Name: in vitro method to control concentrations of halogenated gases in cultured alveolar epithelial cells
Uploaded: 2018-10-23T14:30:00
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著者認めるオーベルニュ地方議会 (「プログラム ヌーボー Chercheur デ ラ地方オーヴェルニュ」2013) とフランス語アジャンス ナシオナル デ ラ抜き方向ジェネラル ・ デ ・ L'Offre ・ デ ・球種 ("プログラム ・ デ ・凝った Translationnelle en 健康"ANR-13-PRTS-0010) 補助金のため。資金提供者には、研究デザイン、実施、解析、やこの記事の準備の影響はなかった。

1. 肺胞上皮細胞 (hAELVi) の文化
<ol><li>融解<ol>
<li>栽培に使えるひと肺胞上皮 (huAEC) 15 mL プラスチック チューブ中の 4 mL をピペットし、予熱した水浴 (37 ° C) のバイアルをすばやく解凍します。</li>
		<li>解凍の細胞懸濁液を 5 分間 200 x g でチューブを遠心分離する前に培地 4 mL を含む 15 mL プラスチック チューブに転送します。</li>
		<li>上清を吸引し、5 mL の培地で細胞ペレットを再懸濁します...

<ol>
	<li>Bellani, G., Laffey, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+Patterns+of+Care,+and+Mortality+for+Patients+With+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome+in+Intensive+Care+Units+in+50+Countries.">Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries.</a> JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).</li><li>Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Respiratory+Distress+Syndrome.">Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).</li><li>Weiser, T. G., Regenbogen, S. 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J., Brandstater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+alveolar+anesthetic+concentration.">Minimum alveolar anesthetic concentration.</a> Anesthesiology. 26 (6), 756-763 (1965).</li><li>Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Richmond+Agitation+Sedation+Scale+According+To+Alveolar+Concentration+of+Sevoflurane+During+a+Sedation+With+Sevoflurane+in+Icu+Patients.">Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients.</a> Intensive Care Medicine Experimental. 3 (Suppl 1), (2015).</li><li>Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+media+from+mesenchymal+stromal+cells+restore+sodium+transport+and+preserve+epithelial+permeability+in+an+in+vitro+model+of+acute+alveolar+injury.">Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (11), L975-L985 (2014).</li></ol>

提案プロトコルでは、セボフルランやイソフルランなどのハロゲン化麻酔薬の正確な割合に細胞を公開する簡単な方法について説明します。さらに、我々 はここで報告-初めて-セボフルランとイソフルラン吸入自体培養液中の濃度とガス留分の厳密な相関。この基本的なステップは今、私たち人間の肺胞上皮細胞の培養単分子膜ハロゲン化剤の効果を研究する私たちの気密室を安全に使用す?...

