Name: ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها EY024942 R01 نيي المعاهد الوطنية للصحة، البحوث "منع العمى"، شمال ولاية الطبية جامعة غير المقيد أموال البحث، ومنطقة الليونز 20-يوسف مجهرية وتحليل الصور من مقاطع البارافين أجريت في "صميم مجهرية" و إعداد شرائح نسيجية أنجز في بيوريبوسيتوري وعلم الأمراض الأساسية في "مدرسة الطب آيكان" في جبل سيناء.

1-الجهاز الثقافة
<ol><li>
الأعمال التحضيرية
	<ol>
<li>إعداد أجار الحل كما يلي. وفي قارورة صغيرة، تعد أجار 1% و 1 ملغ/مل من الكولاجين البقري في دميم-F12 يصل إلى 20 مل. جلب ليغلي على طبق ساخن. وضع الحل في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. ضع الأنبوبة في حمام مائي على لوحة الساخن للحفاظ على الحل من ترسيخ.</li>...

ويصف هذا البروتوكول نموذج لدراسة التئام الجروح في بيئة ثلاثية الأبعاد طبقية طبيعية. استخدام جهاز الثقافة كوسيط بين الخلية والثقافة والدراسات المجراة في يقلل كثيرا من التكاليف، فضلا عن الحد من الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الحية. 3D نماذج أخرى قد تم فائدة كبيرة في الميدان بما في ذلك ذاتية ...

