Name: ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring
Uploaded: 2018-11-17T14:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan LAS: National Institute of Health (R56HL132209 en 1R01HL140468) en het onderzoeksinstituut voor hart van Miami. KY is een ontvanger van de American Heart Association predoctoraal Fellowship (18PRE33960070). HepG2 cellen werden beschikbaar gesteld door Dr Emmanuel Thomas, Universiteit van Miami-Miller School van geneeskunde46,47,48.

1. het zaaien van cellen in een 24-well-Plate
<ol><li>Media uit de cellen gecombineerd, wassen van de cellen met 5 mL van Dubelco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (dPBS) en de dPBS gecombineerd. Voor HepG2 cellen in een schotel van 100 mm, gebruik van 0,25% 1,5 mL trypsine/EDTA, en voor HK2 cellen of HCAECs met 1,5 mL trypsine/EDTA-oplossing 0,05% los van de cellen.</li>
	<li>Incubeer de plaat in een incubator 37 ° C gedurende 4 minuten of totdat de cellen zijn vrijstaand. Neutraliseer trypsine na een incubatie van 4 minuten door toevoeging van 3 mL van volledige media voor HepG2 en HK2 of 3 mL trypsine neutraliseren van oplossing, dPBS plus 5% foetale runderserum (FBS), voor HCAEC cellen.</li>
	<li>Breng de cellen in 15 mL conische buizen en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min, gecombineerd de media en resuspendeer de pellet cel in volledige media.</li>
	<li>Filtreer de celsuspensie zachtjes door een zeef mesh 40 μm te breken cel klontjes. De cellen niet door de zeef wassen.</li>
	<li>Cellen tellen en ze op een geoptimaliseerde dichtheid plaat. Bijvoorbeeld leiden 5.000 cellen per putje van HepG2 cellen of 10.000 cellen per putje van HK2 cellen of HCAECs in een 24-well-plate tot optimale resultaten.</li>
	<li>Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C om de cellen te koppelen.</li>
	<li>De volgende dag, wijzigt de cel media als u wilt baseren van media voor de cellijn (zonder FBS) plus 5% Lipo-eiwit tekort Serum (LPDS) of laag (2%) FBS media afhankelijk van de behandeling (zie 1.7). Vervolgens blijven incubatie gedurende 24u de cellen verhongeren. Gebruik 500 μL van totale media per putje in een 24-well-plate.</li>
	<li>De cellen in één van drie manieren behandelen: toevoegen van 10 µg/mL rPCSK9 (of voertuig) en de cellen aan de incubator van de 37 ° C gedurende 1 uur, 40 µM van Dynasore hydraat (of voertuig, dimethylsulfoxide) toevoegen en de cellen terug te keren naar de incubator 37 ° C gedurende 10 minuten terug te keren , of Voeg 1 µM simvastatine (of voertuig, dimethylsulfoxide) en de cellen terug te keren naar de 37 ° C incubator voor 12, 18 of 24 uur. Gebruik van media met 5% LPDS voor rPCSK9 of Dynasore behandelingen. Gebruik laag (2%) FBS media of media met 5% LPDS simvastatine behandelingen. Opmerking: Behandeling van de cellen met de gewenste verbindingen kan worden gedaan op het moment van media wijzigen voor de hongerdood van lipoproteïne (stap 1.6) voor experimenten op lange termijn, of vóór de analyse voor korte termijn experimenten. U kunt ook kunnen aangepaste behandeling tijden op basis van het type en het doel van de experimenten worden gekozen.</li>
	<li>Voeg vervolgens 5 µL van pHrodo rood gemerkte LDL (1 mg/mL stockoplossing) toe aan elk putje te verkrijgen van een eindconcentratie van 10 µg/mL. Verwijder alle bubbels daarna, voorzichtig de putjes.</li>
</ol>2. levende cel analyse
<ol><li>Onmiddellijk na het toevoegen van de gelabelde LDL, plaatst u de plaat in de levende cel analyse systeem incubator (Zie Tabel van materialen) en laat de plaat naar equilibreer gedurende 15 minuten om condensatie in de plaat.</li>
	<li>In de tussentijd, open de software en de scan te plannen door het vaartuig bezit van de plaat toe te voegen. Afbeelding 16 beelden per putje op 10 X voor 4 uur met de kanalen rood en fase intervallen 1 uur.</li>
	<li>De plattegrond van een plaat te gebruiken voor verwerking van de gegevens maken.<ol>
<li>Klik op de tab Eigenschappen Kies de plaat kaart. Ingang van het celtype en behandelingen in het tabblad verbindingen .</li>
		<li>Klik op het tabblad van de regio's , selecteer elke set wordt gerepliceerd en opslaan als regio's.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analyseparameters instellen
<ol><li>Zodra een experimentele run voltooid is, maakt u een afbeelding instellen in de software naar de computer te kwantificeren van elke parameter opnemen in het tellen van de trein.<ol>
<li>In de software, opent u de weergave van de plaat in het vak Analyse baan Utilities en kies vervolgens maken of toevoegen aan de foto collectie.</li>
		<li>Nieuwe foto collectieselecteren, typ een naam voor de foto-collectie en de kanalen rood en fase door het controleren van de selectievakjes in naast de kanalen kiezen.</li>
		<li>5 meer foto's te selecteren en toevoegen aan foto collectie door toe te voegen aan de huidige afbeelding-collectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Een definitie van verwerking voor de cellen maken. Tabel 1 bevat de parameters voor de cel van het HepG2, HK2 en HCAE verwerking van definities voor deze LDL toestroom protocol.<ol>
<li>Kies in het vak Analyse baan Utilities Nieuwe definitie van de verwerking. Kies de foto-collectie met de naam in stap 2.1.2 van de drop-down menu. Voer de parameters voor het soort cellen uit tabel 1.</li>
		<li>Gebruik de drop-down menu om te selecteren Alle Previewin het voorbeeldvak.</li>
