Name: ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH-NEI R01 EY024942, Forschung, um zu verhindern, dass Blindheit, Upstate Medical University Research Eigenkapital, und Lions Distrikt 20-Y. Mikroskopie und Bildanalyse von Paraffin Abschnitte wurden durchgeführt in der Mikroskopie-Kern und histologischen Folie Vorbereitung erfolgte am Biorepository und Pathologie Kern der Icahn School of Medicine am Berg Sinai.

1. Orgel-Kultur
<ol><li>
Vorbereitungen
	<ol>
<li>Agar-Lösung wie folgt vorbereiten. In ein kleines Fläschchen zubereiten, 1 % Agar und 1 mg/mL bovinen Kollagen in DMEM-F12 bis 20 mL. Auf einer Herdplatte zum Kochen bringen. Setzen Sie die Lösung in ein 50 mL konische Röhrchen. Legen Sie Rohr in einem Wasserbad auf einer heißen Platte, die Lösung von Verfestigung zu halten.</li>
		<li>Bereiten Sie ergänzte serumfreie Medien (SSFM) gemäß der Zusammensetzung in der Tabelle der Materialie...

Dieses Protokoll beschreibt ein Modell für die Wundheilung in einer natürliche geschichteten 3D-Umgebung zu studieren. Verwendung der Orgel Kultur als Zwischenprodukt zwischen Zellkultur und in vivo Studien reduziert Kosten sowie reduzierende Verfahren an lebenden Tieren. Andere 3D Modelle haben von großem Nutzen für das Feld einschließlich Self Synthese von Kollagen Gele aus primären menschlichen Hornhaut Fibroblasten2 oder diese dieselben Zellen hergestellt in Gele hergestellt aus tierisch...

