Name: ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00
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这项工作得到了 nih-nei r01 ey024942、预防失明研究、州立医科大学无限制研究基金和狮子区20-y 的支持, 在显微镜核心进行了石蜡切片的显微镜和图像分析。组织学幻灯片的准备工作是在西奈山伊坎医学院的生物存储和病理核心进行的。

1. 器官文化
<ol><li>
准备
	<ol>
<li>准备琼脂解决方案, 如下所示。在一个小烧瓶中, 在 dmem-f12 中制备1% 琼脂和 1 mgml 牛胶原蛋白, 最高可达20毫升。在热盘上煮沸。将溶液放入50毫升的锥形管中。将管子放在热水澡中的热板上, 以防止溶液凝固。</li>
		<li>根据材料表中提供的成分准备补充的无血清介质 (ssfm)。 请注意:要准备的 ssfm 的必要数量取决于要处理的角?...

该协议描述了一个模型, 用于研究在自然分层三维环境中的伤口愈合。使用器官培养作为细胞培养和体内研究之间的中间体, 大大降低了成本, 也减少了活体动物的程序。其他3d 模型对该领域有很大的好处, 包括由原代人类角膜成纤维细胞 2或这些相同的细胞嵌入在由动物衍生胶原蛋白31制成的凝胶中的自合成胶原蛋白凝胶.器官培养模型系统对于测试假定的治疗剂...

由于受伤、外伤或感染而导致的角膜损伤会导致虚弱的不平衡和永久性视力下降。因此, 迫切需要确定可针对治疗干预的途径。目前的治疗选择有限, 主要包括角膜移植, 世界各地的病人都无法获得角膜移植。人 (图 1) 和动物角膜都可用于2d 和3d 细胞培养研究1,2。不适合移植的人体尸体角膜可以从眼库或中央组织库 (国家疾病研究相互交流 (ndri)) 获得, 动物眼睛可以从屠宰场获得。原代角膜上皮细胞、基质成纤维细胞以及最近的内皮细胞, 可以从这些组织中分离和培养, 用于伤口愈合和毒理学研究 3,4,5。除了了解致盲眼病的分子基础、组织的可获得性和培养原代细胞的能力外, 角膜也是重要的研究模型系统。角膜是理想的测试剂对疤痕的影响, 因为正常角膜是透明的, 某些类型的伤口造成不透明或纤维化疤痕 (回顾在 6)。几种体内角膜伤口愈合模型也被广泛用于疤痕研究1。利用较少的是体外角膜伤口愈合模型7,8 , 这里详细描述。该方法的目的是量化在三维多细胞角膜外模型系统中由纤维化的制造商所特有的疤痕结局。
角膜上皮伤, 不违反上皮基底膜通常关闭在 24-72 h9。受伤后不久, 上皮边缘的细胞开始扩散并迁移到上皮自由表面, 以重建上皮屏障功能。这一活动随后依次激活角膜基底细胞增殖, 并在稍后阶段, 前驱细胞位于外缘膜区, 以实现上皮细胞质量的恢复 10,11.这些伤口往往愈合而没有疤痕。然而, 穿透基底膜进入间质的伤口往往会导致疤痕形成1。角膜间质损伤后, 间质由多个来源的细胞组成, 包括分化的常驻间质细胞以及骨髓源性纤维细胞 12,13,14。纤维化疤痕的特点是肌成纤维细胞在愈合伤口的持久性。这些病理性肌成纤维细胞表现出增加的粘附通过整合整合在局灶性粘连, 收缩α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma) 应力纤维, 并局部激活细胞外基质 (ecm) 隔离后期转化的生长因子-β (tgfβ)。上皮细胞的分化, 称为上皮间充质转变 (emt), 也可能有助于瘢痕的形成 6.
细胞分化和损伤后细胞凋亡之间存在微妙的平衡。由于基底膜的断裂, 生长因子, 如血小板衍生生长因子 (pdgf) 和 tgfβ的生长因子, 如血小板衍生生长因子 (pdgf) 和 tgfβ, 由于眼泪和上皮沐浴的间质, 诱导肌成纤维细胞分化, 一个持续的自体循环 tgfβ, 和分泌不组织的纤维化 ecm15,16。肌成纤维细胞在愈合的伤口中的持续存在会促进角膜的雾霾和疤痕 (图 2)。然而, 在再生愈合的伤口, 虽然肌成纤维细胞的发展, 他们凋亡, 因此是缺席或明显减少的数量在愈合的组织 (回顾在参考6,10)。因此, 对纤维化疤痕的研究至少在一定程度上集中在靶向分子上, 以防止肌成纤维细胞过度发育或肌成纤维细胞持久性17,18。由于肌成纤维细胞的持久性在所有组织19中都有疤痕和纤维化疾病的特点, 角膜可能是研究纤维化的一般细胞机制的模型系统。
在我们的模型系统中, 角膜在地球上的时候被一个称为树状的圆柱形刀片击伤。人和猪角膜可以用6或7毫米的头孢菌伤;对于兔角膜是首选6毫米树状。猪角膜的大小与人角膜相似。因为猪角膜具有成本效益, 而且数量广泛, 因此通常用于器官培养。此外, 与人发生反应的抗体和 sirna 一直与猪7交叉反应。伤人后, 角膜被切割出地球与石灰完整, 并安装在琼脂胶原蛋白基地。角膜在无血清介质中培养, 并加入稳定的维生素 c, 以模拟成纤维细胞增殖和 ecm 沉积20。诱导肌成纤维细胞形成均不需要血清的添加和生长因子.在经过两周的培养后, 角膜定期固定和处理组织学。对于基因敲除, 或测试药物对伤口愈合的影响, 伤口可在伤后用 sirna 治疗, 伤后7人, 或可在培养基中添加可溶性剂, 分别为 8。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes with lids attached&#160;</td>
			<td>Pel-freeze, Arkansas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm trephine&#160;</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K28014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade&#160;</td>
			<td>Personna</td>
			<td>0.009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>895110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08953-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes&#160;</td>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; 34120</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add all of the following components to DMEM/F-12:&#160; ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Vitamins Solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7256</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Use at 1 &#181;g/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% L-glutamine solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Sodium pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td>1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.&#160; Use from freezer each time media is made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABAM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7292</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>070-0483</td>
			<td>2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Iodine&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Cassettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>We use 3% NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Clear&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>314-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Ultra Pure</td>
			<td>200CSGP</td>
			<td>200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP327</td>
			<td>10mM, pH 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>M10742500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing agent&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>220-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Kit&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bermis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNAprotect Cell Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;76104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6140</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547 or C6198 (cy3 conjugated)</td>
			<td>1:200 Diluted in 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permafluor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62-6520</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA1-85999</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3&#160;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-165-146</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Zeiss Axioplan2&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOT-2</td>
			<td colspan="2">Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies

角膜已被广泛用作研究伤口愈合的模型系统。在二维 (2d) 和三维培养中产生和利用原代哺乳动物细胞的能力, 不仅产生了大量关于角膜生物学的信息, 而且还产生了大量关于伤口愈合、肌成纤维细胞生物学和一般疤痕的信息。.该方案的目标是一个检测系统, 用于定量肌成纤维细胞的发展, 其特点是疤痕。我们展示了一个角膜器官培养的体外模型使用猪眼。在这个前角膜切除术伤口, 角膜仍然在地球上受伤的圆形刀片称为树状。大约 1, 1 的角膜前部的塞子被切除, 包括上皮, 基底膜, 和前部的间质。受伤后, 角膜从地球上被切割, 安装在胶原蛋白基地, 并在补充血清游离培养基中培养两周, 并具有稳定的维生素 c, 以增加细胞增殖和细胞外基质分泌的居住性成纤维细胞。肌成纤维细胞在角膜愈合中的激活是明显的。该模型可用于检测创面闭合、肌成纤维细胞和纤维化标志物的发育以及毒理学研究。此外, 小分子抑制剂以及脂介导的 sirna 转染对基因敲除的影响可以在该系统中进行测试。

免疫组织化学是分析体外创面愈合实验成功的主要方法。图 4显示对照组织中的上皮和前间质 (图 4a, 4A)。受伤6小时后, 上皮无 (图 4c, 4C)。如预期的伤势后六天, 上皮已重新生长 (图 4e, 4E)。该组织对α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma) 进行免疫抑制, 其表达...