急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、びまん性肺胞損傷、肺浮腫、および hypoxemic の呼吸不全によって特徴付けられる臨床的な症候群です。ARDS は、集中治療室 (ICU) 入学の 10% 以上、機械換気を必要とする ICU 患者の約 25% を表し、それはまだ 35-451の病院の死亡率と、臨床医のための認識の下で挑戦です。強烈な研究にもかかわらず、ARDS の薬理学的治療または予防の同定は、日付に失敗しました。ARDS の死亡率に貢献する 2 つの主要な機能: 障害肺胞液クリアランス (AFC) (すなわち、遠位部の肺空域から肺胞浮腫液の変化の吸収) と重度の炎症2。以来、ARDS の死亡率は高いまま、現在の取り組みも一次予防; を含める必要があります。しかし、重要な課題は ARDS を発症する可能性は誰と誰が得を ARDS ができない場合のリスクの高い患者を識別します。
セボフルランやイソフルランなど、揮発性のハロゲン化麻酔薬は、手術室で全身麻酔を提供するために広く使用されます。世界中で全身麻酔と換気3、毎年主要な手術よりも 2 億 3000 万の患者が必要し、臨床転帰と医療利用4 術後肺合併症に悪影響.セボフルラン プロポ フォールではなく使用は、呼吸器外科と ARDS と術後肺合併症5などの有害事象の重要な減少の患者で改善された肺の炎症と関連付けられました。同様に、イソフルランによる前処理は、ARDS6、7の実験動物モデルで血行動態、酸素、呼吸力学に対する保護効果を持っていた。肺合併症と同様の減少が最近、吸入麻酔剤を示すメタ分析で観察されている非心臓手術の転帰に吸入剤の影響に対処するため、さらなる研究が保証されているが-として静脈麻酔に反対-8心臓手術死亡率の削減に大幅に関連付けられています。
防止したり、肺の損傷を治療する ICU 患者の鎮静のため揮発性剤の使用に関する特定のプロスペクティブなデータは欠けています。ただし、いくつかの試験は今の ICU 患者の鎮静とセボフルラン吸入麻酔の安全性をサポート、前臨床研究は、吸入セボフルランとイソフルラン7,9ガス交換を改善、軽減に示されています。肺胞浮腫と ARDS の実験モデルでの減衰の炎症。また、イソフルラン タイト結合タンパク質の11の変調による歯槽毛管障壁の整合性を維持するのに対し、セボフルランはタイプ II の上皮細胞のダメージ10を軽減します。しかし、さらなる研究がどの程度吸入セボフルランとイソフルラン吸入から臓器保護の実験的証拠を人間に翻訳できることを確認する必要です。最初単一施設無作為化制御-試験 (RCT) 私たちのグループから発見 ARDS 患者における吸入セボフルランの早期使用は改良された酸素処理、いくつかのプロ炎症性マーカー、および減らされた肺上皮の減らされたレベルと関連付けられています。損傷、プラズマと肺胞液12で高度の glycation の最終製品 (sRAGE) の受容体の可溶性のレベルにより評価しました。
一緒に取られて、肺障害に対するセボフルランとイソフルランの有益な効果は、複数の生物学的経路または肺胞液クリアランス (AFC)、上皮損傷、すなわち怒り経路に依存している機能のプロセスを指すことが核因子 (NF) の転流-B とマクロファージ活性化。また、セボフルランが怒り蛋白質自体の表現に影響を与えます。並進運動のメカニズムの理解を提供する実験的モデルを考案した当社の調査チームなどによる前の調査は、ARDS の中に肺胞の炎症や肺上皮傷害/修理の怒りの極めて重要な役割をサポートするのでセボフルラン肺傷害と修復13,14,15。HAELVi (人間の肺胞上皮レンチ末梢肺の空気血液関門を研究に特化した新規ひと肺胞上皮プライマリ細胞ラインでセボフルランとイソフルランの生体外で影響を調べた不死化)、機能のタイトな接合16を含む型肺胞のような特性を持つ。
生体外で調査の設計を準備中 (など「吸入」セボフルランやイソフルランへの暴露と気液界面における肺胞上皮細胞の培養、わかったから以前に発表された研究セボフルランの分数は、「空気」インターフェイス17,18,19標準的なモニター (臨床設定で使用されるものに似ています) を使用してのみ評価されている.ハロゲン化剤濃度は通常最小肺胞内濃度 (MAC) 値に従って選ばれた (例えば、ヒト、セボフルラン、0.5、1.1、および 2.2 vol %、0.25、0.5、および 1 の MAC を表すそれぞれのイソフルラン、0.6、0.8 と0.25、0.5、および 1 の MAC をそれぞれ表す 1.3 vol %)20。確かに、セボフルランとイソフルラン吸入濃度決して行った従って実験モデル/楽器の前の有効性を制限すること自体は、培養液中で。また、ほとんどの実験は、空気のミックス含むセボフルランは内部フラッシュされていた後に封印された嫌気性の jar を使用しました。私たちの目標は、「生理」の条件下で肺胞上皮細胞を研究することだったと、そのような嫌気状態が最適ではないかもしれない、長い実験期間と互換性がないだろうと考えました。したがって、我々 は気液界面培養細胞に独自のシステムを開発、精密制御された「空気」分数とこれらのエージェント「中濃度を提供すること目的とハロゲン化剤 (セボフルランとイソフルラン) にそれらを公開。我々 の意見で文学にまで報告されていないが、この実験の手順はセボフルランとイソフルランのさらなる生体外で調査する前に必須です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td>Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td></td>
			<td>Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Alveolar Epithelial cells</td>
			<td>InScreenex</td>
			<td>INS-CI-1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huAEC Medium (ready-to-use)</td>
			<td>InScreenex</td>
			<td>INS-ME-1013-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic machine circuit</td>
			<td>Drager</td>
			<td>Fabius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas analyzer</td>
			<td>Drageer</td>
			<td>Vamos Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic gas filter</td>
			<td>SedanaMedical</td>
			<td>FlurAbsord</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Humifier</td>
			<td>Fisher&#38;Paykel</td>
			<td>MR850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber</td>
			<td>Curver</td>
			<td>00012-416-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography coupled with mass detection</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA</td>
			<td>Trace 1310 with TSQ 8000evo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused-silica column (30 m x 1.4 &#181;m, 0.25 mm ID)</td>
			<td>Restek, Lisses, France</td>
			<td>Rxi-624Sil MS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to control concentrations of halogenated gases in cultured alveolar epithelial cells

