Name: ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring
Uploaded: 2018-11-17T14:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af de følgende tilskud til LAS: National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjerte Research Institute. KY er modtager af American Heart Association Predoctoral Fellowship (18PRE33960070). HepG2 celler blev venligst leveret af Dr. Emmanuel Thomas, universitetet i Miami Miller School Medicine46,47,48.

1. såning celler i en 24-godt plade
<ol><li>Opsug medier fra cellerne, cellerne vaskes med 5 mL af Dubelcos phosphat bufferet saltvand (dPBS) og Opsug dPBS. For HepG2 celler i en 100 mm parabol, bruge 1,5 mL 0,25% Trypsin/EDTA, og for HK2 celler eller HCAECs bruge 1,5 mL 0,05% Trypsin/EDTA-oploesning Adskil celler.</li>
	<li>Inkuber pladen i et 37 ° C inkubator for 4 minutter, eller indtil cellerne er frakoblet. Neutralisere trypsin efter en 4 minutters inkubation ved tilsætning af 3 mL af komplette medier for HepG2 og HK2 eller 3 mL trypsin neutralisere løsning, dPBS plus 5% føtal bovint serum (FBS), for HCAEC celler.</li>
	<li>Overføre cellerne i 15 mL koniske rør og centrifugeres ved 250 x g i 5 min, Aspirér medierne og genopslæmmes celle pellet i komplet media.</li>
	<li>Filtrere cellesuspension forsigtigt gennem et 40 μm mesh si til at bryde op celle klumper. Ikke vaske cellerne gennem sien.</li>
	<li>Tælle cellerne og plade dem på en optimeret tæthed. For eksempel, føre 5.000 celler pr. brønd HepG2 celler eller 10.000 celler pr. brønd HK2 celler eller HCAECs i en 24-godt plade til optimale resultater.</li>
	<li>Inkuber plade natten over ved 37 ° C at tillade celler til at vedhæfte.</li>
	<li>Den næste dag, ændre celle medier for at basere medier for cellelinje (uden FBS) plus 5% Lipo-Protein mangelfuld Serum (LPDER) eller lav (2%) FBS media afhængigt af behandlingen (Se 1.7). Derefter fortsætte inkubation i 24 timer til at sulte cellerne. Bruge 500 μL af total media pr. brønd i en 24-godt plade.</li>
	<li>Behandling af celler i en af tre måder: tilføje 10 µg/mL af rPCSK9 (eller køretøjet) og returnere celler til 37 ° C inkubator for 1 time, tilføje 40 µM af Dynasore hydrat (eller køretøj, dimethylsulfoxid) og returnere cellerne til 37 ° C inkubator i 10 minutter , eller tilføje 1 µM Simvastatin (eller køretøj, dimethylsulfoxid) og vende tilbage cellerne til 37 ° C inkubator 12, 18 eller 24 timer. Brug media med 5% LPDER til rPCSK9 eller Dynasore behandlinger. Vælg lav (2%) FBS medier eller medier med 5% LPDER Simvastatin behandlinger. Bemærk: Behandling af celler med ønskede forbindelser kan ske på tidspunktet for media ændring af lipoprotein sult (trin 1,6) for langsigtet eksperimenter eller før analysen til kortsigtede forsøg. Alternativt kan tilpasset behandling gange vælges baseret på typen og formålet med forsøgene.</li>
	<li>Næste, tilsæt 5 µL af pHrodo rød-mærket LDL (1 mg/mL stock) til hver brønd til at opnå en endelig koncentration på 10 µg/mL. Derefter forsigtigt fjerne eventuelle bobler fra brøndene.</li>
</ol>2. levende celle analyse
<ol><li>Straks efter tilsætning mærket LDL, pladen anbringes i den levende celle analyse system inkubator (Se Tabel af materialer) og tillade plade til blandingen henstår i 15 minutter til at reducere kondensering i pladen.</li>
	<li>I mellemtiden, åbne softwaren og planlægge scanningen ved at tilføje fartøjet holder pladen. Billede 16 billeder pr. brønd med 1 times intervaller på 10 X i 4 timer ved hjælp af røde og fase-kanaler.</li>
	<li>Oprette en plade kort til brug for databehandling.<ol>
<li>Klik på fanen Egenskaber vælge plade kort. Input celletype og behandlinger i forbindelser tab.</li>
		<li>Klik på fanen områder , Marker hvert sæt af replikater, og gemme som regioner.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. opsætning af analyseparametre
<ol><li>Når en eksperimentel run er færdig, skal du oprette et billede indstillet i softwaren til at træne computeren til at kvantificere hver parameter medtages i optællingen.<ol>
<li>I softwaren, åbne visningen plade og derefter i boksen Analyse Job Utilities vælge Opret eller Føj til billedsamling.</li>
		<li>Vælg Ny billedsamling, Skriv et navn til samlingen billede, og vælge de røde og fase kanaler ved at markere afkrydsningsfelterne ud for kanalerne.</li>
		<li>Vælg 5 flere billeder og tilføje til billedsamling ved at tilføje den aktuelle billedsamling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oprette en forarbejdning Definition for cellerne. Tabel 1 indeholder parametre for cellen HepG2, HK2 og HCAE forarbejdning definitioner for protokollens LDL tilstrømning.<ol>
<li>Vælg Ny behandling Definitioni boksen Analyse Job Utilities . Vælg billede samlingen opkaldt taktfast 2.1.2 fra drop down menuen. Input parametre for typen celler fra tabel 1.</li>
		<li>Brug rullemenuen til at vælge Preview allei eksempelboksen.</li>
