioning+with+a+volatile+anaesthetic+in+alveolar+epithelial+cells+in+vitro.">Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro.</a> The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31 (1), 118-125 (2008).</li><li>Suter, D., Spahn, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+effect+of+sevoflurane+in+endotoxin-injured+alveolar+epithelial+cells.">The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells.</a> Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).</li><li>Schl&#228;pfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sevoflurane+reduces+severity+of+acute+lung+injury+possibly+by+impairing+formation+of+alveolar+oedema.">Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema.</a> Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).</li><li>Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+iso-MAC+charts+for+isoflurane,+sevoflurane+and+desflurane+in+man.">Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man.</a> British Journal of Anaesthesia. 91 (2), 170-174 (2003).</li><li>Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+assay+of+plasma+sevoflurane+and+its+metabolite+hexafluoroisopropanol+by+headspace+GC-MS.">Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878 (1), 45-50 (2010).</li><li>Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+alveolar+anesthetic+concentration.">Minimum alveolar anesthetic concentration.</a> Anesthesiology. 26 (6), 756-763 (1965).</li><li>Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Richmond+Agitation+Sedation+Scale+According+To+Alveolar+Concentration+of+Sevoflurane+During+a+Sedation+With+Sevoflurane+in+Icu+Patients.">Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients.</a> Intensive Care Medicine Experimental. 3 (Suppl 1), (2015).</li><li>Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+media+from+mesenchymal+stromal+cells+restore+sodium+transport+and+preserve+epithelial+permeability+in+an+in+vitro+model+of+acute+alveolar+injury.">Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (11), L975-L985 (2014).</li></ol>

Il nostro protocollo descrive un metodo semplice per esporre le cellule ad una precisa frazione di un agente anestetico alogenato, quali sevoflurano o isoflurano. Inoltre, segnaliamo qui — per la prima volta — una correlazione rigorosa tra la frazione di gas sia la concentrazione di sevoflurano e isoflurano dentro il terreno di coltura stessa. Questo passaggio fondamentale permette di utilizzare in modo sicuro la nostra camera stagna per studiare gli effetti di questi agenti alogenati in un monostrato colto delle cel...

