Name: ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH-NEI R01 EY024942, pesquisa para evitar cegueira, Upstate Medical Universidade irrestrito fundos de investigação, e Lions distrito 20-Y. microscopia e análise de imagens de cortes de parafina foram realizadas no núcleo microscopia e preparação de lâmina histológica foi realizada no biorepositórios e no núcleo de patologia da faculdade de medicina de Icahn no Monte Sinai.

1. o órgão cultura
<ol><li>
Preparações
	<ol>
<li>Prepare a solução de ágar como segue. Em um pequeno frasco, prepare-se 1% de ágar e colágeno bovino de 1 mg/mL em DMEM-F12 até 20 mL. Trazer para ferver em uma chapa quente. Colocar a solução em um tubo cónico de 50 mL. Colocar o tubo em um banho de água em uma chapa quente para manter a solução de solidificação.</li>
		<li>Prepare a mídia de soro livre completadas (SSFM) conforme a composição fornecida na Tabela de materiai...

Este protocolo descreve um modelo para o estudo de cicatrização de feridas, em um ambiente 3D estratificado natural. Uso da cultura de órgãos como um intermediário entre a cultura de células e de estudos in vivo reduz significativamente os custos, bem como reduzir os procedimentos em animais vivos. Outros modelos 3D tem sido de grande benefício para o campo, incluindo Self sintetizando o gel de colágeno, feita a partir de fibroblastos da córnea humana primária2 ou estas mesmas células i...