		<li>I boksen Analyse maske kontrollere Sammenløbet maske og boksene Rødt objekt maske for at se området inkluderet i analysen for forarbejdning definition. Se figur 1.</li>
		<li>Rul gennem billedsamling at sikre celler og LDL er inkluderet i masken. Vælg filen og gemme forarbejdning Definition.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysere sæt af billeder fra den eksperimentelle kørsel.<ol>
<li>Åbn eksperimentet i plade visning. Vælg Lancere nye analyse Jobi boksen Analyse Job Utilities . Vælg den gemte forarbejdning Definition.</li>
		<li>Navngive analyse jobbet, vælge tidsintervallet for analyse og fremhæve de eksperimentelle wells til at analysere. Klik på knappen Start .</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analyse og databearbejdning
<ol><li>Når analyse Job er fuldført, skal du eksportere dataene:<ol>
<li>Vælg den gennemførte analyse og tryk på Vis. Vælg Metrisk/graf eksporterei menuen hjælpeprogrammer .</li>
		<li>I menuen regioner vælge Alle brønde, og gruppen Vælg i menuen for at opnå de gennemsnitlige værdier for hvert sæt af brønde som en gruppe replikater, og for at eksportere de individuelle værdier for hver brønd vælge ingen.</li>
		<li>Vælg Samlede rødt objekt integreret intensitet (RCU x µm2afbildningsstien)i menuen Red objekt metriske . Denne parameter angiver summen af rødt signal intensitet (i RCU) gange området af det røde signal (i µm2) i alle billeder på tværs af hver brønd, som svarer til den samlede LDL optagelse af celler.</li>
		<li>Klik på knappen Dataeksport . Kontrollere opdele data i individuelle billeder. Oplysningerne kopieres automatisk på en Udklipsholder og kan indsættes til en ny regnearkfil.</li>
		<li>I menuen fase objekt metriske vælge sammenløbet (procent). Kontrollere opdele data i individuelle billeder. Klik på knappen Dataeksport . Dataene kopieres automatisk på en Udklipsholder og kan kopieres til den regnearksfil, der indeholder samlede rødt objekt integreret intensitet data.</li>
		<li>Gælde omstilling af procent sammenløbet for samlede areal med følgende ligning. Samlet fase areal (µm2afbildningsstien) = sammenløbet (%) × (billedets højde (pixel) × dagsorden) × (billedbredde (pixel) × opløsning) Bemærk: parameteren sammenløbet (%) angiver det procent sammenløbet af fase areal pr. billede, der svarer til området af celler i hver brønd. Denne parameter skal konverteres til total fase område for hver enkelt billede en gang eksporteret. Billede specifikationer for fase kanal (billedets højde, bredde og opløsning) skal anvendes med den ovenstående formel for hvert fartøj, eksperimentelle kan findes ved at henvise til Fartøj egenskaber under Billedet kanaler.</li>
		<li>Normalisere samlede rødt objekt integreret intensitet til den samlede fase område som beregnet i 4.1.6 ved hjælp af følgende formel for hvert enkelte billede for at eliminere variabilitet i celle tæthed på tværs af brøndene.<ol>
<li>Dividere de Samlede røde objekt integreret intensitet (RCU x µm2afbildningsstien) værdier af hvert billede med dens tilsvarende Samlede fase område (µm2afbildningsstien) at opnå LDL optagelse (RCU) værdier pr. billede.</li>
			<li>Derefter, gennemsnitlig LDL optagelse (RCU) data for alle billeder af hver brønd til at få den gennemsnitlige LDL optagelse i hver brønd og derefter gennemsnitlig LDL optagelse værdier af alle Repliker brøndene at opnå gruppe betyder. Disse data er de endelige LDL optagelse værdier og kan bruges til illustration og statistisk analyse ved hjælp af softwaren valg.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

I den nuværende protokol viser vi udnyttelsen af levende celle imaging som en ny og mere effektiv metode til at måle realtid LDL optagelse over et tidsforløb i forskellige menneskelige cellelinjer. Menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler er almindeligt anvendt i undersøgelser screening for kolesterol-sænkende therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Derfor valgte vi denne celletype til at teste evnen til en levende celle billedbehandlingssystem for LDL tilstrømning undersøgelser. Vores resultater viser, at HepG2 celler er forenelige med denne nye teknik og resultat i en sigmoid-lignende kurve der angiver kontinuerlig LDL optagelse for varigheden af tilstrømning assay indtil 4,33 Hansen som den endelige slutpunkt (figur 2A og figur 3 ).
Kolesterol homøostase spiller en stor rolle i Patofysiologi af forskellige nephropathies. Kolesterol ophobning i nyre væv er en stor bidragyder til renal fibrose fører til kronisk nyresygdom og er en større patologi i forskellige nephropathies28,29,30,31. Derfor undersøgte vi vores metode i menneskelige renal (HK2) epitelceller som en populær og pålidelig cellelinie udnyttet inden for nefrologi. Vores data understøttes også muligheden for den levende celle imaging system til at måle LDL tilstrømning i HK2 celler. Som vist i figur 2B, tog HK2 celler LDL kolesterol lineært i hele varigheden af tilstrømning undersøgelse (4 timer).
