Name: ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies at JoVE.com

यह काम NIH द्वारा समर्थित किया गया था-नेि R01 EY024942, अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान, राज्य चिकित्सा विश्वविद्यालय अप्रतिबंधित अनुसंधान कोष, और लायंस जिला 20-Y. सूक्ष्म और आयल वर्गों के छवि विश्लेषण माइक्रोस्कोपी कोर पर प्रदर्शन किया गया और माउंट सिनाई स्थित Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन में ऊतकवैज्ञानिक स्लाइड तैयारी का प्रदर्शन किया गया ।

1. अंग संस्कृति
<ol><li>
तैयारी
	<ol>
<li>आगर समाधान निम्नानुसार तैयार करें. एक छोटी सी कुप्पी में, 1% आगर और 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय कोलेजन DMEM में तैयार-20 मिलीलीटर तक F12 । एक गर्म थाली पर उबाल लाने के लिए । घोल को...

इस प्रोटोकॉल एक प्राकृतिक स्तरीकृत 3 डी वातावरण में घाव भरने के अध्ययन के लिए एक मॉडल का वर्णन । कोशिका संस्कृति और vivo में अध्ययन के बीच एक मध्यवर्ती के रूप में अंग संस्कृति का उपयोग काफी लागत कम कर देता ?...

