Name: ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par les NIH-NEI R01 EY024942, recherches pour prévenir la cécité, Upstate Medical University sans restriction Research Funds, et Lions District 20-y microscopie et analyse d’images de sections de paraffine ont été effectuées à la base de la microscopie et préparation histologique a été réalisée à la banque de tissus biologiques et le noyau de la pathologie à l’école de médecine de l’Icahn au mont Sinaï.

1. organe Culture
<ol><li>
Préparations
	<ol>
<li>Préparer la solution d’agar comme suit. Dans un petit ballon, préparer 1 % d’agar et de collagène d’origine bovine en DMEM-F12 1 mg/mL à 20 mL. Porter à ébullition sur une plaque chauffante. Mettre la solution dans un tube conique de 50 mL. Placer le tube dans un bain d’eau sur une plaque chauffante pour empêcher la solution de solidification.</li>
		<li>Préparer supplémenté médias sans sérum (SSFM) selon la composition fournie dans...

Ce protocole décrit un modèle pour étudier la cicatrisation dans un environnement 3D stratifié naturel. Utilisation de la culture de l’orgue comme intermédiaire entre la culture cellulaire et études in vivo réduit considérablement les coûts ainsi que les procédures de réduction sur les animaux vivants. Autres modèles 3D ont été d’une grande utilité sur le terrain, y compris la synthèse des gels collagène fabriqués à partir de fibroblastes cornée humaine primaire2 ou ces mê...