Cicatrizes na córnea resultantes de infecção, trauma ou lesão podem levar a debilitante opacidades e perda de visão permanente. Assim, há uma necessidade crítica para identificar caminhos que podem ser direcionados para a intervenção terapêutica. Opções atuais do tratamento são limitadas e consistem principalmente de transplantes da córnea, que não são acessíveis aos pacientes em todo o mundo. Cultura de células 3D estudos1,2e ambos humanos (Figura 1) e córneas animais podem ser utilizadas para 2D. Córneas de cadáver humano não são adequadas para transplante podem ser obtidas em bancos de olhos ou bancos de tecidos centralizado (nacional doença pesquisa Interchange (NDRI)), e olhos de animais podem ser obtidos de um matadouro. Células epiteliais da córnea primárias, fibroblastos do estroma e, mais recentemente, as células endoteliais, podem ser isoladas e cultivadas destes tecidos para cicatrização de feridas e toxicologia estuda3,4,5. Além da importância de compreender a base molecular da cegueira doença ocular, a acessibilidade do tecido e a capacidade de cultura primária de células fez a córnea um sistema importante modelo para estudo. A córnea é ideal para testar os efeitos dos agentes em cicatrizes como a córnea normal é transparente e certos tipos de feridas criam opacidades ou cicatrizes fibróticas (revistas em6). Várias em vivo modelos cura de ferida da córnea também tem sido utilizados extensivamente para cicatrizes de estudos1. Menos utilizado tem sido o ex vivo da córnea ferida cura modelo7,,8 é descrever em detalhe aqui. O objetivo desse método é quantificar resultados cicatricial caracterizados por fabricantes fibróticos em um 3D multicelulares corneal ex sistema de modelo vivo.
Epiteliais da córnea, ferindo que não infringe a membrana basal epitelial normalmente fecha dentro de 24-72 h9. Logo após o ferimento, as células na borda do epitélio começam espalhando e migrando para a superfície epitelial livre, para restabelecer a função da barreira epitelial. Esta atividade sequencialmente é seguida pela ativação da proliferação da córnea basocelular primeiro e, numa fase posterior, de células precursoras, localizado na zona exterior estroma para alcançar a recuperação de células epiteliais em massa10,11. Estas feridas cicatrizam muitas vezes sem deixar cicatrizes. No entanto, uma ferida que penetra a membrana basal do estroma geralmente resulta em cicatriz formação1. Após ferimento do estroma da córnea, o estroma é preenchido com células de várias origens, incluindo células do estroma residentes diferenciadas, bem como derivados da medula óssea Fi12,13,14. Cicatrizes fibróticas é caracterizada pela persistência de miofibroblastos em uma cura ferida. Estes myofibroblasts patológicos demonstram maior adesão através da acumulação das integrinas em adesões focais, fibras de estresse de actina (α-SMA) músculo contrátil de α-liso e ativação local da matriz extracelular (ECM)-isolado latente-transformar o fator de crescimento-beta (TGFβ). A diferenciação das células epiteliais-derivado, conhecido como epitélio de transição mesenquimal (EMT), também pode contribuir para a formação de6da cicatriz.
Há um equilíbrio delicado entre a diferenciação celular e apoptose após ferimento. Por causa da violação na membrana do porão, crescimento fatores tais como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e TGFβ de lágrimas e o epitélio banham o estroma, induzindo a diferenciação de Miofibroblasto, um loop de autócrina sustentado de ativação TGFβ e o secreção de desorganizada fibrótico ECM15,16. A persistência de miofibroblastos na ferida curada promove haze e cicatrizes na córnea (Figura 2). No entanto, em regeneratively curado ferida embora myofibroblasts desenvolver, eles apoptose e, portanto, estão ausentes ou significativamente reduzida em número no tecido curado (revisto em referência6,10). Assim, a pesquisa em cicatrizes fibróticas centrou pelo menos em parte no direcionamento de moléculas que impedem o desenvolvimento excessivo de Miofibroblasto ou Miofibroblasto persistência17,18. Porque a persistência de Miofibroblasto caracteriza doença cicatriz e fibrótica em todos os tecidos19, a córnea pode ser útil como um sistema modelo para estudar os mecanismos celulares gerais da fibrose.
Em nosso sistema de modelo, a córnea é ferida com uma lâmina cilíndrica chamada uma trefina enquanto ainda na globo. Humano e as córneas de porco podem ser feridas com qualquer um 6 ou 7 mm trefina; para córneas de coelho um trépano de 6mm é preferencial. A córnea de porco é semelhante em tamanho da córnea humana. Porque eles são custo-eficaz e prontamente disponível em grandes números, córneas de porco são rotineiramente utilizadas para cultura de órgãos. Além disso, os anticorpos e siRNAs feita reagir com humanos têm consistentemente cross-reacted com porco7. Após ferimento, córneas são cortadas do globo com o limbo intactas e montado sobre um base de agar/colágeno. As córneas são cultivadas em meios de comunicação isento de soro mais estabilizaram vitamina C para simular a proliferação de fibroblastos e deposição de ECM20. A adição de soro, nem fatores de crescimento são necessários para induzir a formação de Miofibroblasto7. As córneas são rotineiramente fixadas e processadas para histologia após duas semanas de cultura. Para knockdown do gene, ou para testar os efeitos de um agente na cicatrização de feridas, a ferida pode ser tratada com siRNA na ferida depois ferindo7 ou um agente solúvel pode ser adicionado para a mídia, respectivamente,8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes with lids attached&#160;</td>
			<td>Pel-freeze, Arkansas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm trephine&#160;</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K28014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade&#160;</td>
			<td>Personna</td>
			<td>0.009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>895110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08953-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes&#160;</td>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; 34120</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add all of the following components to DMEM/F-12:&#160; ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Vitamins Solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7256</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td>Use at 1 &#181;g/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% L-glutamine solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Sodium pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td>1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.&#160; Use from freezer each time media is made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABAM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7292</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>070-0483</td>
			<td>2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Iodine&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Cassettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>We use 3% NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Clear&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>314-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Ultra Pure</td>
			<td>200CSGP</td>
			<td>200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP327</td>
			<td>10mM, pH 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>M10742500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing agent&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>220-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Kit&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bermis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNAprotect Cell Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;76104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6140</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547 or C6198 (cy3 conjugated)</td>
			<td>1:200 Diluted in 3% normal goat serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permafluor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA-030-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62-6520</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA1-85999</td>
			<td>1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3&#160;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-165-146</td>
			<td>1:200 Diluted in&#160; 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Zeiss Axioplan2&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOT-2</td>
			<td colspan="2">Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo corneal organ culture model for wound healing studies

