Name: ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00
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Questo lavoro è stato supportato da NIH-nia R01 EY024942, ricerca per prevenire la cecità, Upstate Medical University senza restrizione ricerca fondi, e distretto Lions 20-Y. microscopia e analisi delle immagini di sezioni della paraffina sono state eseguite presso il nucleo di microscopia e preparazione del vetrino istologico è stata eseguita la Biorepository e CORE di patologia presso la scuola di medicina di Icahn al Mount Sinai.

1. organo cultura
<ol><li>
Preparazioni
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di agar come segue. In un piccolo pallone, preparare 1% agar e il collagene bovino 1 mg/mL in DMEM-F12 fino a 20 mL. Portare ad ebollizione su un piatto caldo. Mettere la soluzione in una provetta conica da 50 mL. Posizionare il tubo in un bagno di acqua su una piastra calda per mantenere la soluzione da solidificarsi.</li>
		<li>Preparare i supporti senza siero completati (SSFM) secondo la composizione fornito in Tabella ...

Questo protocollo descrive un modello di studio della guarigione della ferita in un ambiente naturale di 3D stratificato. Uso della cultura di organo come intermedio tra coltura cellulare e gli studi in vivo riduce significativamente i costi, nonché riducendo le procedure sugli animali vivi. Altri modelli 3D sono stati di grande beneficio per il campo tra cui self-sintetizzazione gel di collagene in fibroblasti corneali umano primario2 o queste stesse cellule incorporati in gel fatto da collageni...

