Name: in vitro method to control concentrations of halogenated gases in cultured alveolar epithelial cells
Uploaded: 2018-10-23T14:30:00
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Los autores reconocen el Consejo Regional de Auvernia ("programa Nouveau Chercheur de la Région Auvernia" 2013) y la francesa Agence Nationale de la Recherche y la dirección Générale de L'Offre de Soins ("programa de Translationnelle de Recherche en Santé" ANR-13-PRTS-0010) para las becas. Los patrocinadores no tenían ninguna influencia en el diseño del estudio, la conducta y el análisis o en la preparación de este artículo.

1. cultivo de células epiteliales alveolares (hAELVi)
<ol><li>El deshelar<ol>
<li>Pipetear 4 mL de medio de cultivo listo para su uso humano alveolares epiteliales (huAEC) en un tubo de plástico de 15 mL y descongelar rápidamente el vial en un baño de agua precalentado (37 ° C).</li>
		<li>Transferir la suspensión de células descongeladas a un tubo de plástico de 15 mL que contiene 4 mL del medio antes de centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedime...

<ol>
	<li>Bellani, G., Laffey, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+Patterns+of+Care,+and+Mortality+for+Patients+With+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome+in+Intensive+Care+Units+in+50+Countries.">Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries.</a> JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).</li><li>Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Respiratory+Distress+Syndrome.">Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).</li><li>Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+estimation+of+the+global+volume+of+surgery:+a+modelling+strategy+based+on+available+data.">An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data.</a> The Lancet. (9633), 139-144 (2008).</li><li>Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+long-term+survival+after+major+surgery+and+the+adverse+effect+of+postoperative+complications.">Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications.</a> Annals of Surgery. 242 (3), 341-343 (2005).</li><li>De Conno, E., Steurer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic-induced+improvement+of+the+inflammatory+response+to+one-lung+ventilation.">Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation.</a> Anesthesiology. 110 (6), 1316-1326 (2009).</li><li>Fu, H., Sun, M., Miao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+concentrations+of+isoflurane+pretreatment+on+respiratory+mechanics,+oxygenation+and+hemodynamics+in+LPS-induced+acute+respiratory+distress+syndrome+model+of+juvenile+piglets.">Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets.</a> Experimental Lung Research. 41 (8), 415-421 (2015).</li><li>Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+isoflurane+pretreatment+in+endotoxin-induced+lung+injury.">Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury.</a> Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).</li><li>Uhlig, C., Bluth, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Volatile+Anesthetics+on+Mortality+and+Postoperative+Pulmonary+and+Other+Complications+in+Patients+Undergoing+Surgery:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124 (6), 1230-1245 (2016).</li><li>Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+preconditioning+ameliorates+endotoxin-induced+acute+lung+injury+and+mortality+in+rats.">Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).</li><li>Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sevoflurane+ameliorates+gas+exchange+and+attenuates+lung+damage+in+experimental+lipopolysaccharide-induced+lung+injury.">Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury.</a> Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).</li><li>Englert, J. A., Macias, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+Ameliorates+Acute+Lung+Injury+by+Preserving+Epithelial+Tight+Junction+Integrity.">Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity.</a> Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).</li><li>Jabaudon, M., Boucher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sevoflurane+for+Sedation+in+ARDS:+A+Randomized+Controlled+Pilot+Study.">Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study.</a> American Journal of Respiratory and Critical. , (2016).</li><li>Blondonnet, R., Audard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+inhibition+reduces+acute+lung+injury+in+mice.">RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li><li>Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Receptor+for+Advanced+Glycation+End-Products+Predicts+Impaired+Alveolar+Fluid+Clearance+in+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome.">Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192 (2), 191-199 (2015).</li><li>Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Forms+and+Ligands+of+the+Receptor+for+Advanced+Glycation+End-Products+in+Patients+with+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome:+An+Observational+Prospective+Study.">Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study.</a> PloS One. 10 (8), e0135857 (2015).</li><li>Kuehn, A., Kletting, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+expressing+tight+junctions+to+model+the+air-blood+barrier.">Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier.</a> ALTEX. 33 (3), 251-260 (2016).</li><li>Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postconditioning+with+a+volatile+anaesthetic+in+alveolar+epithelial+cells+in+vitro.">Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro.</a> The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31 (1), 118-125 (2008).</li><li>Suter, D., Spahn, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+effect+of+sevoflurane+in+endotoxin-injured+alveolar+epithelial+cells.">The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells.</a> Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).</li><li>Schl&#228;pfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sevoflurane+reduces+severity+of+acute+lung+injury+possibly+by+impairing+formation+of+alveolar+oedema.">Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema.</a> Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).</li><li>Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+iso-MAC+charts+for+isoflurane,+sevoflurane+and+desflurane+in+man.">Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man.</a> British Journal of Anaesthesia. 91 (2), 170-174 (2003).</li><li>Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+assay+of+plasma+sevoflurane+and+its+metabolite+hexafluoroisopropanol+by+headspace+GC-MS.">Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878 (1), 45-50 (2010).</li><li>Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+alveolar+anesthetic+concentration.">Minimum alveolar anesthetic concentration.</a> Anesthesiology. 26 (6), 756-763 (1965).</li><li>Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Richmond+Agitation+Sedation+Scale+According+To+Alveolar+Concentration+of+Sevoflurane+During+a+Sedation+With+Sevoflurane+in+Icu+Patients.">Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients.</a> Intensive Care Medicine Experimental. 3 (Suppl 1), (2015).</li><li>Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+media+from+mesenchymal+stromal+cells+restore+sodium+transport+and+preserve+epithelial+permeability+in+an+in+vitro+model+of+acute+alveolar+injury.">Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (11), L975-L985 (2014).</li></ol>