تندب في القرنية الناتجة عن الإصابة أو الصدمة أو الإصابة يمكن أن تؤدي إلى إضعاف نسبة تظليل وفقدان الرؤية الدائمة. ومن ثم، هناك حاجة ماسة لتحديد المسارات التي يمكن أن تكون مستهدفة للتدخل العلاجي. خيارات العلاج الحالية محدودة، وتتمثل أساسا في عمليات زرع القرنية، التي لا يمكن الوصول إلى المرضى عبر العالم. الإنسان (الشكل 1) والقرنية الحيوانية يمكن أن تستخدم ل 2D وخلية 3D ثقافة الدراسات1،2. يمكن الحصول على القرنيات الجثث البشرية لا تصلح لزرع من المصارف العين أو مصارف مركزية الأنسجة (الوطنية المرض بحوث التبادل (ندري))، ويمكن الحصول على عيون الحيوان من مسلخ. الابتدائي الخلايا الظهارية القرنية والليفية stromal وأكثر في الآونة الأخيرة، خلايا بطانية، يمكن عزل ومثقف من هذه الأنسجة لالتئام الجروح ودراسات علم السموم3،،من45. بالإضافة إلى أهمية فهم الأساس الجزيئي لأمراض العيون المسببة للعمى، جعلت إمكانية الحصول على القدرة على الثقافة الابتدائية الخلايا والأنسجة القرنية نظام نموذجا هاما للدراسة. القرنية مثالية لاختبار آثار وكلاء على تندب القرنية عادية تتسم بالشفافية وإنشاء أنواع معينة من الجروح نسبة تظليل أو ندبات تليفية (استعرض في6). في فيفو القرنية الجرح الشفاء نماذج عديدة أيضا على نطاق واسع استخدمت تندب الدراسات1. وقد استخدمت أقل السابقين فيفو القرنية الجرح الشفاء النموذجي7،8 هي تصف بالتفصيل هنا. والهدف من هذا الأسلوب لقياس نتائج تندب تتميز بصانعي تليفية في 3D متعددة الخلايا القرنية السابقين فيفو نموذج النظام.
إصابة الظهارة القرنية التي لا يخل الغشاء الظهارية عادة يغلق داخل 24-72 ح9. قريبا بعد إصابة، تبدأ الخلايا عند حافة ظهارة تنتشر وتهاجر إلى السطح الحر الظهارية، وإعادة تأسيس وظيفة الحاجز الظهارية. هذا النشاط تسلسلياً يليه تفعيل انتشار الخلايا القاعدية القرنية أولاً، وفي مرحلة لاحقة، من الخلايا السليفة التي تقع في منطقة حوفي الخارجي لتحقيق الانتعاش من الخلايا الظهارية الشامل10،11. غالباً ما تشفي هذه الجروح بدون تندب. ومع ذلك، النتائج جرح التي تخترق الغشاء الطابق السفلي ستروما غالباً ما في تشكيل ندبة1. بعد إصابة stromal القرنية، يتم ملؤها سدى مع خلايا أصول متعددة بما في ذلك الخلايا اللحمية المقيم المتباينة، فضلا عن المشتقة من نخاع العظم فيبروسيتيس12،،من1314. ندبات تليفية تتسم باستمرار ميوفيبروبلاستس في التئام الجروح. إظهار هذه ميوفيبروبلاستس المرضية الالتصاق المتزايد من خلال تراكم إينتيجرينس في الالتصاقات المحورية، وألياف الإجهاد أكتين (α-SMA) الهوس α-السلس العضلات والتنشيط المحلي للمصفوفة خارج الخلية (ECM)-المحتبسة الكامنة تحويل عامل النمو-بيتا (TGFβ). التفريق بين الخلايا الظهارية المشتقة، تعرف باسم الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT)، قد يسهم أيضا في ندبة تشكيل6.
هناك توازن دقيق بين الخلية التمايز والمبرمج بعد إصابة. بسبب الخرق في غشاء الطابق السفلي، عوامل النمو مثل عامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF) و TGFβ من الدموع وظهاره يستحم ستروما، الذي يحفز التمايز أرومية، حلقة متواصلة autocrine TGFβ التنشيط، إفراز غير منظم تليفية ECM15،16. ويعزز استمرار ميوفيبروبلاستس في الجرح تلتئم الضباب والندوب في القرنية (الشكل 2). ومع ذلك، في ريجينيراتيفيلي تلتئم الجرح على الرغم من أن تطوير ميوفيبروبلاستس، أنهم أبوبتوسي وهكذا هي غائبة أو انخفاض ملحوظ في عدد في الأنسجة تلتئم في المرجع6،10(استعراض). وهكذا، قد ركزت البحوث على ندبات تليفية جزئيا على الأقل على استهداف الجزيئات التي تحول دون التنمية أرومية المفرط أو أرومية استمرار17،18. نظراً لاستمرار أرومية يميز المرض ندبات وتليفيه على حد سواء في جميع الأنسجة19، قد يكون من المفيد كنظام نموذجي لدراسة الآليات الخلوية العامة التليف القرنية.
في النظام النموذجي، هو إصابة القرنية بشفرة أسطواني يسمى ترفين في حين لا يزال في أنحاء العالم. البشرية ويمكن إصابة الخنازير القرنيات مع أما 6 أو 7 ملم تريفيني؛ للقرنيات الأرنب ترفين 6 مم المفضل. القرنية الخنزير مشابه في الحجم للقرنية البشرية. لأنها فعالة من حيث التكلفة ومتاحة بسهولة في إعداد كبيرة، والقرنيات خنزير تستخدم بشكل روتيني لثقافة الجهاز. وعلاوة على ذلك، قد دأبت كروسريكتيد الأجسام المضادة وسيرناس لتتفاعل مع الإنسان مع خنزير7. بعد إصابة، القرنيات هي قطع من أنحاء العالم مع ليمبوس سليمة والتي شنت على قاعدة أجار/الكولاجين. القرنيات تربى في وسائل الإعلام الحرة المصل بالإضافة إلى استقرت فيتامين (ج) لمحاكاة انتشار تنتجها الخلايا الليفية وإدارة المحتوى في المؤسسة ترسب20. إضافة المصل لا عوامل النمو لا بد للحث على تشكيل أرومية7. القرنيات بشكل روتيني ثابت وتجهيزها للأنسجة بعد أسبوعين ثقافة. للجينات ضربة قاضية، أو لاختبار آثار وكيلاً على التئام الجرح يمكن أن تعامل مع siRNA في الجرح بعد إصابة7 أو عامل القابلة لذوبان يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام، على التوالي8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes with lids attached&#160;</td>
			<td>Pel-freeze, Arkansas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm trephine&#160;</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K28014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade&#160;</td>
			<td>Personna</td>
			<td>0.009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>895110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08953-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes&#160;</td>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; 34120</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add all of the following components to DMEM/F-12:&#160; ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Vitamins Solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7256</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Use at 1 &#181;g/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% L-glutamine solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Sodium pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td>1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.&#160; Use from freezer each time media is made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABAM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7292</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>070-0483</td>
			<td>2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Iodine&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Cassettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>We use 3% NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Clear&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>314-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Ultra Pure</td>
			<td>200CSGP</td>
			<td>200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP327</td>
			<td>10mM, pH 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>M10742500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing agent&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>220-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Kit&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bermis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNAprotect Cell Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;76104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6140</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547 or C6198 (cy3 conjugated)</td>
			<td>1:200 Diluted in 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permafluor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62-6520</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA1-85999</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3&#160;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-165-146</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Zeiss Axioplan2&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOT-2</td>
			<td colspan="2">Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies

القرنية وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة التئام الجروح. القدرة على توليد واستخدام خلايا الثدييات الأولية في اثنين الأبعاد (2D) والثقافة (ثلاثي الأبعاد) الأبعاد الثلاثة قد ولدت ثروة معلومات ليس فقط حول البيولوجيا القرنية ولكن أيضا حول الجرح تضميد الجراح، والبيولوجيا أرومية، وتندب بشكل عام . وهدف البروتوكول هو نظام مقايسة للتحديد الكمي للتنمية أرومية، الذي يميز تندب. علينا أن نظهر ثقافة جهاز القرنية السابقين فيفو نموذج باستخدام عيون خنزير. في هذا كيراتيكتومي الأمامي الجرح، جرح القرنيات لا يزال في أنحاء العالم مع شفرة دائرية تسمى ترفين. يتم إزالة المكونات من حوالي 1/3 للقرنية الأمامي منها الظهارة والغشاء الطابق السفلي والجزء الأمامي ستروما. بعد إصابة، هي القرنيات قص من أنحاء العالم والتي شنت على قاعدة الكولاجين/أجار ومثقف لمدة أسبوعين في المصل تستكمل المتوسطة الحرة مع استقرار فيتامين C لزيادة تكاثر الخلايا وإفراز المصفوفة خارج الخلية من الخلايا الليفية المقيم. تفعيل ميوفيبروبلاستس في ستروما الأمامي يتجلى في القرنية تلتئم. يمكن استخدام هذا النموذج للاعتداء إغلاق الجرح، وضع علامات تليفية وميوفيبروبلاستس، ودراسات علم السموم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار تأثيرات مثبطات جزيء صغير، فضلا عن تعداء siRNA الدهن بوساطة للجينات ضربة قاضية في هذا النظام.

إيمونوهيستوتشيميستري هو الفحص الأولية المستخدمة لتحليل نجاح السابقين فيفو الجرح تجربة الشفاء. ويصور الشكل 4 ظهارة وسدى الأمامي في الأنسجة التحكم (الشكل 4A, 4B). ست ساعات بعد إصابة، الظهارة كان غائبا (الشكل 4، 4 د<...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies at JoVE.com

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

بروتوكول للسابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية مفيدة للجرح شفاء الدراسات هو وصف. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتقييم آثار عوامل لتعزيز الشفاء التجدد أو سمية العقاقير في بيئة متعددة الخلايا 3D منظم.

السابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية لالتئام الدراسات

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

وصفت هذه الورقة طريقة بسيطة لجرد الجرح في نظام نموذج ثقافة الجهاز متعدد الأبعاد والخلوية ثلاثي الأبعاد. نحن نفعل ذلك باستخدام عيون الخنزير، ولكن حتى لو كنت غير مألوفة مع العينين، يمكنك القيام بذلك الفحص. كنظرة عامة، تلقينا عيون porcine، وقطع الكرة الأرضية، وجعل الجرح الدائري في القرنية التي تمر عبر ظهارة وحوالي ثلث ستروما.نقطع القرنية، ونثبتها على قاعدة أجار، ونضع هذا البناء في الحاضنة. الأنسجة سوف تملأ في خلق ندبة في القرنية. لا تحتاج إلى إضافة أي عوامل النمو، أو حتى المصل.ويتم ذلك في وسائل الإعلام خالية من المصل. على الرغم من أن يتم تنفيذ هذا في القرنية، ويمكن استخدامه كنظام نموذجي للشفاء الليفي بشكل عام. كما العديد من المسارات الخلوية التي يتم تنشيطها أثناء تندب متشابهة بين النظم.في غطاء غطاء محرك السيارة للسلامة البيولوجية، استخدم شفرة جراحية على حافة مستقيمة لإزالة الكرة الأرضية من الغطاء على لوحة تقطيع تنظيف الإيثانول، وإزالة الأنسجة الدهنية الزائدة من كل عين. عقد العالم تنظيفها في وقت ما بعد مع ملقط تراجع على الفور العين في برنامج تلفزيوني تليها ثلاثة انخفاضات سريعة في 10٪ اليود، واثنين من الانخفاضات السريعة في برنامج تلفزيوني. ثم لف العين محيطاً مع أنسجة مختبر نظيفة لتلتف مع ما يكفي من الضغط لتحقيق سطح القرنية مشدود دون الاتصال القرنية.باستخدام التربهينات الستة ملليمترات، تخترق الظهارة في الستروما الأمامية في وسط القرنية دون إجراء جرح كامل السمك من خلال القرنية بأكملها، وتدوير الترفين 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة ومضادة عقارب الساعة خمس مرات مع تطبيق ضغط الضوء لتعميق الجرح. عندما يكون الجرح عميقًا بما يكفي للسماح برفع رفرف الأنسجة بالملقط ، استخدم شفرة جراحية لقطع رفرف موازٍ للعالم مع الاستمرار في رفع القرنية الأمامية ضمن هامش الجرح. عندما تتم إزالة رفرف كامل، يجب أن يكون موجودا الجرح الدائري في وسط القرنية.لحصاد القرنية فهم العين مع أنسجة المختبر، واستخدام شفرة الجراحية لجعل شق صغير ملليمتر واحد بعيدا عن حافة القرنية لتشمل جمع limbus والأنسجة. باستخدام مقص صغير، حاد مواصلة شق في جميع أنحاء العالم حفظ هامش ملليمتر عبر القرنية للحفاظ على limbus في لباقة. ثم ضع القرنية، جانب الجرح إلى أسفل، في طبق 60 ملليمتر، أو 100 ملليمتر يحتوي على ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.لتركيب القرنية، استخدم زوجين من ملقط لعقد القرنية الظهارية الجانب حتى لخلق كوب، واستخدام ماصة نقل العقيمة لإضافة محلول أجار دافئ في القرنية حتى الكأس الكامل. بعد تصلب أجار، ضع القرنية بعناية في لوحة جديدة من 60 ملليمترًا على الجانب الأسفل وقم بتغطية الطبق بغطاء. ثم تضاف أربعة ملليلترات من المتوسط الخالي من المصل التكميلي إلى كل صفيحة من القرنيات التي تحافظ على القرنيات عند واجهة هوائية سائلة على الحدود الطرفية في حاضنة لثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون، وتبلل الأسطح القرنية مرة واحدة يومياً مع قطرة واحدة من المتوسطة الخالية من المصل التكميلية من المتوسط المكيف في الطبق للحفاظ على رطوبة الأنسجة.بالنسبة للجينات النازلة ، اخلط خمسة ميكرولترات من التداخل الصغير أو siRNa مع 50 ميكرولترات من الحد الأدنى من المتوسط الأساسي في المصل واثنين من microliters من كاشف transfection. مع 50 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة لكل قرنية. بعد خمس دقائق، اخلطي خليطين معًا، وأضيفي 200 ميكرولترات من الحد الأدنى لمصل المصل المتوسط لكل خليط من الـ سيرنا.