Sindrome da distress respiratorio (ARDS) è una sindrome clinica caratterizzata da danno alveolare diffuso, l'edema polmonare e guasto respiratorio hypoxemic. Anche se ARDS rappresenta più del 10% dei ricoveri in unità di cure intensive (ICU) e quasi il 25% dei pazienti di ICU che richiedono ventilazione meccanica, è ancora una sfida sotto-riconosciuto per i medici, con un tasso di mortalità di ospedale di 35-45%1. Nonostante l'intenso lavoro di ricerca, l'identificazione di un'efficace terapia farmacologica di ARDS o di prevenzione non ha data. Due caratteristiche principali contribuiscono alla mortalità nell'ARDS: alterato lo spazio fluido alveolare (AFC) (cioè, l'alterato riassorbimento del fluido edema alveolare da spazi aerei polmonari distali) e grave infiammazione2. Poiché ARDS la mortalità rimane alta, iniziative in corso dovrebbero includere anche la prevenzione primaria; Tuttavia, una sfida chiave consiste nell'identificare pazienti a rischio nel quale ARDS è probabile sviluppare e che potrebbero trarre vantaggio se ARDS sono stati impediti.
Anestetici alogenati volatili, quali sevoflurano e isoflurano, sono ampiamente utilizzati per fornire anestesia generale in sala operatoria. In tutto il mondo, più di 230 milioni i pazienti sottoposti a chirurgia maggiore ogni anno richiedono l'anestesia generale e ventilazione meccanica3e complicanze polmonari postoperatorie influenzano negativamente gli esiti clinici e sanitario utilizzazione4 . L'uso del sevoflurano invece di propofol è stata associata con infiammazione polmonare migliorata nei pazienti sottoposti a chirurgia toracica e diminuzioni significative negli eventi avversi, quali ARDS e complicanze polmonari postoperatorie5. Similmente, il pretrattamento con isoflurano hanno avuti effetti protettivi sulla meccanica respiratoria, l'ossigenazione ed emodinamica in modelli sperimentali animali di ARDS6,7. Anche se ulteriori studi sono autorizzati ad per affrontare l'impatto degli agenti inalati sui risultati in chirurgia del noncardiac, una simile diminuzione nelle complicazioni polmonari è stato recentemente osservata in una meta-analisi, dimostrando che inalato agenti anestetici — come si oppose all'anestesia endovenosa — sono significativamente associati con una riduzione della mortalità per cardiochirurgia8.
Mancano dati prospettici specifici circa l'uso di agenti volatili per la sedazione di pazienti in terapia intensiva per prevenire o curare i danni ai polmoni. Tuttavia, parecchie prove ora supportano l'efficacia e la sicurezza del sevoflurano inalato per la sedazione di pazienti in terapia intensiva, e gli studi preclinici hanno dimostrato che il sevoflurano inalato e isoflurano7,9 migliorare lo scambio di gas, ridurre l'edema alveolare e attenuare l'infiammazione nei modelli sperimentali di ARDS. Inoltre, sevoflurano mitiga tipo II delle cellule epiteliali danno10, considerando che isoflurano mantiene l'integrità della barriera alveolo-capillare attraverso la modulazione della stretta della giunzione proteina11. Tuttavia, ulteriori studi sono necessari per verificare in quale misura la prova sperimentale di protezione dell'organo da sevoflurano inalato e isoflurano può essere tradotto in esseri umani. Un primo singolo centro controllato-studio randomizzato (RCT) dal nostro gruppo trovato che uso precoce di sevoflurano inalato in pazienti con ARDS è stato associato con una migliore ossigenazione, ridotti livelli di alcuni indicatori pro-infiammatori ed epiteliale polmonare ridotta danni, come valutato dai livelli della forma solubile del recettore per i prodotti finiti avanzati di glycation (sRAGE) nel plasma e alveolare fluid12.
Presi insieme, gli effetti benefici di sevoflurano e isoflurano sulla lesione del polmone potrebbero puntare a più vie biologiche o processi funzionali che dipendono la via di rabbia, vale a dire lo spazio fluido alveolare (AFC), lesioni epiteliali, traslocazione del fattore nucleare (NF)-κB e l'attivazione del macrofago. Inoltre, sevoflurano può influenzare l'espressione della proteina rabbia stessa. Poiché la ricerca precedente dal nostro team di ricerca e altri supporta ruoli cardine per RAGE in alveolare infiammazione e lesioni/riparazione epiteliale del polmone durante ARDS, abbiamo progettato un modello sperimentale per fornire una comprensione traslazionale dei meccanismi di sevoflurano in polmone lesione e riparazione13,14,15. Sono stati studiati gli effetti in vitro del sevoflurano e isoflurano in una romanzo umano alveolare primaria linea cellulare epiteliale specificamente progettata per studiare la barriera aria-sangue del polmone periferico, hAELVi (LentiVirus epiteliale alveolare umano immortalata), con caratteristiche di tipo alveolare-come cui giunzioni strette funzionale16.
Mentre si prepara il design delle nostre indagini in vitro (ad esempio, colture di cellule epiteliali alveolari all'interfaccia aria-liquido con l'esposizione a "inalazione" sevoflurano o isoflurano, abbiamo capito da precedentemente pubblicati studi che frazioni di sevoflurane sono state valutate solo a "aria" interfaccia17,18,19 utilizzando monitor standard (simili a quelli usati in una regolazione clinica). Le concentrazioni di alogenati agente solitamente sono stati scelti in base ai valori di concentrazione minima alveolare (MAC) (per esempio, in esseri umani, per sevoflurano, 0,5, 1.1 e 2.2 vol %, che rappresenta 0,25, 0,5 e 1 MAC, rispettivamente; per isoflurano, 0.6, 0.8, e vol 1,3% che rappresenta 0,25, 0,5 e 1 MAC, rispettivamente)20. Infatti, le concentrazioni di sevoflurano e isoflurano mai sono state studiate nel terreno di coltura, limitando così la validità dei modelli/strumenti sperimentali precedenti. Inoltre, maggior parte degli esperimenti utilizzato un vaso anaerobico che è stato sigillato dopo l'aria miscela contenente sevoflurano era stato svuotato all'interno. Come il nostro obiettivo era di studiare le cellule epiteliali alveolari in condizioni "fisiologiche", abbiamo creduto che tale stato anaerobico potrebbe non essere ottima e non sarebbe compatibile con durate lunghe sperimentale. Pertanto, abbiamo sviluppato il nostro sistema a celle di cultura all'interfaccia aria-liquido ed esporli ad agenti alogenati (sevoflurano e isoflurano) con l'obiettivo di fornire precisa controllata frazioni "aria" e "medie" concentrazioni per questi agenti. A nostro parere, questa fase sperimentale, che non è stata segnalata finora nella letteratura, è obbligatoria prima di eventuali ulteriori indagini in vitro di sevoflurano e isoflurano.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td>Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td></td>
			<td>Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Alveolar Epithelial cells</td>
			<td>InScreenex</td>
			<td>INS-CI-1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huAEC Medium (ready-to-use)</td>
			<td>InScreenex</td>
			<td>INS-ME-1013-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic machine circuit</td>
			<td>Drager</td>
			<td>Fabius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas analyzer</td>
			<td>Drageer</td>
			<td>Vamos Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic gas filter</td>
			<td>SedanaMedical</td>
			<td>FlurAbsord</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Humifier</td>
			<td>Fisher&#38;Paykel</td>
			<td>MR850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber</td>
			<td>Curver</td>
			<td>00012-416-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography coupled with mass detection</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA</td>
			<td>Trace 1310 with TSQ 8000evo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused-silica column (30 m x 1.4 &#181;m, 0.25 mm ID)</td>
			<td>Restek, Lisses, France</td>
			<td>Rxi-624Sil MS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to control concentrations of halogenated gases in cultured alveolar epithelial cells