चोट, आघात, या संक्रमण से उत्पंन कॉर्निया में scarring दुर्बल opacities और स्थाई दृष्टि हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, वहां एक महत्वपूर्ण रास्ते कि चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए लक्षित किया जा सकता है की पहचान की जरूरत है । वर्तमान उपचार के विकल्प सीमित है और मुख्य रूप से corneal प्रत्यारोपण, जो दुनिया भर में रोगियों के लिए सुलभ नहीं है के शामिल हैं । दोनों मानव (चित्रा 1) और पशु कॉर्निया 2d और 3 डी सेल संस्कृति अध्ययन1,2के लिए उपयोग किया जा सकता है । मानव शव कॉर्निया प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं नेत्र बैंकों या केंद्रीकृत ऊतक बैंकों (राष्ट्रीय रोग अनुसंधान इंटरचेंज (NDRI)) से प्राप्त किया जा सकता है, और पशु आंखें एक वधशाला से प्राप्त किया जा सकता है । प्राथमिक corneal उपकला कोशिकाओं, stromal fibroblasts, और अधिक हाल ही में, endothelial कोशिकाओं, अलग किया जा सकता है और घाव भरने के लिए इन ऊतकों से संस्कृति और विषविज्ञान अध्ययन3,4,5. अंधा नेत्र रोग के आणविक आधार को समझने के महत्व के अलावा, ऊतक की पहुँच और संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं के लिए क्षमता कॉर्निया अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली बना दिया है । कॉर्निया सामांय कॉर्निया के रूप में scarring पर एजेंटों के प्रभाव के परीक्षण के लिए आदर्श है पारदर्शी और घाव के कुछ प्रकार के opacities या fibrotic निशान बनाने के (6में समीक्षा की) । vivo corneal घाव हीलिंग मॉडल में कई भी बड़े पैमाने पर किया गया है scarring अध्ययन के लिए उपयोग1। कम उपयोग किया गया है पूर्व vivo corneal घाव हीलिंग 7 मॉडल,8 कि यहां विस्तार से वर्णन है । इस विधि के लक्ष्य को scarring एक 3d कोशिकीय corneal पूर्व vivo मॉडल प्रणाली में fibrotic निर्माताओं द्वारा विशेषता परिणामों को बढ़ाता है ।
Corneal उपकला घाव है कि उपकला तहखाने झिल्ली का उल्लंघन नहीं करता है सामान्य रूप से 24-72 ज9के भीतर बंद हो जाता है. जल्द ही घायल होने के बाद, उपकला के किनारे पर कोशिकाओं के प्रसार और उपकला मुक्त सतह में पलायन शुरू, उपकला बाधा समारोह को पुनर्स्थापित करने के लिए. यह गतिविधि क्रमिक रूप से corneal बेसल कोशिका प्रसार के सक्रियकरण के बाद पहले और, एक बाद की अवस्था में, बाहरी अंग क्षेत्र पर स्थित अग्रदूत कोशिकाओं के उपकला कोशिका द्रव्यमान10,11की वसूली प्राप्त करने के लिए. इन घावों अक्सर scarring बिना चंगा । हालांकि, एक घाव है कि स्ट्रोमा में तहखाने झिल्ली प्रवेश निशान गठन में अक्सर परिणाम1। corneal stromal घाव भरने के बाद, स्ट्रोमा अंतर निवासी stromal कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अस्थि मज्जा-व्युत्पंन fibrocytes12,13,14सहित कई मूल की कोशिकाओं के साथ आबाद है । Fibrotic scarring एक चिकित्सा घाव में myofibroblasts के हठ की विशेषता है । इन रोग myofibroblasts फोकल आसंजन में integrins के संचय के माध्यम से वृद्धि हुई आसंजन का प्रदर्शन, सिकुड़ा α-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA) तनाव फाइबर, और extracellular मैट्रिक्स (ECM) के स्थानीय सक्रियण-तनहा अव्यक्त-रूपांतरित वृद्धि कारक-बीटा (TGFβ) । उपकला-व्युत्पन्न कोशिकाओं के भेदभाव, उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT) के रूप में जाना जाता है, भी निशान गठन6करने के लिए योगदान कर सकते हैं.
घाव भरने के बाद कोशिका विभेद और apoptosis के बीच एक नाजुक संतुलन होता है । क्योंकि तहखाने झिल्ली में उल्लंघन, प्लेटलेट के रूप में वृद्धि कारक वृद्धि कारक (PDGF) और आंसू से TGFβ और उपकला स्नान स्ट्रोमा, उत्प्रेरण myofibroblast भेदभाव, autocrine सक्रियण के एक निरंतर TGFβ पाश, और के रूप में असंगठित fibrotic ECM का स्राव१५,१६. चंगा घाव में myofibroblasts के हठ धुंध और कॉर्निया में scarring को बढ़ावा देता है (चित्रा 2) । हालांकि, regenerativeी चंगा घाव में हालांकि myofibroblasts का विकास, वे apoptose और इस तरह अनुपस्थित रहे है या काफी चंगा ऊतक में संख्या में कमी (संदर्भ 6 में समीक्षा की,10) । इस प्रकार, fibrotic scarring पर अनुसंधान के अणुओं है कि अत्यधिक myofibroblast विकास या myofibroblast हठ17,18को रोकने को लक्षित करने पर कम भाग में ध्यान केंद्रित किया है । क्योंकि myofibroblast हठ दोनों scarring और सभी ऊतकों में fibrotic रोग की विशेषता19, कॉर्निया एक मॉडल प्रणाली फाइब्रोसिस के जनरल सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए के रूप में उपयोगी हो सकता है ।
हमारे मॉडल प्रणाली में, कॉर्निया एक बेलनाकार एक trephine कहा जाता है जबकि अभी भी दुनिया में ब्लेड के साथ घायल हो गया है । मानव और सुअर कॉर्निया या तो एक 6 या 7 मिमी trephine के साथ घायल हो सकते हैं; खरगोश कॉर्निया के लिए एक 6 मिमी trephine पसंद है । सुअर कॉर्निया आकार में मानव कॉर्निया के समान है । क्योंकि वे लागत प्रभावी और आसानी से बड़ी संख्या में उपलब्ध हैं, सुअर कॉर्निया नियमित रूप से अंग संस्कृति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इसके अलावा, एंटीबॉडी और मानव के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए बनाया siRNAs लगातार पार-7सुअर के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है । घाव भरने के बाद, कॉर्निया दुनिया से बरकरार limbus के साथ कटौती कर रहे है और एक आगर पर घुड़सवार/ कॉर्निया सीरम में संस्कृति मुक्त मीडिया के अलावा विटामिन सी स्थिर fibroblast प्रसार और ECM20जमाव अनुकरण कर रहे हैं । न तो सीरम और न ही विकास कारकों के अलावा myofibroblast गठन7प्रेरित करने की जरूरत है । कॉर्निया नियमित रूप से तय कर रहे है और संस्कृति के दो सप्ताह के बाद प्रोटोकॉल के लिए कार्रवाई की । जीन पछाड़ना के लिए, या घाव भरने पर एक एजेंट के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, घाव7 या एक घुलनशील एजेंट को मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है, क्रमशः8घाव के बाद घाव में सिरना के साथ इलाज किया जा सकता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes with lids attached&#160;</td>
			<td>Pel-freeze, Arkansas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm trephine&#160;</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K28014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade&#160;</td>
			<td>Personna</td>
			<td>0.009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>895110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08953-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes&#160;</td>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; 34120</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add all of the following components to DMEM/F-12:&#160; ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Vitamins Solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7256</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Use at 1 &#181;g/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% L-glutamine solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Sodium pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td>1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.&#160; Use from freezer each time media is made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABAM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7292</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>070-0483</td>
			<td>2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Iodine&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Cassettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>We use 3% NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Clear&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>314-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Ultra Pure</td>
			<td>200CSGP</td>
			<td>200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP327</td>
			<td>10mM, pH 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>M10742500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing agent&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>220-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Kit&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bermis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNAprotect Cell Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;76104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6140</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547 or C6198 (cy3 conjugated)</td>
			<td>1:200 Diluted in 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permafluor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62-6520</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA1-85999</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3&#160;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-165-146</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Zeiss Axioplan2&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOT-2</td>
			<td colspan="2">Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies

कॉर्निया एक मॉडल प्रणाली के रूप में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है घाव भरने का अध्ययन । उत्पंन करने के लिए और दो आयामी (2d) और तीन आयामी (3 डी) संस्कृति में प्राथमिक स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग करने की क्षमता न केवल corneal जीव विज्ञान के बारे में, लेकिन यह भी घाव भरने, myofibroblast जीव विज्ञान के बारे में जानकारी का खजाना उत्पंन किया है, और सामांय में scarring . प्रोटोकॉल का लक्ष्य myofibroblast विकास को बढ़ाता है, जो scarring की विशेषता के लिए एक परख प्रणाली है । हम एक corneal अंग संस्कृति पूर्व वीवो मॉडल सुअर आंखों का उपयोग कर प्रदर्शित करता है । इस पूर्वकाल keratectomy घाव में, अभी भी दुनिया में कॉर्निया एक परिपत्र ब्लेड के साथ घायल हो जाता है एक trephine बुलाया । पूर्वकाल कॉर्निया के लगभग 1/3 के एक प्लग उपकला सहित हटा दिया जाता है, तहखाने झिल्ली, और स्ट्रोमा के पूर्वकाल हिस्सा. घायल होने के बाद, कॉर्निया दुनिया से काट रहे हैं, एक कोलेजन पर घुड़सवार/आधार, और दो सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत के साथ पूरक-सीरम मुक्त मध्यम स्थिर विटामिन सी के साथ सेल प्रसार और extracellular मैट्रिक्स स्राव में वृद्धि करने के लिए निवासी fibroblasts । पूर्वकाल स्ट्रोमा में myofibroblasts के सक्रियण चंगा कॉर्निया में स्पष्ट है । इस मॉडल को घाव बंद परख, myofibroblasts और fibrotic मार्करों के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और विषविज्ञान अध्ययन के लिए । इसके अलावा, छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव के साथ ही जीन पछाड़ना के लिए लिपिड मध्यस्थता सिरना अभिकर्मक इस प्रणाली में परीक्षण किया जा सकता है ।

Immunohistochemistry प्राथमिक के लिए पूर्व vivo घाव हीलिंग प्रयोग की सफलता का विश्लेषण परख का उपयोग किया है । चित्रा 4 उपकला और नियंत्रण ऊतक में पूर्वकाल स्ट्रोमा को दर्शाया गया है (चित्...

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Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

एक पूर्व vivo corneal अंग संस्कृति मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल घाव भरने के अध्ययन के लिए उपयोगी बताया गया है । इस मॉडल प्रणाली एक संगठित 3 डी कोशिकीय वातावरण में अपक्षयी चिकित्सा या दवा विषाक्तता को बढ़ावा देने के लिए एजेंटों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