Nuestro protocolo describe un método sencillo para exponer las células a una fracción exacta de un agente anestésico halogenado, como el sevoflurano o isoflurano. Además, se presenta aquí, por primera vez — una correlación rigurosa entre la fracción de gas y la concentración de sevoflurano y el isoflurano en el medio de cultivo propio. Este paso fundamental ahora nos permite poder usar nuestra cámara hermética para estudiar los efectos de estos agentes halogenados en una monocapa de cultivo de células epite...

Síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome clínico caracterizado por lesión alveolar difusa, edema pulmonar y la insuficiencia respiratoria hipoxémica. Aunque ARDS representa más del 10% de los ingresos de la unidad de cuidados intensivos (UCI) y casi el 25% de pacientes de la UCI que requieren ventilación mecánica, sigue siendo un reto poco reconocidos para los médicos, con una tasa de mortalidad del hospital de 35-45%1. A pesar de intensa investigación, la identificación de una terapia farmacológica eficaz de SDRA o de prevención ha fracasado hasta la fecha. Dos características principales contribuyen a la mortalidad en SDRA: problemas de separación líquido alveolar (AFC) (es decir, la alteración reabsorción del líquido de edema alveolar de espacios aéreos distales del pulmón) y la inflamación severa2. Puesto que la mortalidad de SDRA sigue siendo alta, iniciativas deberían incluir también la prevención primaria; sin embargo, un desafío clave es identificar a pacientes en riesgo de SDRA es propenso a desarrollar y que se beneficiarían si SDRA fueron prevenido.
Los anestésicos halogenados volátiles, como isoflurane, sevoflurane son ampliamente utilizados para proporcionar anestesia general en quirófano. En todo el mundo, más de 230 millones pacientes sometidos a cirugía mayor cada año requieren anestesia general y ventilación mecánica3, y las complicaciones pulmonares posoperatorias afectan los resultados clínicos y la utilización profesional de la salud4 . El uso de sevoflurano en vez de propofol se asoció con inflamación pulmonar mayor en pacientes sometidos a cirugía torácica y una disminución significativa en los eventos adversos, tales como SDRA y las complicaciones pulmonares posoperatorias5. Semejantemente, tratamiento previo con isoflurano tenía efectos protectores en la mecánica respiratoria, oxigenación y hemodinámica en modelos animales experimentales de ARDS6,7. Aunque otros estudios están garantizados a los efectos de agentes inhalados en los resultados en cirugía no cardiaca, una disminución similar en las complicaciones pulmonares se ha observado recientemente en un metanálisis, demostrando que inhalan agentes anestésicos, como se oponen a la anestesia intravenosa — están significativamente asociados con una reducción en la mortalidad por cirugía cardíaca8.
Carecen de datos prospectivos específicos sobre el uso de agentes volátiles para la sedación de pacientes de la UCI para prevenir o tratar el daño pulmonar. Sin embargo, varios ensayos ahora apoyan la eficacia y seguridad del inhalado sevoflurane para la sedación de pacientes de la UCI, y los estudios preclínicos han demostrado que sevoflurano inhalado e isoflurano7,9 mejorar intercambio del gas, reducir edema alveolar e inflamación atenuada en modelos experimentales de SDRA. Además, sevoflurano reduce tipo II célula epitelial daño10, mientras que el isoflurano mantiene la integridad de la barrera del alveolar-tubo capilar a través de la modulación de la proteína de Unión estrecha11. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para verificar hasta qué punto la evidencia experimental de protección de órgano de inhalado sevoflurane e isoflurano podría traducirse a los seres humanos. Un primer centro único controlado-Estudio aleatorizado (ECA) de nuestro grupo encontró que el uso temprano del sevoflurane inhalado en pacientes con SDRA se asoció con mayor oxigenación, disminución en los niveles de algunos marcadores pro-inflamatorias y epiteliales de pulmón reducida daño, según lo determinado por los niveles de la forma soluble del receptor de productos finales de glicación avanzada (sRAGE) en fluido alveolar y plasma12.