På grund af betydningen af kolesterol metabolisme i udvikling og progression af aterosklerose32,33,41, den hyppigste årsag til hjerte-kar-sygdom, som igen er nummer et morderen på verdensplan 42, vi havde til formål at validere vores metode i en åreforkalkning-relevante celletype. Vi brugte humane koronar arteriel Endothelial celler (HCAECs), da disse er en af de første celletyper til at blive udsat for en fornærmelse af kolesterol i kranspulsåren lumen af en åreforkalkning patienten. Vores data, vist i figur 2C angiver, at denne LDL tilstrømning metode også fungerer effektivt med HCAECs. Den deraf følgende graf er en sigmoid-lignende kurve ligner HepG2 celler.
For at teste gyldigheden og følsomhed på denne forbedrede LDL tilstrømning assay for screening forbindelser påvirker LDL-kolesterol optagelse, brugte vi tre kontrolelementer, LDL optagelse-sænkende stoffer Dynasore og rPCSK9 og LDL tilstrømning aktivator Simvastatin. Her, vi behandlede den ovenfor nævnte cellelinjer (HepG2, HK2 og HCAECs) med optimeret koncentrationer af Dynasore eller rPCSK9 før tilstrømning assay. Vores resultater viste, at alle tre testede cellelinjer reageret på behandlingerne med betydelige reduktioner i LDL tilstrømning over en 4-timers kursus (figur 2). Eksempelvis på 4,33 Hansen som den endelige tidspunkt, behandling med Dynasore på 40 µM betydeligt reduceret LDL tilstrømning i HepG2 celler, HK2 celler og HCAECs 53%, 68% og 54%, henholdsvis (p < 0,0001; Figur 2 A-C og Tabel 2A-C). Derudover rPCSK9 på 10 µg/mL forårsaget en markant 55% reduktion i LDL tilstrømning i HK2 celler (p < 0,0001; Figur 2 B og tabel 2B). Vores resultater viste desuden, at behandle HepG2 celler med Simvastatin resulteret i en markant stigning i LDL optagelse (figur 3), støtte følsomheden af denne metode til at påvise betydelige ændringer i LDL tilstrømning. Undersøgelser af behandling med rPCSK9 i HepG2 og HCAEC celler er ikke inkluderet i denne protokol, som rPCSK9 er brugt som en ekstra kontrol behandling med veldokumenterede resultater, men er dyrt at købe i små mængder. RPCSK9 var derfor kun bruges til at validere denne protokol i HK2 celler.
Live celle imaging analyse, sammen med de funktionelle og rettidig måling af LDL tilstrømning, mulighed for løbende overvågning af sundhed og morfologi af celler. Denne fordel kan effektivt opdage potentielle cytotoksicitet af de anvendte stoffer, gør denne metode en ideel teknik til samtidig overvågning af farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet. Tallene 5-7 illustrere repræsentative billeder af de tre testede cellelinjer på den endelige slutpunkt (4,33 h) som en visuel reference for effekten af behandlinger på netto LDL tilstrømning og viser også de sunde morfologi af celler efter den testede behandlinger. Vi anbefaler visuel inspektion af alle billederne fra hver brønd til at forsikre heathy morfologi af cellerne for varigheden af undersøgelsen. For eksempel i data, der ikke vises, da billeder af HepG2 celler behandlet med 80 μM Dynasore blev inspiceret, vi observeret tegn på celle udstationering som kanterne af cellerne syntes at være løfte fra pladen, tyder på celle detachement ved højere koncentrationer af Dynasore. Derudover induceret høje koncentrationer af simvastatin (3-10 μM) også ført til ændrede morfologi angiver apoptose som rapporteret for høje doser af statiner45. Denne protokol blev brugt til at udføre en titrering af Dynasore behandling på 20-80 μM og Simvastatin på 0,5-10 μM koncentration, hvorefter celle billeder blev brugt til at analysere sundheden for cellerne og bestemme potentielle ctotoxicity af behandlinger på forskellige koncentrationer. Resultater foreslog at benytte 40 μm for Dyansore og 1 μM for simvastatin som optimal koncentrationer.
Endelig foreslår vi, at udføre en celle tæthed titrering undersøgelse, hvis en anden cellelinje er at blive testet med denne metode for at identificere de optimale celle nummer pr. brønd for at få ensartede resultater. Vores celle tæthed optimering undersøgelse viste, at 10.000 celler/brønd i en 24-godt plade føre til konsekvent LDL tilstrømning udfald for HK2 og HCAE celler. Det er vigtigt at bemærke, for denne LDL tilstrømning analyse ved hjælp af levende celle imaging system, en éncellelag af ikke-sammenflydende celler fordelt jævnt på brøndene er ønskeligt, som klumper af celler kan give anledning til fejl i de endelige normaliserede LDL tilstrømning værdier. Grunden til dette er, at for en normalisering af tilstrømning data, fase objekt området bruges som en målestok for celle tæthed og denne parameter kan påvirkes negativt, når celle klumper er dannet. Vi observerede, at HepG2 celler har en tendens til form klumper når seedede ved tætheder højere end 5.000 celler/brønd forårsager inkonsekvent tilstrømning resultater; Derfor, vi brugte 5.000 celler pr. brønd i en 24-godt plade som optimal tæthed for HepG2 celler.