पूर्व Vivo Corneal अंग संस्कृति मॉडल के लिए घाव भरने की पढ़ाई

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

इस कागज एक त्रि-आयामी, बहु-सेलुलर अंग संस्कृति मॉडल प्रणाली में घायल परखने के लिए एक सरल विधि का वर्णन किया । हम सुअर आंखों का उपयोग करके ऐसा करते हैं, लेकिन भले ही आप आंखों से परिचित नहीं हैं, तो आप इस परख कर सकते हैं। एक अवलोकन के रूप में, हमें पोर्सिन आंखें मिलीं, ग्लोब को काट दिया गया, कॉर्निया में एक गोलाकार घाव बनाया गया जो एपिथेलियम और स्ट्रोमा के लगभग एक तिहाई से गुजरता है।हम कॉर्निया को काटते हैं, और इसे एगर बेस पर माउंट करते हैं, और इस निर्माण को इनक्यूबेटर में डालते हैं। ऊतक कॉर्निया में एक निशान बनाने में भर जाएगा। आपको किसी भी विकास कारक, या यहां तक कि सीरम जोड़ने की आवश्यकता नहीं है।यह सीरम मुक्त मीडिया में किया जाता है। हालांकि यह कॉर्निया में किया जाता है, यह सामान्य रूप से फाइब्रोटिक उपचार के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। जख्म के दौरान सक्रिय होने वाले कई सेलुलर रास्ते सिस्टम के बीच समान होते हैं।एक जैवसेफ्टी हुड में, एक इथेनॉल-साफ चॉपिंग बोर्ड पर ढक्कन से ग्लोब को हटाने के लिए सीधे किनारे सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करें, और प्रत्येक आंख से अतिरिक्त फैटी ऊतक को हटा दें। संदंश के साथ साफ ग्लोब को पीछे से पकड़े हुए तुरंत पीबीएस में आंख को डुबकी 10% आयोडीन में तीन त्वरित डुबकी, और पीबीएस में दो त्वरित डुबकी। फिर कॉर्निया से संपर्क किए बिना एक तना हुआ कॉर्नियल सतह को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त दबाव के साथ लपेटने के लिए एक साफ प्रयोगशाला ऊतक के साथ आंख को परिस्थितिजन्य रूप से लपेटें।छह मिलीमीटर ट्रेफिन का उपयोग करके, पूरे कॉर्निया के माध्यम से पूर्ण मोटाई घाव किए बिना कॉर्निया के केंद्र में पूर्वकाल स्ट्रोमा में एपिथेलियम में प्रवेश करें, और घाव को गहरा करने के लिए प्रकाश दबाव लागू करते हुए ट्रेफिन 180 डिग्री दक्षिणावर्त और पांच बार घूमता है। जब घाव काफी गहरा है एक ऊतक फ्लैप संदंश के साथ उठाया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए, एक शल्य ब्लेड का उपयोग करने के लिए दुनिया के समानांतर फ्लैप में कटौती करते हुए घाव मार्जिन के भीतर पूर्वकाल कॉर्निया उठाने के लिए जारी है । जब पूरे फ्लैप को हटा दिया गया है, तो कॉर्निया के केंद्र में एक गोलाकार घाव स्थित होना चाहिए।कॉर्निया को प्रयोगशाला ऊतक के साथ आंख को समझने के लिए फसल करने के लिए, और लिम्बस और ऊतक संग्रह को शामिल करने के लिए कॉर्निया के किनारे से एक मिलीमीटर दूर एक छोटा चीरा बनाने के लिए एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करें। छोटे, तेज कैंची का उपयोग करना दुनिया भर में चीरा जारी रखने के लिए कॉर्निया भर में एक मिलीमीटर मार्जिन रखने के लिए चालबाजी में limbus रखने के लिए । फिर कॉर्निया, घाव-साइड नीचे, 60 मिलीमीटर या 100 मिलीमीटर डिश में रखें जिसमें पीबीएस का एक मिलीलीटर होता है।कॉर्निया को माउंट करने के लिए, एक कप बनाने के लिए कॉर्निया एपिथेलियल-साइड को पकड़ने के लिए दो जोड़े संदंश का उपयोग करें, और कप पूरा होने तक कॉर्निया में गर्म एगर समाधान जोड़ने के लिए बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। एगर के कठोर होने के बाद, कॉर्निया को एक नई 60 मिलीमीटर प्लेट आगर-साइड में नीचे रखें और प्लेट को ढक्कन से ढक दें। फिर कॉर्निया की प्रत्येक प्लेट में पूरक सीरम-मुक्त माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें जो 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में लिम्बल सीमा पर एक एयर-लिक्विड इंटरफेस पर कॉर्निया को बनाए रखते हैं, और एक बार कॉर्निया सतहों को गीला करते हैं, जो ऊतकों को हाइड्रेटेड रखने के लिए डिश में कंडीशन माध्यम से पूरक सीरम-मुक्त माध्यम की एक बूंद के साथ दैनिक होता है।