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Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

介绍了一种适用于伤口愈合研究的体外角膜器官培养模型的方案。该模型系统可用于评估药物在有组织的3d 多细胞环境中促进再生愈合或药物毒性的效果。

创面愈合研究的前活体角膜器官培养模型

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

本文介绍了一种在三维多细胞器官培养模型系统中进行损伤测定的简单方法。我们用猪眼来做，但即使你不熟悉眼睛，你也可以做这种检测。作为概述，我们收到了猪眼，切出地球，在角膜做一个圆形伤口，通过上皮和约三分之一的频闪。我们切掉角膜，把它安装在Agar底座上，把这个结构放在孵化器里。组织将填补在角膜中留下疤痕。你不需要添加任何生长因子，甚至血清。这是在无血清介质中完成的。虽然这是在角膜中进行的，但它一般可用作纤维愈合的模型系统。由于许多在疤痕期间激活的细胞通路在系统之间是相似的。在生物安全罩中，使用直刃手术刀片将地球从乙醇清洁的切碎板上的盖子上取下，并去除每只眼睛多余的脂肪组织。用钳子将清洁的地球后侧立即将眼睛浸入 PBS 中，随后在 10% 碘中快速浸下三次，在 PBS 中快速浸下两次。然后用干净的实验室组织将眼睛绕周包裹起来，用足够的压力包裹，以达到绷紧的角膜表面，而无需接触角膜。使用六毫米的颤数，穿透角膜中心前频闪的上皮，而不使整个角膜有全厚度伤口，顺时针和逆时针旋转 180 度，同时施加轻压以加深伤口。当伤口足够深，允许用钳子提起组织皮瓣时，使用手术刀片切割与地球平行的皮瓣，同时继续抬起伤口边缘内的前角膜。拆下整个皮瓣后，角膜中心应有圆形伤口。收获角膜抓住眼睛与实验室组织，并使用手术刀片，使一个小切口一毫米远的角膜的边缘，包括肢体和组织收集。使用小而锋利的剪刀继续切口遍至全球，在角膜上保持一毫米的边距，以保持肢体的机智。然后将角膜，伤口侧向下，在60毫米，或100毫米的菜包含一毫升PBS。要安装角膜，请使用两对钳子将角膜上皮面向上握住以创建一个杯子，并使用无菌转移移液器将加热的阿加溶液添加到角膜中，直到杯子充满。在阿加硬化后，小心地将角膜放在新的60毫米板或方下，用盖子盖住盘子。然后在每盘角膜上加入四毫升补充无血清介质，在细胞培养培养箱中，在 37 摄氏度的细胞培养箱中保持角膜的气液界面，在 5%的二氧化碳中，每天用一滴从培养皿中的调节介质中补充的无血清介质润湿角膜表面，以保持组织水分。对于基因敲落，将5微升小干扰或siRNa与50微升的降低血清最小必需介质和2微升转染试剂混合。每角膜有50微升的血清介质。五分钟后，将两种混合物混合在一起，并在每个 siRNA 混合物中加入 200 微升的降低血清最小介质。然后移液器 siRNA 溶液明智地滴到每个伤口上。然后把角膜放进孵化器里。三个小时后，使用每道菜的培养皿从角膜表面清洗siRNA，用新鲜补充的血清自由介质加抗生素代替每道菜中的调节介质。然后将角膜培养物返回到细胞培养箱，孵育两周。受伤6小时后，角膜上皮不存在。受伤六天后，上皮重新生长。荧光氨基染色与阿尔法平滑肌肉作用，揭示了活动肌纤维细胞的梯度沿伤口边缘从前到后频闪。阿尔法平滑肌肉作用素的免疫组织化学染色显示，在受伤加上控制siRNA角膜的α平滑肌肉作用素蛋白表达显著增加。相比未松和目标蛋白siRNA治疗，受伤的角膜。同样，与未编织的和目标蛋白siRNA治疗的受伤角膜相比，纤维素额外域A在siRNA治疗的受伤角膜中得到调节。证明成功击倒目标蛋白。此外，用非特异性靶向目标蛋白的毒素治疗受伤的角膜可防止再上皮化，导致质量细胞死亡、无组织基质和频闪真空，表明毒素在测定浓度时不会促进愈合。总之，在尝试此过程时，重要的是记住在切割时保持刀片与组织平行，以便它不会穿透地球。这种检测可以使用不同的伤害技术，包括化学烧伤或上皮刮伤。它也可用于药物毒性测定，以确定上皮是否愈合，以什么速度。这是一个节省成本的体外，器官培养模型系统，可以先于你的体内伤口愈合研究。

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