		<li>Controleer in het vak Analyse masker Rood Object masker vakken en de Samenvloeiing masker om het gebied opgenomen in de analyse voor de verwerking definitie weer te geven. Zie Figuur 1.</li>
		<li>Blader door de foto-collectie om ervoor te zorgen dat de cellen en LDL zijn opgenomen in het masker. Selecteer bestand en Opslaan van de definitie van de verwerking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het analyseren van de reeks beelden van de experimentele run.<ol>
<li>Open het experiment in plaat weergave. Kies in het vak Analyse baan Utilities Lanceren nieuwe analyse baan. Selecteer de opgeslagen verwerking definitie.</li>
		<li>Naam van de analyse-baan, kies het tijdsbereik voor analyse en markeer de experimentele putten te analyseren. Klik op de knop starten .</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analyse en verwerking van gegevens
<ol><li>Zodra de analyse-uptaak voltooid is, moet u de gegevens exporteren:<ol>
<li>Selecteer de voltooide analysis en druk op bekijken. Kies Metrisch/grafiek exporterenin het menu hulpprogramma's .</li>
		<li>In de regio's -menu, kies Alle putjes, en in het menu groep om te krijgen de gemiddelde waarden voor elke set van putten als een groep kies wordt gerepliceerd en voor het exporteren van de individuele waarden van elk putje Kies geen.</li>
		<li>Kies in het menu rood Object metrisch de Totale rood Object geïntegreerde intensiteit (RCU x µm2/image). Deze parameter geeft de som van de tijd rood signaal intensiteit (in RCU) op het gebied van het rode signaal (in µm2) in alle afbeeldingen in elk putje, die correspondeert met de totale LDL ICT door de cellen.</li>
		<li>Klik op de knop Gegevens exporteren . Controleer gegevens opsplitsen in afzonderlijke beelden. De gegevens automatisch gekopieerd op een Klembord en kan worden geplakt in een nieuwe spreadsheet-bestand.</li>
		<li>Kies in het menu fase Object metrisch de Confluence (procent). Controleer gegevens opsplitsen in afzonderlijke beelden. Klik op de knop Gegevens exporteren . De gegevens automatisch gekopieerd op een Klembord en kan worden gekopieerd naar het werkbladbestand dat totale rood Object geïntegreerde intensiteit gegevens bevat.</li>
		<li>De omzetting van de percentage samenvloeiing van toepassing op totale oppervlakte met de volgende vergelijking. Total fase gebied (µm2/image) = Confluence (%) × (hoogte van de afbeelding (Pixels) × resolutie) × (de breedte van de afbeelding (Pixels) × resolutie) Opmerking: de samenvloeiing (%) parameter geeft aan de percentage samenvloeiing van de fase-oppervlakte per beeld dat overeenkomt met het gebied van de cellen in elk putje. Deze statistiek moet worden omgezet in de totale fase gebied voor elk individu beeld eens geëxporteerd. De afbeelding specificaties voor fase kanaal (afbeeldingshoogte, breedte en resolutie) moet worden gebruikt met de bovenstaande formule voor elk experimenteel vaartuig kunnen worden gevonden door te verwijzen naar Eigenschappen van het vaartuig onder Afbeelding kanalen.</li>
		<li>Normaliseren totale rood Object geïntegreerde intensiteit aan de oppervlakte van de fase als berekende in 4.1.6 met behulp van de volgende formule voor elke afzonderlijke afbeelding te elimineren van de variabiliteit in de celdichtheid in de putjes.<ol>
<li>Verdeel de totale rood Object geïntegreerde (RCU x µm2/image) intensiteitswaarden van elke afbeelding door de overeenkomstige Fase oppervlakte (µm2/image) om LDL opname (RCU) waarden per beeld te verkrijgen.</li>
			<li>Vervolgens, gemiddelde de LDL opname (RCU) gegevens van alle beelden van elk putje te verkrijgen van de gemiddelde LDL-opname in elk putje en dan gemiddelden de LDL opname van alle de repliceren putten groep middelen te verkrijgen. Deze gegevens zijn de resultaatwaarden van de LDL-opname en kan worden gebruikt voor illustratie en statistische analyse met behulp van de software van keuze.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In het huidige protocol, we laten zien op het gebruik van levende cellen imaging als een nieuwe en effectievere methode voor het meten van real-time LDL opname in een tijdsverloop in verschillende menselijke cellijnen. Menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen worden vaak gebruikt in studies screening voor cholesterol-verlagende therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Daarom kozen we dit celtype voor het testen van het vermogen van een levende cel imaging systeem voor LDL toestroom studies. Onze resultaten wijzen erop dat HepG2 cellen verenigbaar zijn met deze nieuwe techniek en het resultaat in een bocht van de sigmoid-achtige continu LDL-opname voor de duur van de toestroom bepaling die aangeeft tot 4.33 h als het definitieve eindpunt (figuur 2A en Figuur 3 ).
Homeostase van cholesterol speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van verschillende nephropathies. Inderdaad, cholesterol accumulatie in renal weefsel is een belangrijke bijdrage aan de renale fibrose leiden tot chronische nierziekte en is een grote pathologie in verschillende nephropathies28,29,30,31. Vandaar, wij onze methode in menselijke renale epitheliale cellen van de (HK2) onderzocht als een populaire en betrouwbare cellijn gebruikt op het gebied van Nefrologie. Onze gegevens ondersteunde ook de haalbaarheid van de levende cel imaging systeem voor het meten van LDL toestroom in HK2 cellen. Zoals afgebeeld in Figuur 2B, pakte HK2 cellen LDL cholesterol lineair gedurende de looptijd van de toestroom studie (4 uur).