Kollektivt, giver vores metode en medium til høj overførselshastighed platform for screening farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL tilstrømning samtidigt. Denne metode kan tilpasses let til brug med andre fluorescently mærket ligander, som angiver den lysosomale rum for at evaluere ligand optagelse i realtid. Mens denne protokol tilbyder specifikationer for InCucyte live billedbehandling og analysesystem, protokollen kan tilpasses for alternative Billeddannende systemer som Cellomics.

Low Density Lipoprotein Receptor LDLR-medieret LDL endocytose er et vigtigt område af undersøgelse, da cirkulerende LDL kolesterolniveauer er kernen i hjerte-kar-sygdom1, nyre sygdom2 samt en bred vifte af inflammatoriske sygdomme3 og genetiske sygdomme med mutationer i kolesterol transport gener4,5,6,7. Undersøgelser i LDLR-medieret kolesterol tilstrømning har ført til identifikation af flere forskningsværktøjer, såsom Dynamin-hæmmere, herunder den kemiske Dynasore8,9,10, samt regulering af LDL proteiner som Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9 (PCSK9)11,12.
LDL-LDLR endocytose pathway begynder med binding af LDL-LDLR kompleks på cellens overflade i clathrin-belagt pitten13. Vesikler er så dannet af invagination af overflade cellemembranen internalisere LDL-LDLR komplekset i vacuoles for transport inde i cellen. Som den dannede vesikel modnes i begyndelsen og derefter sent endosomes, falder pH inde den sene endosome, forårsager afstandtagen af LDL fra dens receptor14. I fortiden afhang metoder til kvantificering af LDL tilstrømning radio-mærket 125-LDL Co inkubering med celler og efterfølgende udvinding af den radioaktivt mærkede protein fra celler for kvantificering15. Dette blev derefter erstattet af brugen af fluorescently mærket LDL proteiner som DiI-LDL, og efterfølgende immunfarvning eller udvinding af protein for fluorescerende aflæsninger ved hjælp af et spektrofotometer eller plade læser15,16. Fluorescently mærket er LDL også blevet brugt i fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til analysen af internaliseringen af LDL og celle overflade LDL bindende17. Mens disse metoder giver mulighed for indsamling af data efter behandling, er overvågning levedygtigheden af cellerne under behandling ikke muligt.
Sure pH-værdi i de sene endosome tillader brug af en pH-aktiveret fluorescerende LDL sonde som pHrodo røde LDL, der fluorescerer efter internalisering18,19. Denne egenskab giver mulighed for en kontinuerlig tidsforløb af LDL optagelse vurdering i levende celler. Derfor, denne protokol udnytter pHrodo rød-LDL fluorescens imaging i en levende celle analyse seriefremstillede foranstaltning LDL optagelsen med samtidige overvågning for celle sundhed. Resultaterne indikerer pålideligheden af denne roman teknik som testet over en fire-timers kursus i tre forskellige menneskelige cellelinjer, menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler, humane renal epitel (HK2) celler og menneskelige koronar arteriel endothelial celler (HCAEC ). Disse cellelinjer er klinisk signifikant til LDL clearance20,21,22,23,24,25,26,27 , nyre sygdom28,29,30,31, og hjertesygdomme32,33, henholdsvis. Ud over overvågning af LDL tilstrømningen, omfatter denne protokol behandling med to velkendte LDL uptake hæmmere, Dynasore hydrat og rekombinante PCSK9 protein samt et statin inducer af LDLR udtryk og LDL optagelse, simvastatin. Dynasore og rekombinante PCSK9 hver arbejde gennem forskellige veje til at reducere LDL optagelse.