急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) は、障害者の肺胞液クリアランスと重度の炎症びまん性肺胞損傷の症候群です。集中治療室 (ICU) 患者の鎮静のイソフルラン、セボフルランなどのハロゲン化剤を使用することができますガス交換を改善、肺胞浮腫を軽減、ARDS の中に炎症を弱めます。ただし、連続的な鎮静治療または肺の損傷を防ぐために ICU での吸入剤の使用上のデータは欠けています。「生理学的」条件下での肺胞上皮細胞におけるハロゲン化剤の効果を検討する我々 は気液界面培養細胞に対する簡単なシステムを記述して正確な制御「空気」分数を提供するハロゲン化剤にそれらを公開し、これらのエージェントの「中」の濃度。セボフルランやイソフルラン麻酔器回路によって提供されるガスの連続的な流れを使用して正確な制御された分数にさらされるひと肺胞上皮不死化細胞とプレートで密閉気密室を開発しました。細胞は、24 時間 4% セボフルランとイソフルランの 1% にさらされました。ガス質量分析法は、媒体に溶解したハロゲン化剤の濃度を決定するため行われました。最初の後時間, セボフルランとイソフルラン吸入中の濃度であった 251 mg/L と 25 mg/L。セボフルランとイソフルランの濃度を表す曲線は、時間をかけて、1 時間暴露後に達した高原と類似したコースを示した媒体に溶解しました。
このプロトコルは、セボフルランやイソフルラン体外ARDS の間に上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するためとの新規治療法をテストするための正確かつ制御された濃度に到達するために設計されました、症候群。

セボフルランとイソフルランは、時間の経過と共に媒体に溶解、濃度は表 1と表 2にそれぞれ報告しました。
媒体におけるセボフルランとイソフルラン吸入濃度のコースは時間をかけて同様であった。ハロゲン化剤の必要な濃度が設定された直後後は、最初の 1 時間濃度が上昇しました。高原はハ...

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In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells

具体的に達するように設計正確かつ制御された濃度セボフルランやイソフルランの in vitroの上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するために、小説をテストする簡単なプロトコルについて述べる急性呼吸窮迫症候群の治療。

体外培養肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガスの濃度を制御する方法

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a syndrome of diffuse alveolar injury with impaired alveolar fluid clearance and severe inflammation. The ...

この方法は、急性呼吸窮迫症候群の潜在的な新しい治療法としてハロゲン化付加物をテストするなどの肺損傷および修復の研究分野における重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、細胞を培養し、正確で制御された濃度に到達するためにハロゲン化剤にそれらを公開する非常に簡単な方法に依存していることです。気密室を構成するには、6.5リットルの容量を持つ密閉ポリプロピレンボックスを使用してください。箱の側面の底面に直径2.5センチの穴を開けます。次に、ガス空気混合入力パイプとして機能する緑色のマークを持つ波形チューブを挿入します。そして、シリコーンでそれを密封します。次に、反対側の側面の上側に直径2.5センチメートルの2番目の穴を開けます。赤いマークを付けた別の波形の管を挿入し、ガス空気混合ガス出力パイプとして機能する炭フィルターとそれを接続します。その後、シリコーンでそれを密封します。その後、壁の中央に4ミリメートルの直径を持つタイトな穴を掘削します。回転する男性のルアーロックで多様体に接続されている短い注入チューブを挿入します。ガス分析装置に差し込み、シリコーンで密封します。その後、気密室の中にデジタル温度計を置きます。実験室の抽出器のフードの下で、二酸化炭素によって亜酸化窒素ガスラインを切り替えるために麻酔機械回路をカスタマイズする。麻酔機と気密室の間のパイプに加熱加湿器を挿入し、ガス流れの混合物を約37°Cに温めます。緑のマーク付き段ボールチューブで気密室をカスタマイズされた麻酔機械回路に差し込みます。次に、気密室を37°Cに設定したホットプレートの上に置きます。ヒト肺胞上皮細胞を含む6つのウェルプレートを気密室に入れ、蓋を密封します。ガス流量を調整して、CO2の5%を迅速に得る。次いでハロゲン化剤蒸発器を開き、所望の割合を調整します。目標値が達成されたら、新鮮なガスの流量を1分あたり1リットルに下げます。気密室は実験のために必要な限りこのガス流量と維持することができる。培地中のセボフルランおよびイソフルラン濃度のコースは、時間の経過とともに類似していた。ハロゲン化剤の必要濃度が設定された直後に、最初の1時間にわたって濃度が上昇した。その後、ハロゲン化剤の投与が停止するまで持続する高原に達した。投与中断後、濃度は1時間以内に減少した。ここに示されているのは、気体分析装置で測定された気密室における時間経過に伴うハロゲン化剤の分画である。この手順は比較的安価で、研究者が以前に気密室を操作したことがない場合でも採用するのは非常に簡単です。この手順に従って、タンパク質およびRNA定量、免疫蛍光、タンパク質透過性および遊離輸送の測定のような他の方法は、上皮肺損傷およびその分解能の間にハロゲン化剤の特定の効果に関する質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、ARDS中の上皮性肺損傷に関与するメカニズムをさらに研究し、新しい治療法をテストするために、急性呼吸窮迫症候群の分野での研究への道を開く可能性があります。

Research

JoVE Journal

Medicine

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乳がんの転移における肺胞マクロファージの役割を学びます

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

加速度計を使用して日常生活に上肢のパフォーマンスを定量化する方法

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...