Vanwege het belang van het metabolisme van cholesterol in de ontwikkeling en de progressie van aderverkalking32,33,41, de belangrijkste oorzaak van hart-en vaatziekten, die op zijn beurt de nummer 1 moordenaar wereldwijd is 42, we gericht op het valideren van onze werkwijze in een atherosclerose-relevante celtype. We gebruikten menselijke coronaire arteriële endotheliale cellen (HCAECs), zoals dit een van de eerste celtypen zijn te worden blootgesteld aan een belediging van de cholesterol in het lumen van de kransslagader van een patiënt van atherosclerose. Onze gegevens weergegeven in Figuur 2C geeft aan dat deze LDL toestroom methode ook effectief met HCAECs werkt. De resulterende grafiek is een sigmoid-achtige kromme vergelijkbaar met die van HepG2 cellen.
Om te testen op de geldigheid en de gevoeligheid van deze verbeterde LDL toestroom assay voor het screenen van stoffen beïnvloeden de opname van de LDL-cholesterol, gebruikten we drie besturingselementen, LDL opname-verlagende agenten Dynasore en rPCSK9 en LDL toestroom activator simvastatine. Hier, we de bovenstaande getrakteerd cellijnen (HepG2, HK2 en HCAECs) met geoptimaliseerde concentraties van Dynasore of rPCSK9 voorafgaand aan de toestroom bepaling vermeld. Onze resultaten toonden dat alle drie geteste cellijnen gereageerd op de behandelingen met aanzienlijke verlagingen in de LDL instroom in een 4-uur loop (Figuur 2). Bijvoorbeeld bij 4.33 h als het punt van de laatste keer, behandeling met Dynasore op 40 µM aanzienlijk verminderd LDL toestroom in HepG2 cellen, HK2 cellen en HCAECs door 53, 68% tot 54%, respectievelijk (p < 0,0001; Figuur 2 A-C en Tabel 2A-C). Daarnaast rPCSK9 bij 10 µg/mL veroorzaakt een duidelijke vermindering van 55% in LDL toestroom in HK2 cellen (p < 0,0001; Figuur 2 B en tabel 2B). Onze bevindingen bleek bovendien dat behandeling van HepG2 cellen met Simvastatin in een aanzienlijke stijging LDL opname (Figuur 3) resulteerde, ter ondersteuning van de gevoeligheid van deze methode voor het detecteren van belangrijke wijzigingen in de LDL-instroom. Studies van behandeling met rPCSK9 in HepG2 en HCAEC cellen zijn niet opgenomen in dit protocol als rPCSK9 wordt gebruikt als een extra controle behandeling met goed gedocumenteerde resultaten, maar is duur om te kopen in kleine hoeveelheden. RPCSK9 werd daarom alleen gebruikt voor het valideren van dit protocol in HK2 cellen.
Levende cel imaging analyse, samen met de functionele en tijdige meting van LDL toestroom, toegestaan voor het continue monitoring van de gezondheid en de morfologie van de cellen. Dit voordeel kan efficiënt mogelijke cytotoxiciteit van de toegepaste verbindingen, waardoor deze methode een ideale techniek voor gelijktijdig toezicht farmacologische activiteit en cytotoxiciteit detecteren. Cijfers 5-7 illustreren representatieve beelden van de drie geteste cellijnen aan het definitieve eindpunt (4.33 h) als een visuele referentie voor het effect van de behandelingen op de netto instroom van de LDL en toont ook de gezonde morfologie van de cellen na de geteste behandelingen. Wij raden de visuele inspectie van alle afbeeldingen van elk putje te verzekeren van de Heide morfologie van de cellen voor de duur van de studie. Bijvoorbeeld in de gegevens niet weergegeven, wanneer de beelden van HepG2 cellen met 80 μM behandeld Dynasore werden geïnspecteerd, we aanwijzingen van mobiele-detachement waargenomen zoals de randen van de cellen leek te worden opstijgen van de plaat, suggereren mobiele-Detachement bij de hogere concentraties van Dynasore. Bovendien, hoge concentraties van simvastatine (3-10 μM) ook geleid tot een gewijzigde morfologie die aangeeft veroorzaakte apoptosis zoals gemeld voor hoge doseringen van statines45. Dit protocol werd gebruikt voor het uitvoeren van een titratie van de behandeling van de Dynasore bij 20-80 μM, en Simvastatin bij 0.5-10 μM concentratie, waarna de cel-beelden werden gebruikt voor het analyseren van de gezondheid van de cellen en bepalen potentiële ctotoxicity van de behandelingen op verschillende concentraties. Resultaten voorgesteld het gebruik van 40 μM voor Dyansore en 1 μM voor simvastatine als optimale concentraties.