Cicatrici nella cornea derivanti da lesioni, traumi o infezione può portare a debilitante opacità e perdita permanente della vista. Così, c'è una necessità critica di individuare percorsi che possono essere oggetto di intervento terapeutico. Opzioni correnti di trattamento sono limitate e sono costituiti principalmente di trapianti corneali, che non sono accessibili ai pazienti in tutto il mondo. Sia umani (Figura 1) e cornee animale possono essere utilizzate per il 2D e coltura cellulare 3D studi1,2. Non adatto per il trapianto di cornee cadavere umano possono essere ottenute da banche degli occhi o le banche di tessuti centralizzata (nazionale malattia ricerca Interchange (NDRI)), e gli occhi degli animali possono essere ottenuti da un mattatoio. Primarie di cellule epiteliali corneale e più recentemente, le cellule endoteliali, fibroblasti stromal può essere isolato e coltivato da questi tessuti per la guarigione della ferita e tossicologia studi3,4,5. Oltre all'importanza di comprendere le basi molecolari di malattia dell'occhio di accecante, l'accessibilità del tessuto e la capacità di cellule primarie di cultura ha reso la cornea un importante sistema modello per lo studio. La cornea è ideale per testare gli effetti di agenti su cicatrici come la cornea normale è trasparente e certi tipi di ferite creano opacità o cicatrici fibrotiche (rivisto in6). Diversi in vivo della ferita corneale guarigione modelli inoltre sono stati utilizzati estesamente per cicatrici studi1. Meno utilizzati è stato l'ex vivo cornea ferita guarigione modello7,8 che è descrivere in dettaglio qui. L'obiettivo di questo metodo è quello di quantificare i risultati sfregio caratterizzati dai creatori fibrotiche in un 3D multicellulari corneale ex vivo modello di sistema.
Ferendo epiteliale corneale che non violano la membrana basale epiteliale normalmente si chiude entro 24-72 h9. Presto dopo la ferita, le cellule al bordo dell'epitelio iniziare la diffusione e la migrazione in superficie epiteliale libera, per ristabilire la funzione di barriera epiteliale. Questa attività in sequenza è seguita dall'attivazione di proliferazione delle cellule basali corneale prima e, in una fase successiva, di cellule precursori situato presso la zona limbal esterna per ottenere il recupero di cellule epiteliali massa10,11. Queste ferite spesso guariscono senza lasciare cicatrici. Tuttavia, una ferita che penetra la membrana dello scantinato dello stroma spesso comporta cicatrice formazione1. Dopo la ferita corneale stromale, lo stroma è popolato con cellule di origini multiple tra cui differenziate cellule stromale residenti così come derivate da midollo osseo fibrociti12,13,14. Cicatrici fibrotiche è caratterizzata dalla persistenza di myofibroblasts in una guarigione della ferita. Questi myofibroblasts patologico dimostrare adesione aumentata attraverso l'accumulo delle integrine nell'adesioni focali, fibre contrattili α-liscia del muscolo actina (α-SMA) stress e attivazione locale della matrice extracellulare (ECM)-sequestrato trasformazione di latente crescita fattore-beta (TGFβ). La differenziazione delle cellule epiteliali derivate, noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), può anche contribuire per cicatrice formazione6.
C'è un delicato equilibrio tra differenziazione cellulare e l'apoptosi dopo la ferita. A causa della violazione nella membrana dello scantinato, fattori di crescita come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e TGFβ da lacrime e l'epitelio si bagnano lo stroma, inducendo la differenziazione dei miofibroblasti, un loop autocrino sostenuta di attivazione del TGFβ e la secrezione di disorganizzato fibrotica ECM15,16. La persistenza dei miofibroblasti nella ferita guarita promuove haze e cicatrici nella cornea (Figura 2). Tuttavia, in regeneratively guarito ferita anche se sviluppano miofibroblasti, essi apoptose e così sono assenti o significativamente ridotto in numero nel tessuto guarito (rivisto in riferimento6,10). Così, ricerca su cicatrici fibrotiche si è concentrata, almeno in parte sul targeting molecole che impediscono lo sviluppo eccessivo dei miofibroblasti o myofibroblast persistenza17,18. Perché myofibroblast persistenza caratterizza la malattia sia sfregio e fibrotica in tutti tessuti19, la cornea può essere utile come sistema modello per lo studio dei meccanismi cellulari generali di fibrosi.
Nel nostro sistema di modello, la cornea è ferita con una lama cilindrica chiamata un trephine mentre ancora nel globo. Umano e cornee di maiale possono essere ferite con entrambi un trephine 6 o 7 mm; per le cornee coniglio un trephine 6mm è preferito. La cornea di maiale è simile a quello della cornea umana. Perché essi sono efficaci e prontamente disponibili in gran numero, cornee di maiale sono abitualmente utilizzate per la coltura di organo. Inoltre, gli anticorpi e siRNA fatti reagire con umani hanno costantemente traversa-ha reagito con maiale7. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo con il limbus intatte e montato su un base di agar/collagene. Le cornee sono coltivate in terreni privi di siero più stabilizzata di vitamina C per simulare la proliferazione dei fibroblasti e la deposizione di ECM20. L'aggiunta di siero né fattori di crescita sono necessari per indurre myofibroblast formazione7. Le cornee sono ordinariamente fissa e trattate per istologia dopo due settimane di cultura. Per atterramento di gene, o per testare gli effetti di un agente sulla guarigione delle ferite, la ferita può essere trattata con siRNA nella ferita dopo che7 o un agente di purificazione può essere aggiunto ai media, rispettivamente8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes with lids attached&#160;</td>
			<td>Pel-freeze, Arkansas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm trephine&#160;</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K28014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade&#160;</td>
			<td>Personna</td>
			<td>0.009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>895110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08953-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes&#160;</td>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; 34120</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add all of the following components to DMEM/F-12:&#160; ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Vitamins Solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7256</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Use at 1 &#181;g/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% L-glutamine solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Sodium pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td>1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.&#160; Use from freezer each time media is made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABAM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7292</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>070-0483</td>
			<td>2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Iodine&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Cassettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>We use 3% NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Clear&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>314-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Ultra Pure</td>
			<td>200CSGP</td>
			<td>200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP327</td>
			<td>10mM, pH 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>M10742500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing agent&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>220-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Kit&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bermis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNAprotect Cell Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;76104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6140</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547 or C6198 (cy3 conjugated)</td>
			<td>1:200 Diluted in 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permafluor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62-6520</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA1-85999</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3&#160;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-165-146</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Zeiss Axioplan2&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOT-2</td>
			<td colspan="2">Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies

La cornea è stata utilizzata ampiamente come sistema modello per studiare la guarigione della ferita. La capacità di generare ed utilizzare le cellule di mammifero primarie in due dimensioni (2D) e tridimensionali (3D) tre cultura ha generato una ricchezza di informazioni non solo sulla biologia della cornea, ma anche sulla ferita guarigione, biologia dei miofibroblasti e cicatrici in generale . L'obiettivo del protocollo è un sistema di test per quantificare lo sviluppo dei miofibroblasti, che caratterizza lo sfregio. Dimostriamo un organo corneale cultura ex vivo modello utilizzando maiale occhi. In questo keratectomy anteriore ferita, cornee ancora nel globo sono ferite con una lama circolare chiamata un trephine. Una spina di circa 1/3 della cornea anteriore viene rimosso compreso l'epitelio, la membrana dello scantinato e la parte anteriore dello stroma. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo, montate su una base di collagene/agar e coltivate per due settimane in mezzo libero siero integrato con vitamina C stabilizzata per aumentare la proliferazione delle cellule e la secrezione extracellulare dai fibroblasti residente. Attivazione dei miofibroblasti nello stroma anteriore è evidente nella cornea guarita. Questo modello può essere utilizzato di saggiare la chiusura della ferita, lo sviluppo di miofibroblasti e fibrotici marcatori e per gli studi di tossicologia. Inoltre, gli effetti di piccole molecole inibitrici, come pure la transfezione di siRNA del lipido-mediata per atterramento di gene possono essere analizzati in questo sistema.

Immunohistochemistry è il test primario utilizzato per analizzare il successo dell'ex vivo ferita guarigione esperimento. Figura 4 raffigura l'epitelio e stroma anteriore in tessuto di controllo (Figura 4A, 4B). Sei ore dopo la ferita, l'epitelio era assente (Figura 4, 4D). Sei giorni dopo la ferita come previsto, l'epitelio aveva ricresciuti (F...