Sindrome da distress respiratorio (ARDS) è una sindrome di ferita alveolare diffusa con lo spazio fluido alveolare alterato e infiammazione severa. L'uso di agenti alogenati, quali sevoflurano o isoflurano, per la sedazione di pazienti in unità di cure intensive (ICU) può migliorare lo scambio di gas, ridurre l'edema alveolare e attenuare l'infiammazione durante ARDS. Tuttavia, mancano dati sull'uso di agenti inalati per continuo sedazione in terapia intensiva per trattare o prevenire danni ai polmoni. Per studiare gli effetti degli agenti alogenati su cellule epiteliali alveolari in condizioni "fisiologiche", descriviamo un facile sistema di cellule di coltura all'interfaccia aria-liquido e li espongono agli agenti alogenati per fornire le frazioni preciso "aria" e concentrazioni di "medium" per questi agenti. Abbiamo sviluppato una camera sigillata ermeticamente in cui piastre con cellule immortalizzate epiteliali alveolari umane potrebbero essere esposti a una frazione di precisa, controllata del sevoflurano o isoflurano utilizzando un flusso continuo di gas fornito da un circuito di macchina dell'anestetico. Le cellule sono state esposte al 4% del sevoflurano e 1% di isoflurane per 24 ore. Spettrometria di massa di gas è stata effettuata per determinare la concentrazione di agenti alogenati dissolto nel mezzo. Dopo la prima ora, le concentrazioni di sevoflurano e isoflurano in mezzo erano 251 mg/L e 25 mg/L, rispettivamente. Le curve che rappresentano le concentrazioni di sevoflurano e isoflurano dissolto nel medium ha mostrato corsi simili nel corso del tempo, con un plateau raggiunto ad un'ora dopo l'esposizione.
Questo protocollo è stato specificamente progettato per raggiungere le concentrazioni precise e controllate del sevoflurano o isoflurano in vitro per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nel danno epiteliale polmonare durante ARDS e testare nuove terapie per la sindrome.

Le concentrazioni del sevoflurano e isoflurano, che sciolto in mezzo nel corso del tempo, sono riportate nella tabella 1 e tabella 2, rispettivamente.
I corsi delle concentrazioni di sevoflurano e isoflurano in mezzo erano simili nel corso del tempo. Immediatamente dopo che è stata impostata la necessaria concentrazione di agente alogenati, concentrazioni è aumentato durante la prima ora. Un a...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells at JoVE.com

In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells

Descriviamo un protocollo facile specificamente progettato per raggiungere le concentrazioni precise e controllate del sevoflurano o isoflurano in vitro al fine di migliorare la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nel danno epiteliale polmonare e per testare il romanzo terapie per la sindrome da distress respiratorio.