Tot slot, is het raadzaam een cel dichtheid titratie studie uitvoeren als een andere cellijn wil met deze methode worden getest teneinde de optimale celaantal per putje om consistente resultaten te verkrijgen. Onze cel dichtheid optimalisatie studie toonde aan dat 10.000 cellen per putje in een 24-well-plate tot consistente resultaten van de toestroom van de LDL voor HK2 en HCAE cellen leiden. Het is belangrijk op te merken dat voor deze LDL toestroom assay met behulp van levende cellen imaging systeem, een monolayer van niet-heuvels cellen gelijkmatig verdeeld op de putten wenselijk is aangezien bosjes van cellen aanleiding tot fouten in de genormaliseerde LDL toestroom resultaatwaarden geven kunnen. De reden hiervoor is dat voor de normalisatie van de gegevens van de toestroom, de fase-objectgebied wordt gebruikt als een maatregel van de celdichtheid en deze parameter nadelig kan worden beïnvloed wanneer cel bosjes worden gevormd. We hebben vastgesteld dat cellen van de HepG2 hebben de neiging om vorm bosjes wanneer ontpit op dichtheid hoger dan 5.000 cellen per putje waardoor inconsistente toestroom resultaten; Dus, we gebruikten 5.000 cellen per putje in een 24-well-plate als optimale dichtheid voor HepG2 cellen.
Collectief, biedt onze methode een medium tot hoge doorvoer-platform voor het screenen van de farmacologische activiteit en de cytotoxiciteit van verbindingen LDL toestroom gelijktijdig te reguleren. Deze methode kan worden gemakkelijk aangepast voor gebruik met andere fluorescently-geëtiketteerden liganden die worden ingevoerd door de lysosomale compartiment te evalueren ligand opname in real-time. Terwijl dit protocol biedt specificaties voor InCucyte leven beeldvorming en analysesysteem, het protocol kan worden aangepast voor alternatieve imaging systemen zoals Cellomics.

De LDL Low Density Lipoprotein LDLR Receptor-gemedieerde endocytose is een belangrijk gebied van studie, aangezien circulerende LDL-cholesterol waarden de kern van hart-en vaatziekten1, nier ziekte2 evenals een verscheidenheid van inflammatoire vormen 3 van de ziekten en genetische aandoeningen met mutaties in cholesterol vervoeren genen4,,5,,6,7. Studies in LDLR-gemedieerde cholesterol toestroom hebben geleid tot de identificatie van meerdere onderzoek-hulpprogramma's, zoals Dynamin-remmers waaronder de chemische Dynasore8,9,10, evenals LDL-regulering eiwitten zoals Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9)11,12.
De LDL-LDLR endocytose traject begint met het vastleggen van de LDL-LDLR-complex op het celoppervlak in clathrin beklede kuilen13. Blaasjes worden dan gevormd door invagination van de oppervlakte celmembraan internalisering van de LDL-LDLR-complex in de vacuolen voor transport binnen de cel. Aangezien de gevormde vesikel in vroege en vervolgens late Endosomen rijpt, druppels de pH in de late endosome, veroorzaakt door scheiding van het LDL uit de receptor14. In het verleden, zijn de methoden van kwantificering van LDL toestroom afhing van radio-geëtiketteerden 125-LDL co incubatie met cellen en latere extractie van de radioactief gemerkt proteïne uit cellen voor kwantificering15. Dit werd vervolgens vervangen door het gebruik van fluorescently geëtiketteerde LDL eiwitten zoals DiI-LDL, en latere immunokleuring of extractie van eiwitten voor fluorescerende lezingen met een spectrofotometer of plaat lezer15,16. Fluorescently geëtiketteerd is LDL ook gebruikt in fluorescentie-activated cell sorting (FACS) voor analyse van internalisering van de LDL en cel oppervlakte LDL bindende17. Terwijl deze methoden toestaan voor het verzamelen van gegevens na de behandeling, is toezicht op de levensvatbaarheid van de cellen tijdens de behandeling niet mogelijk.
De zure pH in de late endosome maakt het gebruik van een pH-geactiveerde fluorescerende LDL sonde zoals pHrodo Red LDL die na internalisering18,19 fluoresceert. Deze eigenschap zorgt voor een continue tijdsverloop van LDL opname beoordeling in levende cellen. Dit protocol maakt daarom gebruik van pHrodo Red-LDL fluorescentie imaging in een levende cel analyse naar serieel maatregel LDL opname met gelijktijdige monitoring voor de gezondheid van de cel. De resultaten geven de betrouwbaarheid van deze nieuwe techniek als getest in een vier uur durende tijdsverloop in drie verschillende menselijke cellijnen, menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen, menselijke renale epitheliale cellen van de (HK2) en menselijke coronaire arteriële endotheliale cellen (HCAEC ). Deze cellijnen zijn klinisch significante LDL klaring20,21,22,23,24,25,26,27 , nier ziekte28,29,30,31, en hart-en vaatziekten32,33, respectievelijk. Naast het controleren van de LDL-instroom, neemt dit protocol behandeling met twee bekende remmers van de opname van het LDL, Dynasore hydraat en recombinant PCSK9 eiwit, alsmede een statine inductor van LDLR meningsuiting en LDL opname, simvastatine. Dynasore en recombinant PCSK9 elk werken via verschillende wegen te verminderen LDL opname.