Cicatrisation de la cornée résultant de la blessure, un traumatisme ou une infection peut conduire à débiliter des opacités cornéennes et une cécité permanente. Ainsi, il y a un besoin essentiel d’identifier les voies qui peuvent être ciblés pour une intervention thérapeutique. Les options thérapeutiques actuelles sont limitées et consistent principalement en des greffes de cornée, qui ne sont pas accessibles aux patients à travers le monde. Tant humaines (Figure 1) et cornées animales peuvent être utilisées pour la 2D et la culture cellulaire 3D études1,2. Cornées de cadavre humain ne convient pas pour la transplantation peuvent être obtenues auprès de banques de le œil ou banques de tissus centralisé (National Disease Research Interchange (NDRI)), et animaux yeux peut provenir d’un abattoir. Cellules épithéliales cornéennes primaires et plus récemment, les cellules endothéliales, fibroblastes stromales peuvent être isolées et cultivées de ces tissus pour la cicatrisation des plaies et des études de toxicologie3,4,5. En plus de l’importance de comprendre les bases moléculaires de l’aveuglement des maladies oculaires, l’accessibilité des tissus et la capacité de cellules primaires de la culture a fait de la cornée un important système modèle pour l’étude. La cornée est idéale pour tester les effets des agents sur la cicatrisation de la cornée normale est transparente et de certains types de blessures créent opacités ou cicatrices fibreuses (évaluées à6). Aussi, plusieurs en vivo plaie cornéenne, modèles guérison ont été largement utilisés pour cicatrices études1. Moins utilisé a été l’ex vivo cornée plaie guérison modèle7,8 qui est décrit en détail ici. Cette méthode vise à quantifier les résultats cicatrisation caractérisées par les responsables fibreuses dans une 3D multicellulaires cornée ex vivo système de modèle.
Blessant épithéliale cornéenne qui ne viole pas la membrane basale épithéliale normalement ferme dans les 24 à 72 h9. Bientôt après la blessure, les cellules au bord de l’épithélium commencent à répandre et migrer vers la surface épithéliale et libre, pour rétablir la fonction barrière épithéliale. Cette activité est suivie dans l’ordre d’activation de la prolifération de la cornée Baso-cellulaire tout d’abord et, à un stade ultérieur, de cellules précurseurs situé dans la zone limbique extérieure pour obtenir la récupération de cellules épithéliales masse10,11. Ces blessures guérissent souvent sans laisser de cicatrices. Cependant, une blessure qui pénètre la membrane de sous-sol dans le stroma souvent traduit par cicatrice formation1. Après la blessure de stroma cornéen, le stroma est rempli avec des cellules de plusieurs origines, y compris les cellules stromales résidents différenciés ainsi que dérivés de la moelle osseuse des fibrocytes12,13,14. Cicatrices fibreuses se caractérise par la persistance des myofibroblastes dans une plaie de guérison. Ces myofibroblastes pathologiques démontrent une adhérence accrue grâce à l’accumulation des intégrines en focales, fibres de stress contractile musculaire lisse α actine (α-SMA) et activation locale de la matrice extracellulaire (ECM)-séquestré latente-transformant le facteur de croissance-bêta (TGFβ). La différenciation des cellules épithéliales dérivées, sous le titre épithéliales transition mésenchymateuse (EMT), peut-être aussi contribuer à6de la formation de cicatrices.
Il y a un équilibre délicat entre la différenciation cellulaire et l’apoptose après la blessure. En raison de la violation dans les membranes basales, les facteurs de croissance comme facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) et de TGFβ de larmes et de l’épithélium baignent le stroma, induisant la différenciation des myofibroblastes, une boucle autocrine soutenue d’activation de TGFβ, ainsi que la sécrétion de désorganisé fibrotique ECM15,16. La persistance des myofibroblastes dans la blessure guérie favorise la brume et la cicatrisation de la cornée (Figure 2). Cependant, en régénération guéri plaie bien que développent des myofibroblastes, ils apoptose et donc sont absents ou significativement réduite en nombre dans les tissus cicatrisés (revu en référence6,10). Ainsi, les recherches sur les cicatrices fibreuses portent au moins en partie sur le ciblage des molécules qui empêchent le développement excessif de myofibroblastes ou myofibroblastes persistance17,18. Parce que la persistance de myofibroblastes caractérise les cicatrices et fibrose maladie dans tous les tissus19, la cornée peut être utile comme système modèle pour étudier les mécanismes cellulaires généraux de la fibrose.
Dans notre système de modèle, la cornée est blessée avec une lame cylindrique appelée un trépan tout en restant dans le monde entier. Humaine et cornées de porc peuvent être blessées avec soit un trépan mm 6 ou 7 ; pour les cornées de lapin un trépan de 6 mm est préférable. La cornée de cochon est similaire en taille à la cornée humaine. Parce qu’ils sont rentables et facilement disponibles en grand nombre, des cornées de porc sont couramment utilisées pour la culture de l’orgue. En outre, les anticorps et siRNAs fait réagir avec l’homme ont constamment réagissent avec porc7. Après la blessure, cornées sont découpées dans le monde entier avec le limbe intactes et monté sur une base de gélose/collagène. Les cornées sont cultivées dans un milieu sans sérum plusent stabilisé de vitamine C pour simuler la prolifération des fibroblastes et ECM dépôts20. L’ajout de sérum ni facteurs de croissance sont nécessaires pour induire la formation de myofibroblastes7. Cornées sont systématiquement fixes et transformées pour histologie après deux semaines de culture. Pour de gène, ou pour tester les effets d’un agent sur la cicatrisation des plaies, la plaie peut être traitée avec des siARN dans la plaie après la blessure de7 ou un agent soluble peut être ajouté aux médias, respectivement8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes with lids attached&#160;</td>
			<td>Pel-freeze, Arkansas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm trephine&#160;</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K28014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade&#160;</td>
			<td>Personna</td>
			<td>0.009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>895110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08953-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes&#160;</td>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; 34120</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add all of the following components to DMEM/F-12:&#160; ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Vitamins Solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7256</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Use at 1 &#181;g/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% L-glutamine solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Sodium pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td>1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.&#160; Use from freezer each time media is made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABAM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7292</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>070-0483</td>
			<td>2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Iodine&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Cassettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>We use 3% NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Clear&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>314-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Ultra Pure</td>
			<td>200CSGP</td>
			<td>200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP327</td>
			<td>10mM, pH 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>M10742500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing agent&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>220-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Kit&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bermis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNAprotect Cell Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;76104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6140</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547 or C6198 (cy3 conjugated)</td>
			<td>1:200 Diluted in 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permafluor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62-6520</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA1-85999</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3&#160;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-165-146</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Zeiss Axioplan2&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOT-2</td>
			<td colspan="2">Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies

La cornée a été utilisée intensivement comme système modèle pour étudier la cicatrisation des plaies. La capacité de générer et d’utiliser des cellules primaires de mammifères en deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) culture a généré une mine de renseignements non seulement sur la biologie de la cornée, mais aussi sur la plaie, guérison, myofibroblastes biologie et la cicatrisation en général . L’objectif du protocole est un système de dosage pour quantifier les myofibroblastes développement, qui caractérise la cicatrisation. Nous démontrons un cornée orgue ex vivo modèle de culture à l’aide des yeux de cochon. Dans cette kératectomie antérieure enroulé, cornées encore dans le monde sont blessées avec une lame circulaire appelée un trépan. Un bouchon d’environ 1/3 de la cornée antérieure est supprimé y compris l’épithélium, la membrane basale et la partie antérieure du stroma. Après la blessure, cornées sont coupées du monde, montées sur un socle de collagène/agar et cultivées pendant deux semaines en milieu sans sérum complétée de vitamine c stabilisée pour augmenter la prolifération cellulaire et la sécrétion de la matrice extracellulaire par les fibroblastes résidents. Activation des myofibroblastes dans le stroma antérieur est évidente dans la cornée cicatrisée. Ce modèle peut être utilisé pour doser la fermeture de la plaie, le développement des myofibroblastes et marqueurs fibreuses et pour les études de toxicologie. En outre, les effets des inhibiteurs de petites molécules comme la transfection de siARN médiée par les lipides pour de gène peuvent être testées dans ce système.

Immunohistochemistry est le test principal utilisé pour analyser le succès de l’ex vivo plaie expérience de guérison. La figure 4 illustre l’épithélium et le stroma antérieur en tissu témoin (Figure 4 a, 4 b). Six heures après la blessure, l’épithélium est absente (Figure 4, 4D). Six jours après la blessure comme prévu, l’épithélium avait augme...

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Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Un protocole pour un ancien modèle de culture de cornée orgue vivo utile pour la cicatrisation des études est exposée. Ce système de modèle peut servir à évaluer les effets des agents pour favoriser la guérison régénératrice ou toxicité des médicaments dans un environnement 3D organisé de multicellulaire.