A córnea tem sido amplamente utilizada como um sistema modelo para estudar a cicatrização de feridas. A capacidade de gerar e utilizar células primárias de mamíferos em duas dimensões (2D) e a três dimensões (3D) cultura gerou uma riqueza de informações não só sobre Biologia da córnea, mas também sobre a ferida cura, Miofibroblasto, biologia e cicatrizes em geral . O objetivo do protocolo é um sistema de ensaio para quantificar o desenvolvimento Miofibroblasto, que caracteriza a cicatriz. Vamos demonstrar um órgão corneal cultura ex vivo modelo usando olhos de porco. Neste anterior fotorrefrativa ferida, córneas ainda na globo estão feridas com uma lâmina circular chamada uma trefina. Um plugue de aproximadamente 1/3 da córnea anterior é removido, incluindo o epitélio, a membrana basal e a parte anterior do estroma. Após ferimento, córneas são cortadas do globe, montadas sobre uma base de colagénio/agar e cultivadas por duas semanas, complementado-soro livre médio com estabilizado vitamina C para aumentar a proliferação celular e secreção de matriz extracelular pelos fibroblastos residentes. Ativação de miofibroblastos no estroma anterior é evidente na córnea cicatrizada. Este modelo pode ser usado para o ensaio de fechamento da ferida, o desenvolvimento de miofibroblastos e marcadores fibróticas e para estudos de toxicologia. Além disso, os efeitos de inibidores de pequenas moléculas, bem como a transfeccao siRNA lipídica mediada por knockdown do gene podem ser testados neste sistema.

Imuno-histoquímica é o ensaio principal utilizado para analisar o sucesso do ex vivo ferida cura experimento. A Figura 4 mostra o epitélio e o estroma anterior no tecido de controle (Figura 4A, 4B). Seis horas após o ferimento, o epitélio estava ausente (Figura 4, 4-D). Seis dias após o ferimento como esperado, o epitélio tinha crescido (F...