Dynasore is een klein molecuul inhibitor van Dynamins10 en LDL opname vermindert door het blokkeren van clathrin-afhankelijke endocytose van LDL-LDLR complex10,34. Recombinant PCSK9, aan de andere kant, is een lid van peptidase S8 familie die bindt aan LDLR en remt de recycling naar het celoppervlak na het loslaten van LDL van de verinnerlijkte complex door het blokkeren van de vereiste conformationele veranderingen35,36 . Verminderde oppervlakte LDLR celdichtheid leidt uiteindelijk tot lagere LDL opname door de cel. Statines, zijn terwijl het direct blokkeren van de 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym (HMG-CoA) reductase enzymen en dus de biosynthese van cholesterol, ook bekend te upregulate de expressie van LDLR25,38 leidt tot verhoogde LDL opname. De gevoeligheid van dit protocol is gevalideerd door het detecteren van aanzienlijke vermindering in LDL toestroom in drie klinisch relevante menselijke cellijnen, HK2, HepG2 en HCAECs, door Dynasore en/of recombinant PCSK9, en een duidelijke stijging van de LDL opname in de cellen van de HepG2 door Simvastatine in een vier uur durende tijd cursus met monitoring voor cell morfologie/gezondheid. Tezamen, biedt deze methode een platform voor medium tot hoge doorvoersnelheid om gelijktijdig te screenen de farmacologische activiteit en de cytotoxiciteit van verbindingen regulering van LDL opname in levende cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="760">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:281px;">pHrodo Red-LDL</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:149px;">L34356</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HepG2 cells</td>
			<td>E. Thomas Lab, U. Miami</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FBS</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>FP-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Keratinocyte SFM media kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Primary Coronary Artery Endothelial Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Vascular Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Endothelial Cell Growth Kit-VEGF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Human Lipoprotein Deficient Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-999-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">40 &#956;M mesh cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan Blue Staining (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Incucyte Zoom</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Zoom</td>
			<td>Imaging and analysis platform</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dynasore Hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">PCSK9 Recombinant Protein</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring

De regulering van de LDL cholesterol opname via LDLR-gemedieerde endocytose is een belangrijk gebied van studie in verschillende grote pathologieën waaronder stofwisselingsziekte, hart-en vaatziekten en nieraandoeningen. Op dit moment is er geen beschikbare methode te beoordelen LDL opname terwijl tegelijkertijd toezicht op voor de gezondheid van de cellen. De huidige studie presenteert een protocol, met behulp van een levende cel imaging analysesysteem, te verwerven van de periodieke metingen van LDL toestroom met gelijktijdige monitoring voor de gezondheid van de cel. Deze nieuwe techniek wordt in een vier uur durende tijdsverloop in drie menselijke cellijnen (hepatische, renale tubulaire epitheliale en coronaire slagader endotheliale cellen) getest. De gevoeligheid van deze techniek is bovendien gevalideerd met bekende LDL opname remmers, Dynasore en recombinant PCSK9 eiwit, alsook door een LDL opname promotor, simvastatine. Samen genomen, biedt deze methode een medium tot hoge doorvoer platform voor gelijktijdig screening farmacologische activiteit, alsmede het toezicht op de morfologie van de cel, vandaar cytotoxiciteit van verbindingen regulering van de toestroom van de LDL. De analyse kan worden gebruikt met verschillende beeldvormende systemen en analytische software.

Live cel Imaging zorgt voor een betrouwbare bewaking van Cell gezondheid tijdens Cholesterol toestroom Studies in drie menselijke cellijnen We gevalideerd onze assay in drie menselijke cellijnen die cholesterol homeostase verordening een grote pathofysiologische rol speelt, met inbegrip van menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen, menselijke renale epitheliale cellen van de (HK2) en menselijke coronaire endotheliale cellen (HCAECs). We een levende cel imaging systeem gebruikt voor het uitvoeren van de bepaling van de opname LDL in een tijdsverloop van 4 h met seriële metingen met tussenpozen van 1 h. Onze resultaten wijzen erop dat alle celtypes getest verenigbaar waren met deze nieuwe techniek en het resultaat in de bochten met de continu opname van de LDL vermelding voor de duur van de studie van de toestroom met 4.33 h als het definitieve eindpunt (afbeelding 2). De gegevens van de toestroom afgebeeld in Figuur 2 werden verkregen door het normaliseren van de totale pHrodo Red-geëtiketteerden LDL fluorescentie (totaal rood object geïntegreerd intensiteit per beeld in RCU x µm2/afbeelding) aan de cel totaal gebied in elke afbeelding van elk putje (fase objectgebied per beeld in µ m2/image) te elimineren van de variabiliteit in de celdichtheid in de putjes. Bovendien, voor het valideren van de gevoeligheid van de LDL toestroom test met het oog op de screening van verbindingen op het gebied van LDL cholesterol opname, we gebruikten twee positieve controles bekend dat remt LDL toestroom, Dynasore en rPCSK9, en een positieve controle bekend voor het opwekken van LDL opname, simvastatine. Gevalideerd door onze resultaten, na behandeling met Dynasore en rPCSK9, alledrie getest menselijke cellijnen (HepG2, HK2 en HCAEC) toonde aanzienlijke vermindering in LDL instroom over een tijdsverloop van 4 h (Figuur 2A-C). Figuur 2 ziet u bijvoorbeeld dat de toestroom van LDL is verminderd in HepG2 cellen met behandeling van de Dynasore in de tijdsverloop, in vergelijking met de cellen die zijn behandeld met DMSO; terwijl de DMSO als het voertuig besturingselement voor Dynasore controle geen significant effect op LDL toestroom in vergelijking met de onbehandelde controlegroep hadden. Bovendien, onze bevindingen toonde een duidelijke toename in LDL opname door cellen van de HepG2 na de behandeling met simvastatine (Figuur 3), ter ondersteuning van de gevoeligheid van deze methode voor het detecteren van belangrijke wijzigingen in de LDL-instroom. Over het punt 4.5 h tijd, dat een typische tijd in LDL opname studies is, is de toestroom van LDL aanzienlijk verminderd met ofwel Dynasore ofwel rPCSK9 behandeling en steeg met Simvastatin behandeling (Figuur 4).