In Vitro Metodo di controllo delle concentrazioni di gas alogenati in cellule epiteliali alveolari coltivate

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a syndrome of diffuse alveolar injury with impaired alveolar fluid clearance and severe inflammation. The ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle lesioni polmonari e sulla riparazione come testare l'aggiunta alogenata come potenziali nuove terapie per la sindrome da distress respiratorio acuto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si basa su un metodo molto semplice per coltura delle cellule e per esporle ad agenti alogenati al fine di raggiungere concentrazioni precise e controllate. Per costruire la camera ermetica, utilizzare una scatola ermetica in polipropilene con una capacità di 6,5 litri.Praticare un foro di 2,5 centimetri di diametro sul lato inferiore della parete laterale della scatola. Quindi inserire un tubo ondulato con un segno verde che fungerà da tubo di ingresso della miscela di aria gassosa. E sigillare con silicone.Successivamente, praticare un secondo foro con un diametro di 2,5 centimetri sul lato superiore della parete laterale opposta. Inserire un altro tubo ondulato con un segno rosso e collegarlo con un filtro a carbone che fungerà da tubo di uscita della miscela di aria gassosa. Quindi sigillare con silicone.Successivamente praticare un foro stretto con un diametro di quattro millimetri al centro della parete. Inserire il breve tubo di infusione collegato a un collettore con un blocco di esca maschile rotante. Collegalo a un analizzatore di gas e sigillalo con silicone.Quindi posizionare un termometro digitale all'interno della camera ermetica. Sotto una cappa aspirante di laboratorio, personalizzare un circuito della macchina anestetica per cambiare la linea di gas protossido di azoto con anidride carbonica. Inserire un umidificatore riscaldato nel tubo tra la macchina anestetica e la camera ermetica per riscaldare la miscela di flusso di gas a circa 37 gradi Celsius.Collegare la camera ermetica con il tubo ondulato marcato verde nel circuito personalizzato della macchina anestetica. Quindi, posizionare la camera ermetica su una piastra calda impostata su 37 gradi Celsius. Posizionare una piastra di sei potte contenente cellule epiteliali alveolari umane nella camera ermetica e sigillare il coperchio.Regolare la portata del gas per ottenere rapidamente il 5% di CO2. Quindi aprire l'evaporatore dell'agente alogenato e regolare la percentuale desiderata. Una volta raggiunti i valori obiettivo, ridurre la portata del gas fresco a un litro al minuto.La camera ermetica può essere mantenuta con questa portata di gas per tutto il tempo necessario per l'esperimento. I corsi delle concentrazioni di sevoflurane e isoflurane nel mezzo erano simili nel tempo. Subito dopo aver fissato la concentrazione richiesta di agente alogenato, le concentrazioni sono aumentate nel corso della prima ora.Fu quindi raggiunto un altopiano che persistette fino a quando la somministrazione dell'agente alogenato non fu fermata. Dopo l'interruzione della somministrazione, le concentrazioni sono diminuite entro un'ora. Qui sono mostrate le frazioni di agente alogenato nel tempo nella camera ermetica misurata dall'analizzatore di gas.Questa procedura è relativamente economica e molto facile da adottare anche quando i ricercatori non hanno mai manipolato una camera ermetica prima d'ora. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la quantificazione di proteine e RNA, l'immunofluorescenza, la misurazione della permeabilità proteica e il trasporto libero al fine di rispondere alle domande sugli effetti specifici degli agenti alogenati durante la lesione polmonare epiteliale e la sua risoluzione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può spianare la strada alla ricerca nel campo della sindrome da distress respiratorio acuto per studiare ulteriormente il meccanismo coinvolto nella lesione polmonare epiteliale durante l'ARDS e per testare nuove terapie.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Ricerca

Medicina

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Nel metodo in vitro per osservare le interazioni E-selectina-mediata Tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e Cellule endoteliali umane

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

Un metodo per la quantificazione degli arti superiori performance nella vita quotidiana che utilizzano accelerometri

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...