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Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Este artigo descreveu um método simples para avaliar o ferimento em um sistema de modelo de cultura de órgãos tridimensional e multicelular. Fazemos isso usando olhos de porco, mas mesmo que você não esteja familiarizado com os olhos, você pode fazer este ensaio. Como visão geral, recebemos olhos suínos, cortamos os globos, fazemos uma ferida circular na córnea que passa pelo epitélio e cerca de um terço do estroma.Cortamos a córnea, montamos em uma base de Ágar, e colocamos essa construção na incubadora. O tecido vai preencher a criação de uma cicatriz na córnea. Você não precisa adicionar nenhum fator de crescimento, ou mesmo soro.Isso é feito em mídia sem soro. Embora isso seja realizado na córnea, pode ser usado como um sistema modelo de cicatrização fibrosa em geral. Como muitas das vias celulares que são ativadas durante as cicatrizes são semelhantes entre os sistemas.Em um capô de biossegurança, use uma lâmina cirúrgica de borda reta para remover o globo da tampa em uma tábua de corte limpa por etanol, e remova o excesso de tecido gorduroso de cada olho. Segurando o globo limpo posteriormente com fórceps imediatamente mergulham o olho na PBS seguido de três mergulhos rápidos em iodo de 10%, e dois mergulhos rápidos na PBS. Em seguida, enrole o olho circunferencialmente com um tecido de laboratório limpo para envolver com pressão suficiente para alcançar uma superfície córnea esticada sem entrar em contato com a córnea.Usando uma trefina de seis milímetros, penetre o epitélio no estroma anterior no centro da córnea sem fazer uma ferida de espessura total através de toda a córnea, e gire a trefina 180 graus no sentido horário e anti-horário cinco vezes, aplicando pressão leve para aprofundar a ferida. Quando a ferida estiver profunda o suficiente para permitir que um retalho de tecido seja levantado com fórceps, use uma lâmina cirúrgica para cortar o retalho paralelo ao globo enquanto continua a levantar a córnea anterior dentro da margem da ferida. Quando toda a aba tiver sido removida, uma ferida circular deve ser localizada no centro da córnea.Para colher a córnea segure o olho com o tecido de laboratório, e use uma lâmina cirúrgica para fazer uma pequena incisão a um milímetro de distância da borda da córnea para incluir o limbus e a coleta de tecidos. Usando uma tesoura pequena e afiada, continue a incisão ao redor do globo mantendo uma margem milimétrica através da córnea para manter o limbus em tato. Em seguida, coloque a córnea, de lado para baixo, em um prato de 60 milímetros, ou 100 milímetros contendo um mililitro de PBS.Para montar a córnea, use dois pares de fórceps para segurar o lado epitelial da córnea para criar um copo, e use uma pipeta de transferência estéril para adicionar solução de ágar aquecido na córnea até que o copo esteja cheio. Depois que o ágar endurecer, coloque cuidadosamente a córnea em uma nova placa de 60 milímetros para baixo e cubra a placa com uma tampa. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio sem soro suplementado a cada placa de córneas mantendo as córneas em uma interface ar-líquido na borda limbal em uma incubadora de cultura celular a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono, e molhando as superfícies córneas uma vez por dia com uma gota de meio sem soro suplementado do meio condicionado na placa para manter os tecidos hidratados.Para knockdown genético, misture cinco microliters de pequena interfering ou siRNa com 50 microliters de meio essencial mínimo de soro reduzido e dois microliters de reagente transfeccionado. Com 50 microliters de meio soro reduzido por córnea. Após cinco minutos, misture as duas misturas e adicione 200 microliters de meio mínimo de soro reduzido a cada mistura de siRNA.Em seguida, pipeta as soluções siRNA caem sábio em cada ferida. Em seguida, coloque as córneas na incubadora. Após três horas, use o meio em cada prato para lavar o siRNA das superfícies da córnea, e substitua o meio condicionado em cada prato por meio livre de soro fresco mais antibióticos.Em seguida, devolva as culturas córneas à incubadora de cultura celular, e incubar por duas semanas. Seis horas após o ferimento, o epitélio da córnea está ausente. Seis dias após o ferimento, o epitélio renasce.Fluorescência amino coloração com actina muscular suave alfa revela um gradiente de miofibroblasts ativos ao longo da margem da ferida do estroma anterior para posterior. A coloração imuno-histoquímica para a actina muscular suave alfa revela um aumento dramático na expressão de proteína de actina muscular suave alfa em lesões, além de controlar córneas siRNA. Comparado com siRNA de proteínas não enroladas e alvo tratadas, córneas feridas.Da mesma forma, a fibronectina extra domínio A é regulada em córneas tratadas pelo siRNA em comparação com córneas feridas não enroladas e de proteínas alvo tratadas com córneas feridas. Demonstrando um sucesso na proteína alvo. Além disso, o tratamento das córneas feridas com a toxina que não tem como alvo especificamente a proteína alvo previne a re-epitelialização e resulta em morte celular qualitativa, uma matriz desorganizada e vacuoles estrogonais sugerindo que a toxina não promove a cicatrização na concentração avaliada.Em conclusão, ao tentar este procedimento é importante lembrar de manter a lâmina paralela ao tecido durante o corte, para que não penetre no globo. Diferentes técnicas de wounding podem ser empregadas com este ensaio, incluindo queimadura química ou raspagem epitelial. Também pode ser usado para ensaios de toxicidade de drogas para determinar se o epitélio cura e a que taxa.Trata-se de um sistema de modelo de cultura de órgãos que pode preceder seus estudos de cura de feridas in vivo.

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