Een groot voordeel aan het gebruik van levende cellen imaging voor LDL opname studies is dat dit systeem biedt real-time beelden van de cellen in elk putje die kunnen worden gebruikt om te controleren van potentiële cytotoxiciteit van de onderzochte verbindingen. 5-7 cijfers illustreren representatieve beelden van de drie cellijnen onderzocht bij de eerste tijd (0.33 h) en definitieve eindpunt (4.33 h) als een visuele referentie voor de netto instroom van de LDL. De beelden bevestigen de normale morfologie van de cellen na Dynasore of rPCSK9 behandelingen, met vermelding van zowel de doeltreffendheid en de veiligheid van deze verbindingen.
Levende cel analyse geeft betrouwbare seriële kwantitatieve Cholesterol toestroom metingen met diverse behandelingen
Een groot voordeel van het gebruik van dit protocol met een levende cel imaging systeem is de mogelijkheid om het verzamelen van gegevens in de tijdsverloop en vergelijk LDL toestroom op meerdere tijdstippen in plaats van slechts één punt van de laatste tijd zo traditioneel gedaan. Met behulp van dit protocol, we kunnen zijn voor de berekening van het percentage reductionin LDL toestroom op de RD Session Host tijdstip en op 1U tijdstippen gedurende het tijdsverloop. Tabel 2 geeft een overzicht van de verlaging van LDL toestroom in drie geteste menselijke cellijnen na voorbehandeling van het 10 min met 40 µM Dynasore of 1 h voorbehandeling met 10 µg/mL rPCSK9. 4.33 uur als het eindpunt van de definitieve studie, behandeling met Dynasore op 40 µM aanzienlijk verminderd LDL toestroom in HepG2 cellen, HK2 cellen en HCAECs door 53, 68% tot 54%, respectievelijk (Tabel 2A-C) en behandeling met rPCSK9 bij 10 µg/mL geleid tot 55% vermindering LDL instroom in de HK2 cellen (tabel 2B). Naast het kwantificeren van de terminal tijdstip zoals in traditionele testen, kunnen we een kwantitatieve analyses uit te voeren in de verlaging van de LDL toestroom als gevolg van behandeling op elk tijdstip van het experiment. Tabel 2B ziet u bijvoorbeeld dat behandeling met rPCSK9 in de HK2 cellen in een daling van LDL opname door 79% bij 1,33 h, 67% bij 2,33 h resulteerden, 59% bij 3,33 h behandeling in vergelijking met onbehandelde cellen post. Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor de kwantitatieve analyse van LDL instroom na de behandeling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig1.jpg"> Figuur 1 : Verwerking van definitie masker. Representatieve beelden van HK2 cellen worden afgebeeld na de toepassing van de definitie van de geschikte procédés (Zie tabel 1). AreHK2 cellen zonder (A), maskeren met fase-Maskapplied (B), weergegeven met rood Object masker is toegepast (C), of met zowel de fase en de rode Object maskers toegepast (D). Schaal bar = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig2.jpg"> Figuur 2 : Verlaging van het LDL opname met behulp van live cell imaging systeem over een tijdsverloop 4.33 h. Live cell analyse systeem wordt gebruikt voor het meten van LDL toestroom in menselijke hepatische carcinoom (HEPG2) cellen (A), menselijke renale tubulaire epitheliale (HK2) cellen (B) en menselijke coronaire de endotheliale cellen van de (HCAE) (C). De cellen werden behandeld met Dynasore (10 minuten vóór de run) of rPCSK9 (1 uur vóór de vlucht) als positieve controle. DMSO werd gebruikt als een voertuig voor Dynasore behandelingen. Positieve controles aanzienlijk daalde de LDL toestroom in alle 3 cellijnen. LDL toestroom waarden werden verkregen door het normaliseren van de intensiteit van de totale rood object geïntegreerd (RCUxµm2/image) naar de totale fase-objectgebied (µm2/image). Gegevens zijn mean±SEM N = 6 putten/groep. Gegevens zijn representatief voor 2 of 3 onafhankelijke experimenten. p < 0,0001 vs leeg, en ###p < 0,0001 vs DMSO, met two-way ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig3.jpg"> Figuur 3 . Stijging van de LDL-opname met behulp van levende cellen imaging systeem over een tijdsverloop 4.33h. Live cell analyse systeem wordt gebruikt voor het meten van LDL toestroom in menselijke hepatische carcinoom (HEPG2) cellen. LDL opname is aanzienlijk verhoogd na behandeling met simvastatine voor 12u (A), 18 h (B) of 24 h (C) gebruik van media met 2% FBS. De punt van de tijd 24 h werd ook uitgevoerd met media met 5% LPDS (zonder FBS). DMSO werd gebruikt als negatieve controle. LDL toestroom waarden werden verkregen door het normaliseren van de intensiteit van de totale rood object geïntegreerd (RCU x µm2/image) naar de totale fase-objectgebied (µm2/image). Gegevens zijn mean±SEM N = 6 putten/groep. Gegevens zijn representatief voor een onafhankelijke experiment. p < 0,0001 vs DMSO, met behulp van de Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig4.jpg"> Figuur 4 . Significante vermindering van de toestroom van de LDL door LDL opname-verlagende agenten op 4.3 h tijdstip. LDL toestroom is aanzienlijk verminderd in menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen (A), menselijke renale tubulaire epitheliale (HK2) cellen (B) en menselijke coronaire endothelial (HCAE) cellen (C) na behandeling met LDL opname remmers Dynasore voor 10 min of rPCSK9 voor 1 uur. LDL toestroom is aanzienlijk gestegen met simvastatine in HepG2 cellen na 12, 18 of 24 h behandelingen (D). Gegevens zijn mean±SEM N = 6 putten/groep. Gegevens zijn representatief voor 2 of 3 onafhankelijke experimenten. p < 0,0001 met two-way ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig5.jpg"> Figuur 5 . Verminderd LDL toestroom in hepatocellulaire carcinoom (HepG2) cellen door LDL opname-verlagende agent, Dynasore. Representatieve beelden van de fase-object en een rood object voor HepG2 cellen zijn afgebeeld bij 0.33 h (linker panelen) en het eindpunt van de 4.33 h (juiste panelen) tonen gezonde status van cellen. 