Name: ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00
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この作品は、ネイ NIH R01 EY024942、失明を防ぐため、北部医療大学無制限研究資金に研究によって支えられたおよびパラフィン切片の画像解析およびライオンズ地区 20, 顕微鏡顕微鏡コアで行われた、Biorepository シナイ山で、Icahn 医学部病理コアでの組織学的のスライドの準備を行った。

1. 器官培養
<ol><li>
準備
	<ol>
<li>次に寒天液を準備します。小さなフラスコの準備 1% 寒天および DMEM f12 キーで 1 mg/mL コラーゲン 20 mL。ホット プレートで沸騰させます。50 mL の円錐管に、ソリューションを配置します。ソリューションが凝固するを防ぐためにホット プレート上の水槽に管を配置します。</li>
		<li>材料表は、組成によって補われた血清無料メディア (S...

このプロトコルでは、成層の 3 D 環境の創傷治癒過程を研究するためのモデルについて説明します。コストだけでなく、生きている動物を減らす手順器官培養の細胞培養と生体内での研究の間中間物としての使用を大幅に削減します。他の 3 D モデル自己主ひと角膜線維芽細胞2またはこれらの同じ細胞から作られたコラーゲン ・ ゲルの合成を含むフィールドに大きな恩恵を...

傷害、外傷、または感染症による角膜の瘢痕混濁と永久的な視力喪失を衰弱する可能性があります。従って、治療的介入の対象とすることができます経路を識別するために重要な必要性があります。現在の治療法の選択肢は限定されており、主に角膜移植、世界中で患者へのアクセスが。人間 (図 1) と動物角膜を 2次元のため活用し、3 D 細胞培養研究1,2。アイ ・ バンクや一元的な組織銀行 (国立病研究インターチェンジ (NDRI)) からひと死体角膜移植に適していないを取得でき、動物の目と畜場から入手できます。主な角膜上皮細胞、間質線維芽細胞、さらに最近、血管内皮細胞分離および創傷治癒のためのこれらの組織から培養でき、毒物学研究3,4,5。まばゆいばかりの眼疾患の分子基盤を理解することの重要性、組織および培養細胞機能のアクセシビリティが加え角膜に関する重要なモデル システム。角膜瘢痕通常の角膜は透明で、混濁や線維性瘢痕 (文献6) 傷の特定の種類を作成するようにエージェントの影響をテストに最適です。また、いくつか生体内で角膜創傷治癒モデルは、研究1の瘢痕のため広く用いられています。Ex より利用されている生体角膜創傷治癒のモデル7,8ここで詳細に記述します。このメソッドの目的は 3 D の細胞の線維化のメーカーによって特徴付けられる瘢痕の成果を定量化、ex vivo モデル システム角膜。
通常上皮基底膜を違反しない角膜上皮負傷 24 72 h9内を閉じます。負傷後すぐに端上皮の細胞は、拡散と上皮バリア機能を再確立するため、上皮自由表面に移行を開始します。このアクティビティは、最初と、上皮細胞質量10,11の回復を達成するために外側の輪部のゾーンに位置する前駆細胞の後の段階で順番に角膜基底細胞増殖の活性化が続きます。これらの傷はしばしば傷つかないで直る。しかし、しばしば間質に基底膜を貫通する傷は瘢痕形成1で結果します。角膜実質負傷後骨髄由来線維細胞12,13,14と同様、居住者間質細胞の分化を含む複数の起源の細胞質が表示されます。線維性瘢痕治癒創傷に芽の持続性が特徴です。これらの病理学的芽を示す焦点接着斑、収縮の α-平滑筋アクチン (α SMA) ストレスファイバーと細胞外マトリックス (ECM) の地域活性化におけるインテグリンの蓄積により粘着性が向上-隔離潜熱変換成長因子 β (TGFβ)。間葉転換 (EMT) 上皮として知られている上皮由来細胞の分化も瘢痕形成6に貢献するかもしれない。
負傷した後に細胞の分化とアポトーシスとの間の微妙なバランスがあります。基底膜の違反のための成長因子血小板由来成長因子 (PDGF) と涙から TGFβ と上皮入浴、実質 TGFβ の活性化、持続的な散逸 myofibroblast 分化誘導などとまとまりのない線維性 ECM15,16の分泌。治癒の傷で芽の永続性は、ヘイズと (図 2) 角膜に瘢痕化を促進します。しかしで再生治癒創芽を開発、彼ら apoptose したがって、不在であるまたは (参照6,10レビュー) 治癒組織で大幅に減少番号。したがって、線維性瘢痕に関する研究は、過剰な myofibroblast の開発や myofibroblast の永続性17,18を防ぐ分子をターゲットに少なくとも部分的にきました。Myofibroblast 永続化は、すべて組織19瘢痕および線維症を特徴として、ので角膜は線維化の一般的な細胞メカニズムを研究するモデル システムとして役に立つかもしれません。
モデル体制で世界でトレフィンと呼ばれる円筒形の刃を持つ角膜が負傷しました。人間と豚の角膜については、いずれか、6 または 7 mm トレフィン; で負傷してください。ウサギ角膜 6 mm トレフィンが適しています。豚角膜は、人間の角膜のサイズに近いです。コスト効果的かつ大量にすぐに利用できるので豚角膜、器官培養を日常的に使用されます。さらに、抗体と人間と反応させて Sirna の豚7交叉反応性が一貫しています。負傷後角膜カットされ角膜輪部と世界中からそのまま寒天/コラーゲン ベースにマウントされているとします。角膜は、メディアの無血清培養、さらに線維芽細胞増殖と ECM 蒸着20をシミュレートするためにビタミン C を安定化します。血清添加も成長因子7myofibroblast 形成を誘導するために必要です。角膜は定期的に固定し、文化の 2 週間後組織学のための処理します。遺伝子ノックダウンまたはエージェントの創傷治癒に及ぼす影響をテストするのには、7人が負傷した後傷口に siRNA の傷を扱うことができるまたはメディア、それぞれ8に可溶性のエージェントを追加できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes with lids attached&#160;</td>
			<td>Pel-freeze, Arkansas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm trephine&#160;</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K28014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade&#160;</td>
			<td>Personna</td>
			<td>0.009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>895110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08953-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes&#160;</td>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; 34120</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add all of the following components to DMEM/F-12:&#160; ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Vitamins Solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7256</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Use at 1 &#181;g/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% L-glutamine solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Sodium pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td>1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.&#160; Use from freezer each time media is made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABAM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7292</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>070-0483</td>
			<td>2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Iodine&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Cassettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>We use 3% NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Clear&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>314-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Ultra Pure</td>
			<td>200CSGP</td>
			<td>200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP327</td>
			<td>10mM, pH 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>M10742500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing agent&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>220-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Kit&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bermis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNAprotect Cell Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;76104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6140</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547 or C6198 (cy3 conjugated)</td>
			<td>1:200 Diluted in 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permafluor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62-6520</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA1-85999</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3&#160;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-165-146</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Zeiss Axioplan2&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOT-2</td>
			<td colspan="2">Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies

角膜は、創傷治癒過程を研究するモデル システムとして広く使用されています。生成し、2 次元 (2 D) および 3 次元 (3 D) 文化の主な哺乳類細胞を活用する能力は、角膜の生物学についてだけでなく、創傷治癒、myofibroblast 生物学と一般的に瘢痕についての情報の富を生成して.プロトコルの目的は、瘢痕を特徴づける myofibroblast 開発を定量化するための分析システムです。豚の目を使用してモデル前のヴィヴォ角膜オルガン文化を紹介します。この前方の角膜切除の傷、トレフィンと呼ばれる円形翼で世界中でまだ角膜を負傷しています。上皮、基底膜、実質の前方の部分など、前方の角膜の約 1/3 のプラグインが削除されます。負傷後、角膜が世界中からカットがコラーゲン/寒天ベースのマウントされ、居住者線維芽細胞細胞増殖と細胞外マトリックスの分泌を増やすために安定化ビタミン C と補われる血清の自由な媒体で 2 週間培養しました。前歯の間質の芽の活性化は、治癒後の角膜で明らかです。このモデルは、傷口の閉鎖、毒物学、芽や線維化マーカーの開発を試金するために使えます。さらに、遺伝子の打撃のための脂質を介した siRNA トランスフェクションと同様、小分子阻害剤の効果は、このシステムでテストできます。

免疫組織化学が利用されている主なアッセイの元の成功を分析する生体創傷治癒実験。図 4は、上皮と組織制御 (図 4 a, 4 b) 前歯間質を示しています。負傷後 6 時間上皮も欠席 (図 4、 4 D)。予想通り、負傷後 6 日上皮は (図 4 e、 4 階) 凹凸が?...