Ex Vivo, modèle de Culture d’organes cornéenne pour la cicatrisation des études

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Cet article a décrit une méthode simple pour apaiser la blessure dans un système tridimensionnel et multicellulaire de culture d’organe. Nous le faisons en utilisant des yeux de porc, mais même si vous n’êtes pas familier avec les yeux, vous pouvez faire ce test. Comme vue d’ensemble, nous avons reçu des yeux de porc, découpé les globes, faire une blessure circulaire dans la cornée qui passe par l’épithélium et environ un tiers du stroma.Nous avons découpé la cornée, et la monter sur une base d’agar, et mettre cette construction dans l’incubateur. Le tissu se remplira en créant une cicatrice dans la cornée. Vous n’avez pas besoin d’ajouter des facteurs de croissance, ni même du sérum.Ceci est fait dans les médias sans sérum. Bien que cela soit effectué dans la cornée, il peut être utilisé comme un système modèle pour la guérison fibrotique en général. Comme beaucoup de voies cellulaires qui sont activées pendant la cicatrisation sont similaires entre les systèmes.Dans une hotte de biosécurité, utilisez une lame chirurgicale à bord droit pour retirer le globe du couvercle sur une planche à découper nettoyée à l’éthanol et enlever l’excès de tissu adipeux de chaque œil. Tenir le globe nettoyé postérieurement avec des forceps plongent immédiatement l’oeil dans PBS suivi de trois immersions rapides dans 10% d’iode, et deux immersions rapides dans PBS. Enveloppez ensuite l’œil circonférentiellement avec un tissu de laboratoire propre pour envelopper avec suffisamment de pression pour atteindre une surface cornéenne tendue sans entrer en contact avec la cornée.À l’aide d’une tréphine de six millimètres, pénétrer l’épithélium dans le stroma antérieur au centre de la cornée sans faire une plaie d’épaisseur complète à travers toute la cornée, et faire pivoter la tréphine 180 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre cinq fois tout en appliquant une légère pression pour approfondir la plaie. Lorsque la plaie est suffisamment profonde pour permettre à un rabat de tissu d’être soulevé avec des forceps, utilisez une lame chirurgicale pour couper le rabat parallèle au globe tout en continuant à soulever la cornée antérieure dans la marge de la plaie. Lorsque l’aileron entier a été enlevé, une plaie circulaire doit être située au centre de la cornée.Pour récolter la cornée saisir l’œil avec le tissu de laboratoire, et utiliser une lame chirurgicale pour faire une petite incision à un millimètre du bord de la cornée pour inclure le limbus et la collecte des tissus. À l’aide de petits ciseaux pointus, continuer l’incision autour du globe en gardant une marge millimétrique à travers la cornée pour maintenir les limbes en tact. Placez ensuite la cornée, côté enroulé vers le bas, dans un plat de 60 millimètres ou de 100 millimètres contenant un millilitre de PBS.Pour monter la cornée, utilisez deux paires de forceps pour maintenir le côté épithélial de la cornée vers le haut pour créer une tasse, et utilisez une pipette de transfert stérile pour ajouter la solution d’agar réchauffée dans la cornée jusqu’à ce que la tasse soit pleine. Après que l’agar durcit, placez soigneusement la cornée dans une nouvelle plaque de 60 millimètres côté agar vers le bas et couvrez la plaque avec un couvercle. Ajoutez ensuite quatre millilitres de milieu complété sans sérum à chaque assiette de cornées qui maintiennent les cornées à une interface air-liquide à la frontière limbale dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 %, et mouillant les surfaces cornéennes une fois par jour avec une goutte de milieu complété sans sérum à partir du milieu conditionné dans le plat pour garder les tissus hydratés.Pour le knockdown de gène, mélangez cinq microlitres de petite interférence ou de siRNa avec 50 microlitres du milieu essentiel minimum réduit de sérum et deux microlitres du réagent de transfection. Avec 50 microlitres de sérum réduit moyen par cornée. Après cinq minutes, mélanger les deux mélanges et ajouter 200 microlitres de sérum réduit minimum moyen à chaque mélange de siRNA.Ensuite pipette les solutions siRNA tomber sage sur chaque blessure. Ensuite, mettez les cornées dans l’incubateur. Après trois heures, utiliser le milieu dans chaque plat pour laver le siRNA des surfaces cornéeennes, et remplacer le milieu conditionné dans chaque plat par un milieu frais complété sans sérum plus des antibiotiques.Retournez ensuite les cultures cornéeennes à l’incubateur de culture cellulaire et incubez pendant deux semaines. Six heures après la blessure, l’épithélium cornéen est absent. Six jours après la blessure, l’épithélium repousse.La coloration d’aminé de fluorescence avec l’actine lisse d’alpha de muscle indique un gradient des myofibroblastes actifs le long de la marge de blessure du stroma antérieur au stroma postérieur. La coloration immuno-histochimique pour l’actine lisse d’alpha de muscle indique une augmentation dramatique de l’expression lisse d’actine de muscle alpha dans les cornées blessées plus de contrôle de siRNA. Comparé aux siRNA de protéine non tissés et cibles traités, cornées blessées.De même, la fibronectine extra domaine A est régulée dans les cornées blessées traitées par siRNA par rapport aux cornées blessées non réveillées et cibles traitées par siRNA. Démonstration d’un renversement réussi de la protéine cible. En outre, le traitement des cornées blessées avec la toxine qui cible non spécifiquement la protéine cible empêche la rééthélialisation et entraîne la mort qualitative des cellules, une matrice désorganisée, et des vacuoles stromales suggérant que la toxine ne favorise pas la guérison à la concentration assayed.En conclusion, tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de garder la lame parallèle au tissu tout en coupant, de sorte qu’il ne pénètre pas dans le globe. Différentes techniques de blessure peuvent être employées avec cet essai, y compris la brûlure chimique ou la éraflure épithéliale. Il peut également être utilisé pour les tests de toxicité des médicaments pour déterminer si l’épithélium guérit et à quel rythme.Il s’agit d’un système de modèle de culture d’organes ex vivo qui peut précéder vos études in vivo sur la cicatrisation des plaies.

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