Dynasore er et lille molekyle hæmmer af Dynamins10 og reducerer LDL optagelse ved at blokere clathrin-afhængige endocytose af LDL-LDLR komplekse10,34. Rekombinante PCSK9, på den anden side er medlem af peptidase S8 familien, der binder sig til LDLR og hæmmer dets genanvendelse til cellens overflade efter at slippe LDL fra internaliseret komplekset ved at blokere kræves konformationelle ændringer35,36 . Nedsat celle overflade LDLR tæthed fører i sidste ende til lavere LDL optagelse af cellen. Statiner, er mens direkte blokerer for 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym (HMG-CoA) reduktase enzym- og dermed kolesterol biosyntesen, også kendt for at upregulate udtryk for LDLR25,38 fører til øget LDL optagelse. Følsomheden af denne protokol er valideret ved at opdage væsentlige reduktioner i LDL tilstrømning i tre klinisk relevante menneskelige cellelinjer, HK2, HepG2 og HCAECs, af Dynasore og/eller rekombinante PCSK9, og en markant stigning i LDL optagelse i HepG2 celler ved Simvastatin i en fire-timers kursus med overvågning for celle morfologi/sundhed. Tilsammen, giver denne metode en medium til høj overførselshastighed platform for samtidigt screening farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL optagelse i levende celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="760">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:281px;">pHrodo Red-LDL</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:149px;">L34356</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HepG2 cells</td>
			<td>E. Thomas Lab, U. Miami</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FBS</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>FP-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Keratinocyte SFM media kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Primary Coronary Artery Endothelial Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Vascular Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Endothelial Cell Growth Kit-VEGF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Human Lipoprotein Deficient Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-999-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">40 &#956;M mesh cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan Blue Staining (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Incucyte Zoom</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Zoom</td>
			<td>Imaging and analysis platform</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dynasore Hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">PCSK9 Recombinant Protein</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring

Regulering af LDL kolesterol optagelse gennem LDLR-medieret endocytose er et vigtigt område af undersøgelse i forskellige vigtige patologier herunder stofskiftesygdom, hjerte-kar-sygdom og nyresygdom. I øjeblikket er der ingen tilgængelig metode til at vurdere LDL optagelse mens samtidig overvågning af sundheden for cellerne. Den nuværende undersøgelse præsenterer en protokol, ved hjælp af en levende celle imaging analysesystem, for at erhverve serielle målinger af LDL tilstrømning med samtidige overvågning for celle sundhed. Denne nye teknik er testet i tre menneskelige cellelinjer (hepatisk, renal tubulær epitel, og koronar arterie endotelceller) over en fire-timers kursus. Derudover er følsomheden i denne teknik valideret med velkendte LDL uptake hæmmere, Dynasore og rekombinante PCSK9 protein, samt af en LDL optagelse promotor, Simvastatin. Tilsammen, giver denne metode en medium til høj overførselshastighed platform for samtidig screening farmakologiske aktivitet samt overvågning af celle morfologi, dermed cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL tilstrømning. Analysen kan anvendes med forskellige Billeddannende systemer og analytisk software.

Live celle Imaging giver mulighed for pålidelig overvågning af celle sundhed under kolesterol tilstrømning studier i tre menneskelige cellelinjer Vi validerede vores analyse i tre menneskelige cellelinjer som kolesterol homøostase forordning spiller en stor patofysiologiske rolle, herunder menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler, humane renal epitel (HK2) celler og menneskelige koronararterie endotelceller (HCAECs). Vi brugte en levende celle imaging system til at udføre LDL optagelse assay i en 4 h tidsforløb med serielle målinger på 1 h intervaller. Vores resultater viser, at alle celletyper testet var forenelige med denne nye teknik og resultat i kurver angiver løbende LDL optagelse for varigheden af tilstrømning undersøgelse med 4,33 Hansen som den endelige slutpunkt (figur 2). Tilstrømning data vist i figur 2 blev opnået ved at normalisere den samlede pHrodo rød-mærket LDL fluorescens (total rød objekt integreret intensitet pr. billede i RCU x µm2/billede) til området cellen total i hvert billede i hver brønd (fase objekt areal pr. billede i µ m2afbildningsstien) at eliminere variabilitet i celle tæthed på tværs af brøndene. Derudover for at validere følsomhed af LDL tilstrømning analysen med henblik på screening forbindelser påvirker LDL kolesterol optagelse, brugte vi to positive kontroller kendt for at hæmme LDL tilstrømning, Dynasore og rPCSK9, og en positiv kontrol kendt for at inducere LDL optagelse, Simvastatin. Godkendt af vores resultater, efter behandling med Dynasore og rPCSK9, testet alle tre humane cellelinjer (HepG2, HK2 og HCAEC) viste signifikant reduktion i LDL tilstrømning over en 4 h tidsforløb (figur 2A-C). For eksempel, viser figur 2A , at LDL tilstrømning er reduceret i HepG2 celler med behandling af Dynasore over tidsforløb, i forhold til de celler, der er behandlet med DMSO; mens DMSO som kontrolelementet køretøj for Dynasore kontrol havde ingen signifikant effekt på LDL tilstrømning i forhold til den ubehandlede kontrolgruppe. Desuden vores resultater viste en markant stigning i LDL optagelse af HepG2 celler efter behandling med Simvastatin (figur 3), der understøtter følsomheden af denne metode til at påvise betydelige ændringer i LDL tilstrømning. På omkring 4,5 h tid-punktet, som er en typisk tidspunkt i LDL optagelse undersøgelser, LDL tilstrømningen er væsentligt reduceret med enten Dynasore eller rPCSK9 behandling, og steg med Simvastatin behandling (figur 4).
En stor fordel ved at bruge levende celle imaging for LDL optagelse undersøgelser er, at dette system giver realtid billeder af celler i hver brønd, der kunne bruges til at overvåge potentielle cytotoksicitet af de undersøgte stoffer. Tallene 5-7 illustrere repræsentative billeder af de tre cellelinjer undersøgt på første gang punkt 0,33 h og endelige slutpunkt (4,33 h) som en visuel reference til den netto LDL tilstrømning. Billederne bekræfter den normale morfologi af celler efter Dynasore eller rPCSK9 behandlinger, der angiver både effektiviteten og sikkerheden af disse forbindelser.