ثم الماصات حلول سيرنا إسقاط الحكمة على كل جرح. ثم ضع القرنيات في الحاضنة. بعد ثلاث ساعات، استخدم المتوسط في كل طبق لغسل الـ سيرنا من أسطح القرنية، واستبدل الوسط المكيف في كل طبق بمصل جديد مجاني بالإضافة إلى المضادات الحيوية.ثم إعادة الثقافات القرنية إلى حاضنة ثقافة الخلية، واحتضان لمدة أسبوعين. بعد ست ساعات من الإصابة ، ظهارة القرنية غائبة. بعد ستة أيام من الإصابة، ظهارة تنمو.الفلوريسنس الأمينية تلطيخ مع ألفا العضلات الملساء actin يكشف عن تدرج من myofibrobroblasts النشطة على طول هامش الجرح من الأمامي إلى ستروما الخلفي. مناعية هيستوكيميائية تلطيخ ألفا العضلات الملساء actin يكشف عن زيادة كبيرة في ألفا العضلات الملساء actin بروتين التعبير في الجرحى بالإضافة إلى التحكم القرنيات سيرنا. بالمقارنة مع البروتين غير المُجَوَّل والهادف الذي عالجته الـ(سيرنا) القرنية المجروحة.وبالمثل، يتم رفع النطاق الإضافي في الليفية A في القرنيات المعالجة في سيرنا مقارنة بالبروتين غير المُجَوَّل والهادف الذي عالجته سيرنا القرنيات المجروحة. إظهار نجاح هدم البروتين المستهدف. وعلاوة على ذلك، علاج القرنيات الجرحى مع السم الذي يستهدف بشكل غير محدد البروتين الهدف يمنع إعادة الظهارة ويؤدي إلى موت الخلايا النوعية، ومصفوفة غير منظمة، وvacuoles stromal مما يشير إلى أن السم لا يشجع الشفاء في تركيز مقايسة.في الختام، في حين تحاول هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تبقي شفرة موازية للأنسجة في حين قطع، بحيث لا تخترق الكرة الأرضية. ويمكن استخدام تقنيات مختلفة جرح مع هذا الفحص، بما في ذلك حرق الكيميائية أو كشط الظهارية. ويمكن أيضا أن تستخدم لمقايس سمية المخدرات لتحديد ما إذا كان ظهارة يشفي وعلى أي معدل.هذا هو التوفير في التكاليف السابقين vivo، الجهاز نظام نموذج ثقافة التي يمكن أن تسبق الخاص بك في دراسات الشفاء الجروح الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

نموذج الفئران من التئام الجروح

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

الفئران التنظير ل<em&gt; في فيفو</em&gt; شفاء المتعدد الوسائط التصوير من التسرطن وتقييم المعوية والتهاب الجرح

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

نموذج حيوانات صغيرة من نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

سحجه الظهارة القرنية مع لدغ العين كنموذج للقرنية التئام الجروح

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

استهداف كومونيكانتيس رامي الرمادية في الأوردة القطنية الكيميائية انتقائية

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

نموذج زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمضاعفات فيبروفاسكولار في اعتلال الشبكية السكري التكاثري

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

فحص الهجرة الصفر وغرفة الجلد السمرة لتحليل في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء الجروح

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

نموذج ثقافة الجهاز البطانية القرنية الخنازير باستخدام أزرار القرنية الانقسام

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

دراسات الفيزيولوجيا الكهربية والدراسات الكهربائية السابقة لل فيفو لانغرندوف

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

نموذج التآكل الظهاري لدراسة التئام جروح القرنية

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...