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Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D 細胞環境で薬物の毒性の影響を評価するために使用できます。

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

本論文では、三次元多細胞臓器培養モデルシステムにおける創傷をアッシングする簡単な方法について述べた。私たちは豚の目を使ってこれを行いますが、目に慣れていない場合でも、このアッセイを行うことができます。概要として、我々は、ブタの目を受け取り、地球を切り取り、上皮と間質の約3分の1を通過する角膜に円形の傷を作る。角膜を切り取り、寒天ベースに取り付け、このコンストラクトをインキュベーターに入れます。組織は角膜に瘢痕を作り出す際に満たされます。成長因子や血清を加える必要はありません。これは無血清培地で行われます。これは角膜で行われるが、一般的に線維性治癒のためのモデルシステムとして使用することができる。瘢痕化中に活性化される細胞経路の多くは、システム間で類似している。バイオセーフティフードでは、ストレートエッジの外科用ブレードを使用して、エタノール洗浄されたまな板の蓋から地球を取り除き、各眼から余分な脂肪組織を取り除きます。洗浄された地球儀を後に持ち、すぐにPBSに目を浸し、続いて10%ヨウ素に3回の素早いディップを行い、PBSで2回の素早いディップを行います。その後、きれいなラボ組織で周回に眼を包み、角膜に接触することなくトート角膜表面を達成するのに十分な圧力で包みます。6ミリメートルのトレフィンを使用して、角膜全体に完全な厚さの傷を作ることなく角膜中央の前部ストロマの上皮を貫通し、光圧を加えながらトレフィンを時計回りに180度、反時計回りに5回回転させます。創傷が鉗子で持ち上げられるほどの深さである場合、外科的ブレードを使用して、創傷マージン内で前角膜を持ち上げ続けながら、世界に平行にフラップを切断する。フラップ全体が取り除かれたら、円形の傷が角膜の中心に位置する必要があります。角膜を収穫するために、実験室組織で目をつかみ、そして、四肢および組織の収集を含むように角膜の端から1ミリメートル離れた小さな切開を作るために外科用刃を使用する。小さくて鋭いはさみを使用すると、四肢をタクトに保つために角膜を横切ってミリメートルのマージンを維持し、世界中の切開を続けます。次に、角膜を下に、60ミリメートル、またはPBSの1ミリリットルを含む100ミリメートル皿に置きます。角膜を取り付けるには、2組の鉗子を使用して角膜上皮側を保持してカップを作成し、無菌転写ピペットを使用してカップがいっぱいになるまで温めた寒天溶液を角膜に加えます。寒天が固まったら、慎重に角膜を新しい60ミリメートルプレート寒天側に下に置き、蓋でプレートを覆います。その後、5%の二酸化炭素で37°Cの四肢縁部の空気液体界面で角膜を維持する角膜の各プレートに4ミリリットルの無血清培地を加え、水分補給を維持するために、1日1回、角膜表面を1滴ずつ水分補給した状態の培地から1滴ずつ湿潤させます。遺伝子ノックダウンの場合は、5マイクロリットルの小さな干渉またはsiRNaを、血清最小必須培地の50マイクロリットルとトランスフェクション試薬2マイクロリットルと混合します。50マイクロリットルの減らされた血清培地当たり角膜を用いた。5分後、2つの混合物を混ぜ合わせ、各siRNA混合物に200マイクロリットルの減らされた血清最低培地を加える。次いで、siRNA溶液を各創傷にピペットして下ります。その後、インキュベーターに角膜を入れます。3時間後、各皿の培地を使用して角膜表面からsiRNAを洗浄し、各皿のコンディション培地を新鮮な補充された血清フリー培地と抗生物質に置き換えます。次いで角膜培養液を培養インキュベーターに戻し、2週間インキュベートする。創傷後6時間、角膜上皮は存在しない。創傷の6日後、上皮は再成長する。アルファ平滑筋アクチンによる蛍光アミノ染色は、前から後の間質に創傷マージンに沿った活性筋線維芽細胞の勾配を明らかにする。α平滑筋アクチンの免疫-菌学的染色は、負傷したプラスコントロールsiRNA角膜におけるα平滑筋アクチンタンパク質発現の劇的な増加を明らかにする。傷ついていない標的タンパク質siRNA治療と比較して、傷ついた角膜。同様に、フィブロネクチン余分ドメインAは、傷ついていない、標的タンパク質siRNAと比較して傷ついた角膜を治療したsiRNAでアップレギュレートされる傷ついた角膜を治療した。標的タンパク質のノックダウンに成功したことを実証する。また、標的タンパク質を非特異的に標的とする毒素による傷ついた角膜の治療は、再上皮化を防止し、質的細胞死を生じ、組織化されていないマトリックスと、毒素がアッセイした濃度で治癒を促進しないことを示唆する。結論として、この手順を試みている間、それは地球に浸透しないように、切断しながら、組織に平行にブレードを維持することを忘れないでください。このアッセイでは、化学熱傷や上皮の擦り傷を含む異なる創傷技術を採用することができる。また、上皮が治癒するかどうか、そしてどの速度で治癒するかを判断するために、薬物毒性アッセイに使用することができます。これは、あなたの生体内創傷治癒研究に先立って可能なコスト削減ex vivo、臓器培養モデルシステムです。

Research

JoVE Journal

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Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

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Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

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