Tomados en conjunto, los efectos beneficiosos de sevoflurano y el isoflurano en la lesión pulmonar podrían apuntar a múltiples caminos biológicos o procesos funcionales que dependen de la vía de la rabia, es decir, separación de fluido alveolar (AFC), lesiones epiteliales, translocación del factor nuclear (NF)-κB y activación de los macrófagos. Además, sevoflurano puede influir en la expresión de la proteína de la rabia misma. Ya que investigaciones anteriores de nuestro equipo de investigación y otros soporta papeles fundamentales para rabia en inflamación alveolar y pulmonar lesiones epiteliales y reparación durante el SDRA, se diseñó un modelo experimental para proporcionar una comprensión aplicada de los mecanismos de sevoflurano en pulmonar lesión y reparación13,14,15. Se investigaron los efectos en vitro de sevoflurano y el isoflurano en una línea de células epiteliales alveolares humanas novela primaria diseñada específicamente para el estudio de la barrera aire sangre de la periferia del pulmón, hAELVi (humano LentiVirus epitelial Alveolar inmortalizadas), con características de-como de tipo alveolar incluyendo uniones estrechas funcional16.
Preparando el diseño de nuestras investigaciones en vitro (p. ej., cultivos de células epiteliales alveolares en la interfase aire-líquido con la exposición "inhalado" sevoflurano o isoflurano, entendimos de previamente publicado estudios que fracciones de sevoflurano sólo han sido evaluados en el "aire" interfaz17,18,19 con los monitores estándar (similares a los utilizados en un ajuste clínico). Concentraciones de agente halogenado se eligieron generalmente según los valores de la concentración alveolar mínima (MAC) (por ejemplo, en los seres humanos, para sevoflurane, 0.5, 1.1 y 2.2 vol %, que representa el 0.25, 0.5 y 1 MAC, respectivamente; para isoflurano, 0.6, 0.8, y vol 1,3% que representan 0.25, 0.5 y 1 MAC, respectivamente)20. De hecho, las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano nunca han sido investigadas en el medio de cultivo, lo que limita la validez de los anteriores modelos experimentales e instrumentos. Además, mayoría de los experimentos utiliza un recipiente de anaerobios que fue sellado después de que el aire mezcla con sevoflurane había salido dentro. Como nuestro objetivo era estudiar las células epiteliales alveolares bajo condiciones "fisiológicas", creímos que tal un estado anaerobio puede no ser óptima y no sería compatible con duraciones de tiempo experimentales. Por lo tanto, hemos desarrollado nuestro propio sistema de células en cultivo en la interfase aire-líquido y exponerlos a agentes halogenados (sevoflurano y el isoflurano) con el objetivo de proporcionar exacta fracciones controlada "aire" y "medio" concentraciones de estos agentes. En nuestra opinión, este paso experimental, que no se ha divulgado hasta la fecha en la literatura, es obligatorio antes de cualquier otras investigaciones en vitro de sevoflurano y el isoflurano.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td>Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td></td>
			<td>Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Alveolar Epithelial cells</td>
			<td>InScreenex</td>
			<td>INS-CI-1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huAEC Medium (ready-to-use)</td>
			<td>InScreenex</td>
			<td>INS-ME-1013-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic machine circuit</td>
			<td>Drager</td>
			<td>Fabius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas analyzer</td>
			<td>Drageer</td>
			<td>Vamos Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic gas filter</td>
			<td>SedanaMedical</td>
			<td>FlurAbsord</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Humifier</td>
			<td>Fisher&#38;Paykel</td>
			<td>MR850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber</td>
			<td>Curver</td>
			<td>00012-416-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography coupled with mass detection</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA</td>
			<td>Trace 1310 with TSQ 8000evo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused-silica column (30 m x 1.4 &#181;m, 0.25 mm ID)</td>
			<td>Restek, Lisses, France</td>
			<td>Rxi-624Sil MS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to control concentrations of halogenated gases in cultured alveolar epithelial cells

Síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome de lesión alveolar difusa con deterioro separación líquido alveolar e inflamación severa. El uso de agentes halogenados, como el sevoflurano o isoflurano, para la sedación de pacientes de la unidad de cuidados intensivos (UCI) puede mejorar intercambio del gas, reducir el edema alveolar y atenuar la inflamación durante el SDRA. Sin embargo, se carecen de datos sobre el uso de agentes inhalados para continua sedación en la UCI para tratar o prevenir el daño pulmonar. Para estudiar los efectos de los agentes halogenados en las células epiteliales alveolares bajo condiciones "fisiológicas", describimos un sistema fácil para células en cultivo en la interfase aire-líquido y exponerlos a agentes halogenados para proporcionar fracciones precisa "aire" y concentraciones de "medio" para estos agentes. Hemos desarrollado un compartimiento hermético sellado en el que las placas con células inmortalizadas epiteliales alveolares humanas pudieran estar expuestas a una fracción exacta, controlada de sevoflurano o isoflurano usando un flujo de gas continuo proporcionado por un circuito de la máquina anestésica. Las células fueron expuestas al 4% de sevoflurano y 1% de isoflurano durante 24 horas. Espectrometría de masas de gas se realizó para determinar la concentración de agentes halogenados, disuelto en el medio. Después de la primera hora, las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano en el medio fueron 251 mg/L y 25 mg/L, respectivamente. Las curvas que representan las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano disuelven en el medio demostrado cursos similares en el tiempo, con una meseta que alcanza en una hora después de la exposición.
Este protocolo fue diseñado específicamente para llegar a precisa y controladas las concentraciones de sevoflurano o isoflurano en vitro para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la lesión epitelial pulmonar durante el SDRA y probar nuevas terapias para el síndrome.

Las concentraciones del sevoflurano y el isoflurano, que disueltos en el medio con el tiempo, se reportan en la tabla 1 y tabla 2, respectivamente.
Los cursos de las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano en el medio fueron similares en el tiempo. Inmediatamente después de la concentración requerida de agente halogenado se estableció, las concentraciones aumentaron durante la primera ...