40 µM Dynasore, bekend te verminderen LDL-cholesterol de opname, werd gebruikt als positieve controle (C). Beelden werden genomen bij 10 X vergroting. Schaal bar = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig6.jpg"> Figuur 6 . Verminderd LDL toestroom in menselijke renale tubulaire epitheliale (HK2) cellen door LDL opname-verlagende agenten, Dynasore en rPCSK9. Representatieve beelden van de fase-object en een rood object voor HK2 cellen afgebeeld bij 0.33 h (linker panelen) en het eindpunt van de 4.33 h (juiste panelen) tonen status in orde krijgt van de cellen. 40 µM Dynasore (C), of 10 µg/mL rPCSK9 (D), bekend om te verminderen LDL cholesterol opname, werden gebruikt als positieve controle. Images zijn geschoten op 10 X vergroting. Schaal bar = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig7.jpg"> Figuur 7 . Verminderd LDL toestroom in menselijke coronaire endotheliale cellen (HCAECs) door LDL opname-verlagende agent, Dynasore. Representatieve beelden van de fase-object en een rood object voor HCAECs afgebeeld bij 0.33 h (linker panelen) en het eindpunt van de 4.33 h (juiste panelen) tonen status in orde krijgt van de cellen. 40 µM Dynasore, bekend te verminderen LDL-cholesterol de opname, werd gebruikt als positieve controle (C). Beelden werden genomen bij 10 X vergroting. Schaal bar = 100 µm. gegevens zijn mean±SEM N = 6 putten/groep. Gegevens zijn representatief voor 2 of 3 onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58564/58564table1.jpg"> Tabel 1: definitie verwerkingsparameters. Deze parameters zijn specifiek voor het systeem van de analyse in dit protocol gebruikt. Parameters moeten worden ingesteld om rode gebied in het rode kanaal en het gebied van de cel in het fase-kanaal te analyseren. Parameterinstellingen voor HepG2, HK2, HCAE cellijnen worden gepresenteerd.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/58564/58564table2.jpg"> Tabel 2: percentage verandering in LDL toestroom in HepG2, HK2 en HCAE cellen behandeld met Dynasore, rPCSK9, of simvastatine 4.3 h. (A) HepG2 cellen, cellen (B) HK2, (C) HCAE cellen en (D) HepG2 cellen.

Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

Dit protocol biedt een efficiënte aanpak voor het meten van LDL cholesterol opname met real-time toestroom tarieven met behulp van een levende cel imaging systeem in verschillende celtypen. Deze techniek biedt een platform voor het scherm van de farmacologische activiteit van verbindingen op het gebied van LDL toestroom terwijl monitoring voor cel morfologie en vandaar potentiële cytotoxiciteit.

LDL Cholesterol opname Assay met behulp van levende cellen Imaging analyse met mobiele gezondheidsmonitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

We presenteren een methode voor live beeldanalyse van LDL cholesterol opname in verschillende menselijke celtypes. Dit maakt het mogelijk om te screenen op verbindingen, die het transport van LDL-cholesterol wijzigen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van live celbeeldvorming voor LDL influx kwantificering, is dat het mogelijk maakt monitoring celmorfologie gedurende de test duur, dus potentieel de giftige verbindingen kunnen worden gedetecteerd.Om te beginnen, aspirate de media uit de eerder voorbereide cellen, en was de cellen met 5 milliliter van fosfaat Dulbecco's gebufferde zoutoplossing. De DPDS aanzuigen. Voeg naast het loskoppelen van de cellen van de 100 millimeter schotel 1,5 milliliter van 0,25%Trypsin-EDTA voor de HepG2 cellen, en voeg 1,5 milliliter van 0,05% Trypsin-EDTA oplossing voor de HK2 cellen, of de HCAECs.Incubeer de platen op 37 graden celsius gedurende vier minuten. Neutraliseer vervolgens de Trypsin door 3 milliliter complete media toe te voegen voor de HepG2- en HCAEC-cellen. Gebruik 3 milliliter van de Trypsine neutraliserende oplossing, breng de DPDS in gevaar met 5%foetaal runderserum of FBS voor de HK2-cellen.Breng de cellen in 15 milliliter conische buizen, dan centrifugeren de buizen op 250g gedurende vijf minuten. Na de spin, aspirate de media, en resuspend de cel pellet in volledige media. Filter de suspensie van de cellen voorzichtig door een 40 micron mesh zeef om celklonen op te breken.Tel de cellen en plaat ze in een geoptimaliseerde dichtheid in een 24-well plaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 graden celsius om de cellen te hechten. De volgende dag, verander de cel media naar de basis media zonder FBS voor de cellijn, plus 5% lipoprotein tekort serum, of 2% FBS media.Gebruik 500 microliters van totale media per put in een 24-well plaat. Ga vervolgens 24 uur verder met de incubatie om de cellen te verhongeren. Samen met de hongerstap of de volgende dag kunnen cellen worden behandeld met de gewenste verbindingen en de juiste controles.Voeg 24 uur na de honger 5 microliter pHrodo rood gelabeld LDL toe aan elke put met 500 microliter media om een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter te verkrijgen. Verwijder voorzichtig eventuele bubbels uit de putten. Plaats de plaat onmiddellijk na het toevoegen van de gelabelde LDL in de incubator van het livecelanalysesysteem en laat de plaat gedurende 