Levende celle analyse giver pålidelig serie kvantitative kolesterol tilstrømning målinger med forskellige behandlinger
En stor fordel ved at bruge denne protokol med en levende celle imaging system er evnen til at indsamle data i hele tid kurset og sammenligne LDL tilstrømning på flere tidspunkter i stedet for blot en sidste gang punkt som traditionelt udført. Ved hjælp af denne protokol, er vi i stand til at beregne den procentvise reductionin LDL tilstrømning for terminal tidspunkt samt 1 h mellemrum under hele tiden. Tabel 2 opsummeres reduktion i LDL tilstrømning i tre testede menneskelige cellelinjer efter 10 min før behandling med 40 µM Dynasore eller 1 h forbehandling med 10 µg/mL rPCSK9. På 4,33 Hansen som den endelige undersøgelse endepunkt, behandling med Dynasore på 40 µM betydeligt reduceret LDL tilstrømning i HepG2 celler, HK2 celler og HCAECs 53%, 68% og 54%, henholdsvis (Tabel 2A-C) og behandling med rPCSK9 på 10 µg/mL resulterede i 55% reduktion i LDL tilstrømningen i HK2 celler (tabel 2B). Ud over at kvantificere terminal tidspunkt som i traditionelle assays, er vi købedygtig præstere en kvantitativ analyse i reduktion af LDL tilstrømning på grund af behandling på hvert tidspunkt af eksperimentet. For eksempel, viser tabel 2B at behandling med rPCSK9 i HK2 celler resulterede i en reduktion af LDL optagelse af 79% på 1,33 h, 67% på 2,33 Hansen, 59% på 3,33 h efter behandling i forhold til ubehandlede celler. Denne protokol giver en pålidelig metode til kvantitativ analyse af LDL tilstrømning efter behandling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig1.jpg"> Figur 1 : Forarbejdning Definition maske. Repræsentative billeder af HK2 celler er afbildet, efter anvendelse af den relevante behandling definition (detaljeret oversigt i tabel 1). Vist areHK2 celler uden afmaskning (A), med fase Maskapplied (B), med rødt objekt maske anvendt (C), eller med både fase og rødt objekt masker anvendes (D). Skalalinjen = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig2.jpg"> Figur 2 : Reduktion i LDL optagelse bruger live celle billedbehandlingssystem over en 4,33 h tidsforløb. Live-celle analyse system bruges til at måle LDL tilstrømning i menneskelige hepatisk karcinom (HEPG2) celler (A), human renal tubulær (HK2) epitelceller (B) og menneskelige koronararterie (HCAE)-endotelceller (C). Cellerne blev behandlet med Dynasore (10 min før løbet) eller rPCSK9 (1 h før løbet) som positive kontroller. DMSO blev brugt som et redskab til Dynasore behandlinger. Positive kontroller faldt betydeligt LDL tilstrømning i alle 3 cellelinjer. LDL tilstrømning værdier blev opnået ved at normalisere samlede rød objekt integreret intensitet (RCUxµm2afbildningsstien) til området samlede fase objekt (µm2afbildningsstien). Data er mean±SEM. N = 6 wells/gruppe. Data er repræsentative for 2 eller 3 uafhængige forsøg. p < 0,0001 vs tomme, og ###p < 0,0001 vs DMSO, ved hjælp af to-vejs ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig3.jpg"> Figur 3 . Stigning i LDL optagelse ved hjælp af levende celle imaging system over en 4,33 h tidsforløb. Live-celle analyse system bruges til at måle LDL tilstrømning i menneskelige hepatisk karcinom (HEPG2) celler. LDL optagelse er steget betydeligt efter behandling med Simvastatin til 12 h (A), 18 h (B) eller 24 h (C) ved hjælp af medier indeholdende 2% FBS. 24 h tidspunkt blev også udført med medier indeholdende 5% LPDER (uden FBS). DMSO blev brugt som negativ kontrol. LDL tilstrømning værdier blev opnået ved at normalisere samlede rød objekt integreret intensitet (RCU x µm2afbildningsstien) til området samlede fase objekt (µm2afbildningsstien). Data er mean±SEM. N = 6 wells/gruppe. Data er repræsentative for et uafhængigt eksperiment. p < 0,0001 vs DMSO, brug af Student's t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig4.jpg"> Figur 4 . Betydelig LDL tilstrømning reduktion af LDL optagelse-sænkende stoffer for 4,3 h tidspunkt. LDL tilstrømning er betydeligt reduceret i menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler (A), human renal tubulær (HK2) epitelceller (B) og menneskelige koronararterie (HCAE) endotelceller (C) efter behandling med LDL optagelse hæmmere Dynasore for 10 min eller rPCSK9 i 1 time. LDL tilstrømning øges markant af Simvastatin i HepG2 celler efter 12, 18 eller 24 h behandlinger (D). Data er mean±SEM. N = 6 wells/gruppe. Data er repræsentative for 2 eller 3 uafhængige forsøg. p < 0,0001 ved hjælp af to-vejs ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig5.jpg"> Figur 5 . Reducerede LDL tilstrømning i hepatocellulært carcinom (HepG2) celler af LDL optagelse-sænkende middel, Dynasore. Repræsentative billeder i fase- og røde objektet for HepG2 celler er afbildet på 0,33 h (venstre paneler) og 4,33 h slutpunkt (højre paneler) Vis sund status af celler. 40 µM Dynasore, kendt for at reducere LDL-kolesterol udbredelse, blev anvendt som positiv kontrol (C). Billeder blev taget på 10 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig5large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig6.jpg"> Figur 6 . Reducerede LDL tilstrømning i menneskelige renal tubulær (HK2) epitelceller af LDL optagelse-sænkende stoffer, Dynasore og rPCSK9. Repræsentative billeder i fase- og røde objektet for HK2 celler afbildet på 0,33 h (venstre paneler) og 4,33 h slutpunkt (højre paneler) Vis sund status af celler. 