Narbenbildung in der Hornhaut, die aufgrund von Verletzungen, Trauma oder Infektion kann zu schwächenden Linsentrübungen und permanenten Sehverlust führen. Deshalb müssen Wege zu identifizieren, die für eine therapeutische Intervention ausgerichtet werden können. Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt und besteht hauptsächlich aus Hornhaut Transplantationen, die nicht auf der ganzen Welt für Patienten zugänglich sind. Mensch (Abbildung 1) und tierischen Hornhaut genutzt werden, für 2D und 3D Zellkultur Studien1,2. Menschliche Kadaver Hornhäute nicht geeignet für Transplantation erhalten Sie von Auge Banken oder zentralisierte Gewebebanken (National Disease Research Interchange (NDRI)) und Tieraugen erhalten Sie von einem Schlachthof. Primäre Epithelzellen der Hornhaut, stromale Fibroblasten und neuerdings auch endothelial Zellen isoliert und kultiviert aus diesen Geweben für die Wundheilung und Toxikologie Studien3,4,5. Neben der Bedeutung von Verständnis der molekularen Grundlagen der blendenden Augenkrankheit hat die Zugänglichkeit der Gewebe und die Fähigkeit zur primären Zellkulturen der Hornhaut ein wichtiges Modellsystem für Studie gemacht. Die Hornhaut ist ideal für die Prüfung der Auswirkungen der Agenten auf Narben wie die normale Hornhaut durchsichtig ist und bestimmte Arten von Wunden schaffen, Trübungen oder fibrotische Narben (rezensiert in6). Mehrere in-Vivo Hornhaut Wunde heilende Modelle wurden auch ausgiebig genutzt, für die Narbenbildung Studien1. Weniger genutzt wurde die Ex Vivo Hornhaut verwunden heilende Modell7,8 , die hier ausführlich beschreiben. Das Ziel dieser Methode ist es, Narbenbildung Ergebnisse zeichnet sich durch fibrotische Entscheidungsträger in ein 3D mehrzelligen quantifizieren Hornhaut ex-Vivo-Modell-System.
Innerhalb von 24-72 h9schließt Hornhaut epithelialen Verwundung, die nicht der epithelialen Basalmembran Regel verstoßen. Bald nach der Verwundung beginnen die Zellen am Rand des Epithels Verbreitung und Migration in der epithelialen Oberfläche, epitheliale Barrierefunktion wieder herzustellen. Diese Aktivität folgt sequentiell durch Aktivierung der Hornhaut Basal-Zell-Proliferation zuerst und in einem späteren Stadium der Vorläuferzellen liegt im limbischen Außenzone, Wiederherstellung der Epithelzelle Masse10,11zu erreichen. Diese Wunden heilen oft ohne Narbenbildung ab. Allerdings führt eine Wunde, die oft die Basalmembran in das Stroma dringt Narbe Bildung1. Nach Hornhaut Stromazellen verletzt wurden, wird das Stroma mit Zellen mehrere Herkunft einschließlich resident Stromazellen Körperzellen sowie dem Knochenmark stammenden Fibrocytes12,13,14aufgefüllt. Fibrotische Narben zeichnet sich durch die Beharrlichkeit der Myofibroblasts in einer heilenden Wunde. Diese pathologischen Myofibroblasts zeigen erhöhte Adhäsion durch die Anhäufung von Integrine in fokalen Adhäsionen, kontraktilen α-glatten Aktin (α-SMA) Stress Muskelfasern und lokale Aktivierung der extrazellulären Matrix (ECM)-abgesondert latente Umwandlung Wachstumsfaktor-Beta (TGFβ). Die Differenzierung der epithelialen gewonnenen Zellen, bekannt als epitheliale mesenchymale Transition (EMT), kann auch dazu beitragen, die Bildung6Narbe.
Es ist ein empfindliches Gleichgewicht zwischen Zell-Differenzierung und Apoptose nach Verwundung. Wegen der Verletzung in der Basalmembran, Wachstum Faktoren wie Platelet-derived Wachstumsfaktor (PDGF) und TGFβ aus Tränen und das Epithel das Stroma Baden induzieren Myofibroblast Unterscheidung, eine nachhaltige autokrine Schleife der TGFβ Aktivierung, und die Sekretion von unorganisiert fibrotische ECM15,16. Die Persistenz von Myofibroblasts in der geheilte Wunde fördert Haze und Narbenbildung in der Hornhaut (Abbildung 2). Jedoch in regenerativ heilte Wunde obwohl Myofibroblasts entwickeln, sie Apoptose und somit fehlen oder in deutlich reduzierten Anzahl in das vernarbte Gewebe (rezensiert in Referenz6,10). So konzentrierte Forschung auf fibrotische Narben zumindest teilweise auf targeting Moleküle, die übermäßige Myofibroblast Entwicklung oder Myofibroblast Persistenz17,18zu verhindern. Weil Myofibroblast Persistenz Narbenbildung und fibrotischen Erkrankungen in allen Geweben19charakterisiert, kann die Hornhaut als Modellsystem, allgemeine zelluläre Mechanismen der Fibrose zu studieren nützlich.
In unserem Modellsystem wird die Hornhaut mit einer zylindrischen Klinge genannt gilt in der ganzen Welt verletzt. Mensch und Schwein Hornhaut können mit entweder eine 6 oder 7 mm Trephine; verwundet bei Kaninchen Hornhaut wird ein 6 mm Trephine bevorzugt. Die Schwein-Hornhaut ist ähnlich groß wie der menschlichen Hornhaut. Weil sie kostengünstig und in großen Stückzahlen verfügbar sind, werden routinemäßig Schwein Hornhäute für Orgel Kultur verwendet. Darüber hinaus haben Antikörper und SiRNAs gemacht mit Menschen reagieren konsequent mit Schwein7cross-reacted. Nach Verwundung, Hornhaut geschnitten aus der ganzen Welt mit dem Limbus intakt und montiert auf einem Agar/Kollagen-Basis. Die Hornhäute sind kultivierte in serumfreien Medien plus stabilisiert Vitamin C um Fibroblasten-Proliferation und ECM Ablagerung20zu simulieren. Weder die Zugabe von Serum Wachstumsfaktoren sind erforderlich, um Myofibroblast Bildung7induzieren. Hornhäute sind routinemäßig fixiert und nach zwei Wochen der Kultur für Histologie verarbeitet. Für gen-Knockdown, oder testen Sie die Auswirkungen eines Agenten auf die Wundheilung die Wunde mit SiRNA in der Wunde nach Verwundung7 behandelt werden kann oder ein löslicher Agent kann zu den Medien, bzw.8hinzugefügt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes with lids attached&#160;</td>
			<td>Pel-freeze, Arkansas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm trephine&#160;</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K28014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade&#160;</td>
			<td>Personna</td>
			<td>0.009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>895110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08953-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes&#160;</td>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; 34120</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add all of the following components to DMEM/F-12:&#160; ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Vitamins Solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7256</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Use at 1 &#181;g/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% L-glutamine solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Sodium pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td>1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.&#160; Use from freezer each time media is made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABAM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7292</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>070-0483</td>
			<td>2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Iodine&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Cassettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>We use 3% NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Clear&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>314-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Ultra Pure</td>
			<td>200CSGP</td>
			<td>200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP327</td>
			<td>10mM, pH 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>M10742500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing agent&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>220-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Kit&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bermis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNAprotect Cell Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;76104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6140</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547 or C6198 (cy3 conjugated)</td>
			<td>1:200 Diluted in 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permafluor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62-6520</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA1-85999</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3&#160;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-165-146</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Zeiss Axioplan2&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOT-2</td>
			<td colspan="2">Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies

Die Hornhaut ist beträchtlich als Modellsystem benutzt worden, um die Wundheilung zu studieren. Die Fähigkeit zu generieren und nutzen primäre Säugerzellen in zwei dimensionale (2D) und drei dimensionale (3D)-Kultur hat eine Fülle von Informationen nicht nur über Hornhaut Biologie, sondern auch über Wunde heilen, Myofibroblast Biologie und Narbenbildung im Allgemeinen erzeugt. . Das Ziel des Protokolls ist ein Testsystem zur Quantifizierung der Myofibroblast Entwicklung, die Narbenbildung charakterisiert. Wir zeigen eine Hornhaut Orgel Kultur ex Vivo Modell mit Schwein Augen. In diesem vorderen Keratektomie gewickelt sind Hornhaut noch in der ganzen Welt mit einer kreisrunden Klinge genannt ein Trephine verwundet. Ein Stecker von ca. 1/3 der vorderen Hornhaut wird entfernt, einschließlich das Epithel, die Basalmembran und den vorderen Teil des Stroma. Nach Verwundung, sind Hornhaut geschnitten aus der ganzen Welt, montiert auf einem Sockel von Kollagen/Agar und für zwei Wochen im freien Medium ergänzt-Serum mit stabilisiertem Vitamin C, Zellproliferation und extrazelluläre Matrix Sekret vermehren von resident Fibroblasten kultiviert. Aktivierung des Myofibroblasts in der vorderen Stroma ist offensichtlich in der vernarbte Hornhaut. Dieses Modell lässt sich Wundverschluss, die Entwicklung von Myofibroblasts und fibrotische Marker und toxikologischen Untersuchungen zu bestimmen. Darüber hinaus können die Auswirkungen von kleinen Molekül-Inhibitoren sowie SiRNA Lipid-vermittelte Transfektion für gen-Knockdown in diesem System getestet werden.

Immunohistochemistry ist die primäre Assay genutzt, analysieren Sie den Erfolg der Ex Vivo verwunden heilende Experiment. Abbildung 4 zeigt die Epithel und vorderen Stroma in Kontrollgewebe (Abbildung 4A, 4 b). Sechs Stunden nach der Verletzung, war das Epithel abwesend (Abbildung 4, 4-D). Sechs Tage nach der Verwundung, wie erwartet, hatte das Epithel (<strong clas...

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Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