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Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Questo articolo descriveva un metodo semplice per saggiare le ferite in un sistema tridimensionale di coltura di organi multicellulare. Lo facciamo usando gli occhi di maiale, ma anche se non hai familiarità con gli occhi, puoi fare questo saggio. Come panoramica, abbiamo ricevuto occhi suini, tagliato i globi, fatto una ferita circolare nella cornea che passa attraverso l'epitelio e circa un terzo dello stroma.Tagliamo la cornea, la montamo su una base di Agar, e mettiamo questo costrutto nell'incubatrice. Il tessuto riempirà creando una cicatrice nella cornea. Non è necessario aggiungere fattori di crescita, o anche siero.Questo viene fatto su supporti senza siero. Sebbene questo venga eseguito nella cornea, può essere utilizzato come sistema modello per la guarigione fibrotica in generale. Poiché molte delle vie cellulari che vengono attivate durante le cicatrici sono simili tra i sistemi.In un cappuccio di biosicurezza, utilizzare una lama chirurgica a bordo dritto per rimuovere il globo dal coperchio su un tagliere pulito con etanolo e rimuovere il tessuto adiposo in eccesso da ogni occhio. Tenendo il globo pulito posteriormente con le forcep immergere immediatamente l'occhio in PBS seguito da tre tuffo rapido in iodio al 10% e due rapide immersioni in PBS. Quindi avvolgere l'occhio circonferenzialmente con un tessuto da laboratorio pulito per avvolgere con sufficiente pressione per ottenere una superficie corneale tesa senza contattare la cornea.Usando una trefina di sei millimetri, penetrare l'epitelio nello stroma anteriore al centro della cornea senza fare una ferita a pieno spessore attraverso l'intera cornea e ruotare la trefina di 180 gradi in senso orario e antiorario cinque volte mentre si applica la pressione della luce per approfondire la ferita. Quando la ferita è abbastanza profonda da consentire il sollevamento di un lembo tissutale con forcep, utilizzare una lama chirurgica per tagliare il lembo parallelo al globo continuando a sollevare la cornea anteriore entro il margine della ferita. Quando l'intero lembo è stato rimosso, una ferita circolare dovrebbe essere posizionata al centro della cornea.Per raccogliere la cornea afferrare l'occhio con il tessuto da laboratorio e utilizzare una lama chirurgica per fare una piccola incisione a un millimetro di distanza dal bordo della cornea per includere il limbo e la raccolta dei tessuti. Usando piccole forbici affilate continua l'incisione in tutto il mondo mantenendo un margine millimetrico attraverso la cornea per mantenere il limbo in tatto. Quindi posizionare la cornea, lato ferita verso il basso, in un piatto da 60 millimetri o 100 millimetri contenente un millilitro di PBS.Per montare la cornea, utilizzare due paia di forcep per tenere il lato epiteliale cornea verso l'alto per creare una tazza e utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per aggiungere una soluzione di agar riscaldata nella cornea fino a quando la tazza è piena. Dopo che l'agar si indurisce, posizionare con cura la cornea in un nuovo lato agar piastra di 60 millimetri verso il basso e coprire la piastra con un coperchio. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo integrato privo di siero a ogni piatto di cornee mantenendo le cornee in un'interfaccia aria-liquido al bordo limbale in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi celsius in anidride carbonica al 5% e bagnando le superfici corneali una volta al giorno con una goccia di mezzo integrato privo di siero dal mezzo condizionato nel piatto per mantenere i tessuti idratati.Per il knockdown genico, mescolare cinque microlitri di piccolo interferente o siRNa con 50 microlitri di mezzo essenziale minimo siebro ridotto e due microlitri di reagente di trasfezione. Con 50 microlitri di mezzo siero ridotto per cornea. Dopo cinque minuti, mescolare le due miscele e aggiungere 200 microlitri di mezzo minimo siero ridotto a ciascuna miscela di siRNA.Quindi pipettare le soluzioni di siRNA cadere saggiamente su ogni ferita. Quindi metti le cornee nell'incubatrice. Dopo tre ore, utilizzare il mezzo in ogni piatto per lavare il siRNA dalle superfici corneali e sostituire il mezzo condizionato in ogni piatto con mezzo fresco integrato senza siero più antibiotici.Quindi riportare le colture corneali nell'incubatrice di coltura cellulare e incubare per due settimane. Sei ore dopo il mento, l'epitelio corneale è assente. Sei giorni dopo il mento, l'epitelio ricresce.L'ammino macchia di fluorescenza con actina muscolare alfa liscia rivela un gradiente di miofibroblasti attivi lungo il margine della ferita dallo stroma anteriore a quello posteriore. La colorazione immuno-istochimica per l'actina muscolare alfa liscia rivela un drammatico aumento dell'espressione alfa liscia della proteina dell'actina muscolare nei feriti più il controllo delle cornee di siRNA. Rispetto alle cornee ferite trattate con siRNA di proteine non ferite e bersaglio.Allo stesso modo, la fibronectina extra di dominio A è upregolata nelle cornee ferite trattate con siRNA rispetto alle cornee ferite trattate con siRNA non ferite e target. Dimostrando un knock down riuscito della proteina bersaglio. Inoltre, il trattamento delle cornee ferite con la tossina che prende di mira in modo non specifico la proteina bersaglio previene la rielezione e si traduce in morte cellulare qualitativa, una matrice disorganizzata e vacuoli stromali che suggeriscono che la tossina non promuove la guarigione alla concentrazione saggiata.In conclusione, durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di mantenere la lama parallela al tessuto durante il taglio, in modo che non penetri nel globo. Diverse tecniche di wounding possono essere utilizzate con questo saggio, tra cui ustioni chimiche o raschiatura epiteliale. Può anche essere usato per test di tossicità del farmaco per determinare se l'epitelio guarisce e a quale velocità.Questo è un sistema di modelli di coltura di organi ex vivo a risparmio di costi che può precedere i tuoi studi di guarigione delle ferite in vivo.

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