40 µM Dynasore (C), eller 10 µg/mL rPCSK9 (D), kendt for at reducere LDL kolesterol udbredelse, blev anvendt som positiv kontrol. Billeder er taget på 10 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig6large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig7.jpg"> Figur 7 . Reducerede LDL tilstrømning i menneskelige koronararterie endotelceller (HCAECs) af LDL optagelse-sænkende middel, Dynasore. Repræsentative billeder i fase- og røde objektet for HCAECs afbildet på 0,33 h (venstre paneler) og 4,33 h slutpunkt (højre paneler) Vis sund status af celler. 40 µM Dynasore, kendt for at reducere LDL-kolesterol udbredelse, blev anvendt som positiv kontrol (C). Billeder blev taget på 10 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm. Data er mean±SEM. N = 6 wells/gruppe. Data er repræsentative for 2 eller 3 uafhængige forsøg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58564/58564table1.jpg"> Tabel 1: forarbejdning Definition parametre. Disse parametre er specifikke for den analyse, der anvendes i denne protokol. Parametrene bør sættes op til at analysere røde område i den røde kanal og området i cellen i den fase kanal. Parameterindstillinger for HepG2, HK2, HCAE cellelinjer præsenteres.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/58564/58564table2.jpg"> Tabel 2: procentvis ændring i LDL tilstrømning HepG2, HK2 og HCAE behandlet med Dynasore, rPCSK9 eller Simvastatin på 4,3 h. (A) HepG2 celler, (B) HK2 celler, (C) HCAE celler og (D) HepG2 celler.

Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

Denne protokol giver en effektiv tilgang til måling af LDL kolesterol optagelse med realtid tilstrømning priser ved hjælp af en levende celle imaging system i forskellige celletyper. Denne teknik giver en platform til at screene den farmakologiske aktivitet af forbindelser der påvirker LDL tilstrømning under kontrol for celle morfologi og dermed potentielle cytotoksicitet.

LDL-kolesterol optagelse Assay ved hjælp af levende celle Imaging analyse med celle sundhedsovervågning

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Vi præsenterer en metode til live billede analyse af LDL kolesterol optagelse i forskellige menneskelige celletyper. Dette gør det muligt at screene for forbindelser, at ændre transport af LDL kolesterol. Den største fordel ved at bruge levende celle billeddannelse til LDL tilstrømning kvantificering, er, at det giver mulighed for overvågning celle morfologi i hele analysen varighed, så potentielt de giftige forbindelser kan påvises.Til at begynde, aspirere medierne ud af de tidligere forberedte celler, og vask cellerne med 5 milliliter af Dulbecco's fosfat buffered saltvand. Aspirate the DPDS. Ud over at løsne cellerne fra 100 millimeter skålen, tilsættes 1,5 milliliter 0,25%Trypsin-EDTA til HepG2 cellerne, og tilsæt 1,5 milliliter 0,05%Trypsin-EDTA-opløsning til HK2-cellerne eller HCAECs.Inkuber pladerne ved 37 grader celsius i fire minutter. Derefter neutralisere Trypsin ved at tilføje 3 milliliter komplette medier til HepG2 og HCAEC celler. Brug 3 milliliter af Trypsin neutraliserende opløsning, kompromittere DPDS med 5% føtal kvæg serum eller FBS for HK2 celler.Cellerne overføres til 15 milliliter koniske rør, hvorglasset centrifugeres ved 250 g i fem minutter. Efter spin, aspirere medierne, og resuspend cell pellet i komplette medier. Cellerne opvarmes forsigtigt gennem en 40 mikron mesh si til at bryde op celle klumper.Tæl cellerne og plade dem i en optimeret tæthed i en 24-brønd plade. Inkuber pladen natten over ved 37 grader celsius for at tillade cellerne at fastgøre. Den næste dag, ændre cellemediet til basismediet uden FBS for cellelinjen, plus 5%lipoprotein mangelfuld serum, eller 2% FBS medier.Brug 500 mikroliter af det samlede medie pr. brønd i en 24-brøndplade. Fortsæt derefter inkubationen i 24 timer for at sulte cellerne. Sammen med sulttrinnet eller den følgende dag kan celler behandles med ønskede forbindelser og passende kontroller.24 timer efter sult tilsættes 5 mikroliter pHrodo rød mærket LDL til hver brønd, der indeholder 500 mikroliter af medier for at opnå en endelig koncentration på 10 mikrogram pr. milliliter. Fjern forsigtigt eventuelle bobler fra brøndene. Umiddelbart efter tilsætning af den mærkede LDL, skal pladen i levende celleanalysesystem inkubator og lade pladen ækvilibrere i 15 minutter for at reducere kondens i pladen.Mens cellerne inkuberes, skal du åbne softwaren og planlægge scanningen ved at tilføje beholderen, der holder pladen. Billede 16 billeder pr godt, tilføje en time intervaller ved 10x forstørrelse i fire timer ved hjælp af den røde og fase kanaler. Opret derefter et pladekort, der skal bruges til databehandling, vælg fanen Egenskaber, og vælg pladekortet.Indtast celletypen i cellefanen og behandlingerne i den sammensatte hane. Klik derefter på fanen Områder, vælg hvert sæt replikerer, og tildel områder. Når en forsøgskørsel er fuldført, skal du oprette et billedsæt i softwaren for at træne computeren til at kvantificere hver parameter, der er inkluderet i optællingssættet.