In diesem Artikel wurde eine einfache Methode beschrieben, um die Wundung in einem dreidimensionalen, multizellulären Organkulturmodellsystem zu bewerten. Wir tun dies mit Schweineaugen, aber auch wenn Sie nicht mit Augen vertraut sind, können Sie diesen Test tun. Als Überblick erhielten wir Schweineaugen, schnitten die Kugeln aus, machen eine kreisförmige Wunde in der Hornhaut, die durch das Epithel und etwa ein Drittel des Stromas geht.Wir schneiden die Hornhaut aus, montieren sie auf einer Agar-Basis und legen dieses Konstrukt in den Brutkasten. Das Gewebe füllt sich in der Bildung einer Narbe in der Hornhaut. Sie müssen keine Wachstumsfaktoren oder sogar Serum hinzufügen.Dies geschieht in serumfreien Medien. Obwohl dies in der Hornhaut durchgeführt wird, kann es als Modellsystem für die fibrotische Heilung im Allgemeinen verwendet werden. Wie viele der zellulären Wege, die während der Narbenbildung aktiviert werden, sind ähnlich zwischen den Systemen.Verwenden Sie in einer Biosicherheitshaube eine chirurgische Klinge mit gerader Kante, um den Globus auf einem mit Ethanol gereinigten Schneidebrett vom Deckel zu entfernen und das überschüssige Fettgewebe von jedem Auge zu entfernen. Halten Sie die gereinigte Kugel hinter enderhand mit Zangen sofort tauchen Sie das Auge in PBS gefolgt von drei schnellen Dips in 10%Jod, und zwei schnelle Dips in PBS. Dann wickeln Sie das Auge umlaufend mit einem sauberen Laborgewebe, um mit genügend Druck zu wickeln, um eine straffe Hornhautoberfläche zu erreichen, ohne die Hornhaut zu kontaktieren.Mit einem sechs Millimeter Trephin, durchdringen Sie das Epithel in der vorderen Stroma in der Mitte der Hornhaut, ohne eine volle Dicke durch die gesamte Hornhaut gewickelt, und drehen Sie das Trephin 180 Grad im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn fünfmal, während Sie leichten Druck anwenden, um die Wunde zu vertiefen. Wenn die Wunde tief genug ist, um eine Gewebeklappe mit Zangen zu heben, verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um die Klappe parallel zum Globus zu schneiden, während Sie die vordere Hornhaut innerhalb des Wundrandes weiter heben. Wenn die gesamte Klappe entfernt wurde, sollte eine kreisförmige Wunde in der Mitte der Hornhaut gefunden werden.Um die Hornhaut zu ernten, greifen Sie das Auge mit dem Laborgewebe, und verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einen kleinen Schnitt einen Millimeter vom Rand der Hornhaut entfernt zu machen, um den Limbus und die Gewebesammlung einzuschließen. Mit einer kleinen, scharfen Schere setzt der Schnitt um den Globus fort und hält einen Millimeter Abstand über die Hornhaut, um den Limbus im Takt zu halten. Dann legen Sie die Hornhaut, Wundseite nach unten, in eine 60-Millimeter-Oder 100-Millimeter-Schale mit einem Milliliter PBS.Um die Hornhaut zu montieren, verwenden Sie zwei Paar Zangen, um die Hornhaut epithel-Seite nach oben zu halten, um eine Tasse zu erstellen, und verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um erwärmte Agar-Lösung in die Hornhaut hinzuzufügen, bis die Tasse voll ist. Nachdem der Agar aushärtet, die Hornhaut vorsichtig in eine neue 60-Millimeter-Platte agar-Seite nach unten legen und die Platte mit einem Deckel bedecken. Dann fügen Sie vier Milliliter von ergänzten serumfreien Medium zu jeder Platte von Hornhäuten Ahorn pflege die Hornhäuten an einer luft-flüssigen Schnittstelle an der limbalen Grenze in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5%Kohlendioxid, und benetzen die Hornhautoberflächen einmal täglich mit einem Tropfen ergänzten Serum-freien Mediumaus dem konditionierten Medium in der Schale, um das Gewebe hydratisiert zu halten.Mischen Sie für den Genknockdown fünf Mikroliter kleiner Interferenz oder siRNa mit 50 Mikroliter reduziertem Serum minimum essential medium und zwei Mikroliter Transfektionsreagenz. Mit 50 Mikroliter reduziertem Serummedium pro Hornhaut. Nach fünf Minuten die beiden Mischungen vermischen und 200 Mikroliter reduziertes Serum-Mindestmedium zu jeder siRNA-Mischung hinzufügen.Dann Pipette die siRNA-Lösungen fallen klug auf jede Wunde. Dann die Hornhäuten in den Brutkasten geben. Nach drei Stunden verwenden Sie das Medium in jeder Schale, um die siRNA von den Hornhautoberflächen zu waschen, und ersetzen Sie das konditionierte Medium in jeder Schale durch frisch ergänztes Serumfreies Medium plus Antibiotika.Dann kehren Sie die Hornhautkulturen in den Zellkultur-Inkubator zurück und brüten für zwei Wochen. Sechs Stunden nach der Verwundung fehlt das Hornhautepithel. Sechs Tage nach der Verwundung wächst das Epithel wieder.Fluoreszenz-Aminofärbung mit alpha glatter Muskelaktivität zeigt einen Gradienten aktiver Myofibroblasten entlang des Wundrandes vom vorderen zum hinteren Stroma. Immun-histochemische Färbung für Alpha glatte Muskel Aktin zeigt eine dramatische Zunahme der Alpha glatten Muskel Aktin Protein Expression in verwundetplus Kontrolle siRNA Hornhäasen. Im Vergleich zu unverwundeten und Zielprotein siRNA behandelt, verwundete Hornhäuten.In ähnlicher Weise ist Fibronectin Extra-Domäne A in siRNA behandelt enfegen Hornhäuten im Vergleich zu unverwundeten und Zielprotein siRNA behandelt verwundeten Hornhäuten. Nachweis eines erfolgreichen Abschlags des Zielproteins. Darüber hinaus verhindert die Behandlung der verwundeten Hornhäute mit dem Toxin, das nicht spezifisch auf das Zielprotein abzielt, eine Reepithelisierung und führt zu qualitativem Zelltod, einer unorganisierten Matrix und stromalen Vakuolen, die darauf hindeuten, dass das Toxin die Heilung bei der Konzentrationstest nicht fördert.Abschließend, beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Klinge parallel zum Gewebe zu halten, während schneiden, so dass es nicht den Globus durchdringt. Mit diesem Test können verschiedene Wundtechniken eingesetzt werden, einschließlich chemischer Verbrennung oder Epithelkratzen. Es kann auch für Arzneimitteltoxizität Assays verwendet werden, um festzustellen, ob das Epithel heilt und mit welcher Geschwindigkeit.Dies ist ein Kosteneinsparungen ex vivo, Organkulturmodellsystem, das Ihren in vivo Wundheilungsstudien vorausgehen kann.

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