जीन नॉकडाउन के लिए, छोटे हस्तक्षेप या सीआरएन के पांच माइक्रोलीटर को कम सीरम न्यूनतम आवश्यक माध्यम के 50 माइक्रोलीटर और ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के दो माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। प्रति कॉर्निया कम सीरम माध्यम के 50 माइक्रोलीटर के साथ। पांच मिनट के बाद, दोनों मिश्रणों को एक साथ मिलाएं, और प्रत्येक सिर्ना मिश्रण में कम सीरम न्यूनतम माध्यम के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर सिरना समाधान प्रत्येक घाव पर बुद्धिमान ड्रॉप पिपेट करें। इसके बाद कॉर्निया को इनक्यूबेटर में डाल दें। तीन घंटे के बाद, कॉर्नियल सतहों से सिरना धोने के लिए प्रत्येक डिश में माध्यम का उपयोग करें, और ताजा पूरक सीरम मुक्त मध्यम प्लस एंटीबायोटिक दवाओं के साथ प्रत्येक पकवान में वातानुकूलित माध्यम की जगह ।फिर कॉर्नियल संस्कृतियों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें, और दो सप्ताह के लिए इनक्यूबेट करें। घायल होने के छह घंटे बाद कॉर्नियल एपिथेलियम अनुपस्थित रहता है। घायल होने के छह दिन बाद, एपिथेलियम पुनर्विकास करता है।फ्लूरेसेंस अमीनो अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन के साथ धुंधला पूर्वकाल से पीछे स्ट्रोमा के लिए घाव मार्जिन के साथ सक्रिय myofibroblasts के एक ढाल से पता चलता है । अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन के लिए इम्यूनो-हिस्टोकेमिकल धुंधला घायल प्लस नियंत्रण सिराना कॉर्निया में अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक नाटकीय वृद्धि का पता चलता है । बिना घाव और लक्ष्य प्रोटीन सिरना इलाज, घायल कॉर्निया की तुलना में ।इसी तरह, फाइब्रोनेक्टिन अतिरिक्त डोमेन ए को घायल कॉर्निया के इलाज और लक्षित प्रोटीन सिरना उपचारित घायल कॉर्निया की तुलना में सिरना उपचारित घायल कॉर्निया में अपवाइन किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन के एक सफल दस्तक नीचे का प्रदर्शन । इसके अलावा, विष के साथ घायल कॉर्निया का उपचार जो गैर-विशिष्ट रूप से लक्ष्य प्रोटीन को लक्षित करता है, फिर से एपिथेलाइजेशन को रोकता है और गुणात्मक कोशिका मृत्यु, एक अव्यवस्थित मैट्रिक्स, और स्ट्रोमल वैक्यूल्स में परिणाम देता है कि विष एकाग्रता पर उपचार को बढ़ावा नहीं देता है।अंत में, इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय काटने के दौरान ब्लेड को ऊतक के समानांतर रखना याद रखना महत्वपूर्ण है, ताकि यह दुनिया में प्रवेश न करे। इस परख के साथ विभिन्न घायल तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है, जिसमें रासायनिक जला या एपिथेलियल परिमार्जन शामिल हैं। यह भी दवा विषाक्तता परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए अगर एपिथेलियम भर देता है और किस दर पर ।यह एक लागत बचत पूर्व वीवो, अंग संस्कृति मॉडल प्रणाली है जो आपके वीवो घाव उपचार अध्ययनों में आपके सामने आ सकती है।

Research

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Medicine

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Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

खरोंच प्रवास परख और डोर्सल स्किनफ़ोल्ड चैंबर इन विट्रो के लिए और घाव हीलिंग के Vivo विश्लेषण में

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

एक Porcin Corneal Endothelial अंग संस्कृति मॉडल विभाजन Corneal बटन का उपयोग

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

पूर्व वीवो लैंगेंडोर्फ-पर्फ्यूज ्डहार्ट्स के ऑप्टोकार्डियोग्राफी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी स्टडीज

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

कॉर्नियल घाव हीलिंग का अध्ययन करने के लिए एक उपकला घर्षण मॉडल

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...