Åbn pladevisningen i softwaren, og vælg derefter opret eller føj til billedsamling i feltet analysejobværktøjer. Vælg ny billedsamling, skriv et navn til billedsamlingen, og vælg de røde kanaler og fasekanalerne ved at markere felterne ud for kanalerne. Vælg yderligere fem billeder fra forskellige brønde og tidspunkter, og føj dem til billedsamlingen ved at føje dem til den aktuelle billedsamling.Vælg ny behandlingsdefinition i feltet analysejobværktøjer, vælg billedsamlingen i rullemenuen, indtast parametrene for celletypen. Brug rullemenuen i eksempelfeltet til at vælge eksempel på alle. Markér sammenløbsmasken og maskefelterne med røde objekt i feltet Analysemaske for at få vist det område, der er inkluderet i analysen for behandlingsdefinitionen.Rul gennem billedsamlingen for at sikre, at cellerne og LDL er inkluderet i masken. Vælg fil, og gem behandlingsdefinitionen. Åbn derefter eksperimentvisningen for at analysere sættet af billeder fra det eksperimentelle løb.Vælg start nyt analysejob i feltet analysejobværktøjer, og vælg definitionen af gemt behandling. Navnd analysejobbet, vælg tidsintervallet for analyse, og fremhæv de eksperimentelle brønde, der skal analyseres. Vælg startknappen.Når analysejobbet er fuldført, skal du eksportere dataene, vælge den færdige analyse og pressevisningen. Vælg eksport af metrikagraf i menuen hjælpeprogrammer. Vælg alle brønde i menuen i områder, og vælg replikerer i gruppemenuen for at opnå middelværdien for hvert sæt brønde som en gruppe.Og for at eksportere de enkelte værdier for hver brønd, skal du vælge ingen. Vælg den samlede integrerede intensitet for det røde objekt i menuen metriske røde objekter. Vælg dataeksportknappen.Kontroller, at data opdeles i individuelle billeder. Dataene kopieres automatisk i en udklipsholder og kan indsættes i en ny regnearksfil. Vælg sammenløbet i menuen faseobjektmetrikværdi, og klik derefter på dataeksportknappen.Under promptfanen skal du kontrollere opdele data i individuelle billeder. Dataene kopieres automatisk i en udklipsholder og kan indsættes i regnearksfilen, der indeholder integrerede intensitetsdata for det samlede røde objekt. Nu kan de eksporterede data normaliseres i henhold til trin 4.1.7 og 4.1.8 i protokollen for at opnå en endelig LDL-optagelsesværdier.Efter behandling med Dynasore eller rekombinant PCSK9, alle tre testede menneskelige cellelinjer viste betydelige reduktioner i LDL tilstrømning over en fire timers tidsforløb. Tilstrømningen af LDL reduceret i humane leverkarcinom eller HepG2-celler med behandling af Dynasore i løbet af tidsforløbet sammenlignet med de celler, der blev behandlet med DMSO som kontrol. Levende cellebilleddannelse af LDL-tilstrømningen i HepG2-celler på forskellige tidspunkter viste en markedsstigning i LDL-optagelsen efter behandling med Simvastatin, der understøtter følsomheden af denne metode til at opdage signifikante ændringer i LDL-tilstrømningen.Realtidsbilleder, der undersøges på det første tidspunkt og det endelige slutpunkt, bekræfter cellernes normale morfologi efter behandling med Dynasore, hvilket indikerer effektiviteten og sikkerheden af dette stof. Efter at have tilføjet yderligere rød mærket LDL til cellerne for at bevare det fluorescerende aktivitet, er det vigtigt at beskytte pladen fra lys, indtil det er placeret i levende celle billeddannelse system inkubator. Celler fra forskellige organer kan reagere forskelligt på behandlinger, hvilket betyder i modsatte retninger, eller de kan reagere i samme retninger, men viser forskellige satser for ændring i kolesterol optagelse.Kun med levende cellebilleddannelse kan sådanne forskelle påvises og kvantificeres nøjagtigt.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Bestemmelse af pattedyr celletal, celler og deres størrelse sundhedstilstand ved hjælp af Moxi Z Mini automatiseret celletæller

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging af proteinaggregering i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lev Imaging Assay for at vurdere de roller Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Og sphingomyelinase i reparation af poredannende Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytologiske Analyse af Spermatogenese: Levende og Faste Tilberedt<em&gt; Drosophila</em&gt; Testikler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selektive GPCR Konformationer målt med FRET sensorer i en Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Undersøgelse af Protein Kvalitetskontrol System af<em&gt; D. discoideum</em&gt; Brug Temperatur-kontrollerede Live-Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Automatiseret produktion af humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kortikale og dopaminerge neuroner med integreret Live-Cell Overvågning

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Dynamisk cellebilledbehandling i superopløsning af undercellulære strukturer

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...