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In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells

Se describe un protocolo fácil diseñado específicamente para alcanzar precisas y controladas las concentraciones de sevoflurano o isoflurano en vitro con el fin de mejorar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la lesión pulmonar epitelial y poner a prueba la novela terapias para el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

In Vitro Método de Control de concentraciones de Gases halogenados en cultivos de células epiteliales alveolares

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a syndrome of diffuse alveolar injury with impaired alveolar fluid clearance and severe inflammation. The ...

Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo de la investigación de lesiones pulmonares y reparación, como la prueba de ayuude halogenado como posibles terapias novedosas para el síndrome de dificultad respiratoria aguda. La principal ventaja de esta técnica es que se basa en un método muy simple para cultivar las células y exponerlas a agentes halogenados con el fin de alcanzar concentraciones precisas y controladas. Para construir la cámara hermética, utilice una caja hermética de polipropileno con una capacidad de 6,5 litros.Taladre un agujero de 2,5 centímetros de diámetro en la parte inferior de la pared lateral de la caja. A continuación, inserte un tubo corrugado con una marca verde que servirá como el tubo de entrada de mezcla de aire de gas. Y sellarlo con silicona.A continuación, taladre un segundo agujero con un diámetro de 2,5 centímetros en la parte superior de la pared lateral opuesta. Inserte otro tubo corrugado con una marca roja y conéctelo con un filtro de carbón que servirá como tubo de salida de mezcla de aire gas. A continuación, sellar con silicona.Posteriormente taladre un agujero apretado con un diámetro de cuatro milímetros en el centro de la pared. Inserte el tubo de infusión corta que está conectado en un colector con un bloqueo de señuelo macho giratorio. Enchúfalo a un analizador de gas y séllalo con silicona.A continuación, coloque un termómetro digital dentro de la cámara hermética. Bajo una campana extractora de laboratorio, personalice un circuito de máquina anestésica para cambiar la línea de gas de óxido nitroso por dióxido de carbono. Inserte un humidificador calentado en el tubo entre la máquina anestésica y la cámara hermética para calentar la mezcla de flujo de gas a aproximadamente 37 grados Centígrados.Enchufe la cámara hermética con el tubo corrugado marcado en verde en el circuito de la máquina anestésica personalizada. A continuación, coloque la cámara hermética en una placa caliente ajustada a 37 grados Centígrados. Coloque una placa de seis pozos que contenga células epiteliales alveolares humanas en la cámara hermética y selle la tapa.Regular el caudal de gas para obtener rápidamente el 5% de CO2. A continuación, abra el evaporador del agente halogenado y ajuste el porcentaje deseado. Una vez alcanzados los valores objetivo, reduzca el caudal de gas fresco a un litro por minuto.La cámara hermética se puede mantener con este caudal de gas el tiempo que sea necesario para el experimento. Los cursos de las concentraciones de sevoflurano e isoflurano en el medio fueron similares con el tiempo. Inmediatamente después de que se estableció la concentración requerida de agente halogenado, las concentraciones aumentaron durante la primera hora.Luego se llegó a una meseta que persistió hasta que se detuvo la administración del agente halogenado. Después de la interrupción de la administración, las concentraciones disminuyeron en una hora. Aquí se muestran las fracciones de agente halogenado a lo largo del tiempo en la cámara hermética medida por el analizador de gas.Este procedimiento es relativamente barato y muy fácil de adoptar incluso cuando los investigadores nunca han manipulado una cámara hermética antes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cuantificación de proteínas y ARN, la inmunofluorescencia, la medición de la permeabilidad proteica y el transporte libre para responder preguntas sobre los efectos específicos de los agentes halogenados durante la lesión pulmonar epitelial y su resolución. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para la investigación en el campo del síndrome de dificultad respiratoria aguda para seguir estudiando el mecanismo implicado en la lesión pulmonar epitelial durante el SRAS y para probar nuevas terapias.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

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El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

Un método para cuantificar Rendimiento de las extremidades superiores en la Vida Diaria El uso de acelerómetros

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...