15 minuten equiliberen om condensatie in de plaat te verminderen.Terwijl de cellen uitbroeden, open de software en plan de scan door het vat dat de plaat vasthoudt toe te voegen. Afbeelding 16 beelden per put, voeg een uur intervallen op 10x vergroting voor vier uur met behulp van de rode en fase kanalen. Maak vervolgens een plaatkaart om te gebruiken voor gegevensverwerking, selecteer het tabblad Eigenschappen en kies de plaatkaart.Voer het celtype in het tabblad cellen en behandelingen in de samengestelde tik in. Klik vervolgens op het tabblad Regio's, selecteer elke set replica's en wijs regio's toe. Zodra een experimentele run is voltooid, maakt u een afbeeldingsset in de software om de computer te trainen om elke parameter in de telset te kwantificeren.Open in de software de plaatweergave en kies vervolgens in het vak analysetaakprogramma's maken of toevoegen aan de afbeeldingsverzameling. Selecteer een nieuwe afbeeldingsverzameling, typ een naam voor de afbeeldingsverzameling en kies de rode en fasekanalen door de vakjes naast de kanalen aan te vinken. Selecteer nog vijf afbeeldingen uit verschillende putten en tijdstippen en voeg ze toe aan de afbeeldingsverzameling door toe te voegen aan de huidige afbeeldingsverzameling.Kies in het vak hulpprogramma's voor analysetaak de optie nieuwe verwerkingsdefinitie, selecteer de afbeeldingsverzameling in het vervolgkeuzemenu en voert de parameters voor het type cellen in. Gebruik in het voorbeeldvak het vervolgkeuzemenu om een voorbeeld van alles te selecteren. Schakel in het vak analysemasker het samenvloeiingsmasker en de vakken van het rode objectmasker in om het gebied in de analyse voor de verwerkingsdefinitie weer te geven.Blader door de afbeeldingsverzameling om ervoor te zorgen dat de cellen en LDL in het masker zijn opgenomen. Selecteer bestand en sla de verwerkingsdefinitie op. Open vervolgens de experimenteerplaatweergave om de set afbeeldingen van de experimentele run te analyseren.Kies in het vak hulpprogramma's voor analysetaak de optie Nieuwe analysetaak starten en selecteer de opgeslagen verwerkingsdefinitie. Geef de analysetaak een naam, kies het tijdsbereik voor analyse en markeer de experimentele putten die u moet analyseren. Selecteer de startknop.Zodra de analysetaak is voltooid, exporteert u de gegevens, selecteert u de voltooide analyse en drukt u op de weergave. Kies in het menu hulpprogramma's de export van metrische grafieken. Kies in het menu regio's alle putten en in het groepsmenu om de gemiddelde waarde voor elke set putten als groep te verkrijgen, kiest u repliceert.En voor het exporteren van de individuele waarden voor elke put, kies er geen. Kies in het menu rode objectmetrische optie de totale geïntegreerde intensiteit van het rode object. Selecteer de knop Gegevens exporteren.Controleer de opsplitsende gegevens in afzonderlijke afbeeldingen. De gegevens worden automatisch gekopieerd op een klembord en kunnen worden geplakt op een nieuw spreadsheetbestand. Kies in het metrische menu faseobject de samenvloeiing en klik vervolgens op de knop Gegevensexport.Controleer op het tabblad Prompt de gegevens opsplitsen in afzonderlijke afbeeldingen. De gegevens worden automatisch gekopieerd op een klembord en kunnen worden geplakt op het spreadsheetbestand met totale geïntegreerde intensiteitsgegevens van rode objecten. Nu kunnen de geëxporteerde gegevens worden genormaliseerd, volgens de stappen 4.1.7 en 4.1.8 van het protocol, om een definitieve LDL-opnamewaarden te verkrijgen.Na behandeling met Dynasore of recombinant PCSK9 vertoonden alle drie de geteste menselijke cellijnen een aanzienlijke afname van de LDL-instroom gedurende een tijdscursus van vier uur. De LDL instroom verminderd in menselijk levercarcinoom of HepG2 cellen, met behandeling van Dynasore in de loop van de tijd, in vergelijking met de cellen behandeld met DMSO als een controle. Live celbeeldvorming van de LDL-instroom in HepG2-cellen op verschillende tijdstippen toonde een toename van de LDL-opname na behandeling met Simvastatine ter ondersteuning van de gevoeligheid van deze methode om significante veranderingen in de LDL-instroom te detecteren.Real-time beelden onderzocht op het eerste tijdstip en het eindpunt, bevestigen de normale morfologie van de cellen na de behandeling met Dynasore, wat de effectiviteit en de veiligheid van deze verbinding aangeeft. Na het toevoegen van verdere rode gelabelde LDL aan de cellen om het te behouden fluorescerende activiteit, is het belangrijk om de plaat te beschermen tegen licht totdat het wordt geplaatst in de live cel imaging systeem incubator. Cellen van verschillende organen kunnen anders reageren op behandelingen, wat betekent in tegengestelde richtingen, of ze kunnen reageren in dezelfde richtingen, maar tonen verschillende tarieven van verandering in cholesterolopname.Alleen met de live celbeeldvorming kunnen dergelijke verschillen worden gedetecteerd en nauwkeurig worden gekwantificeerd.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Bepaling van de zoogdieren bloedcellen, celgrootte en Health Met behulp van de Moxi Z Mini geautomatiseerde cel Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van<em&gt; D. discoideum</em&gt; Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Geautomatiseerde productie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale en dopaminerge neuronen met geïntegreerde live-cel monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...