Name: ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring
Uploaded: 2018-11-17T14:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים כדי בלאס: המכון הלאומי לבריאות (R56HL132209 ו- 1R01HL140468), מכון המחקר של הלב מיאמי. KY היא נמען האחווה האמריקאי הלב האגודה Predoctoral (18PRE33960070). תאים HepG2 נמסרו באדיבות מאת ד ר עמנואל תומאס, אוניברסיטת מיאמי-מילר הספר לרפואה46,47,48.

1. זריעת בתאים צלחת 24-ובכן
<ol><li>האחות מדיה את התאים, לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של Dubelco פוספט Buffered מלוחים (dPBS), וארוקן את dPBS. לשימוש HepG2 תאים בצלחת 100 מ מ, 1.5 מ של 0.25% טריפסין/EDTA, ולהשתמש עבור HK2 תאים או HCAECs 1.5 מ של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון כדי לנתק את התאים.</li>
	<li>דגירה את הצלחת ב חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות או עד התאים הם צמודי קרקע. לנטרל טריפסין לאחר דגירה 4 דקות על ידי הוספת 3 מ"ל של התקשורת מלאה HepG2, HK2 או 3 מ"ל של טריפסין נטרול פתרון, dPBS פלוס 5% סרום שור עוברית (FBS), עבור תאים HCAEC.</li>
	<li>להעביר את התאים לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל צנטריפוגה ב g x 250 למשך 5 דקות, תשאף התקשורת ו מחדש להשעות בגדר תא בתקשורת מלאה.</li>
	<li>לסנן את המתלים תא בעדינות דרך מסננת רשת 40 μm כדי לשבור את התא הגושים. לא אנחנו לא שוטפים את התאים דרך מסננת.</li>
	<li>לספור את התאים, צלחת אותם בבית צפיפות ממוטבת. לדוגמה, תאים 5,000 לכל טוב של תאים HepG2 או 10,000 תאים לכל טוב של תאים HK2 או HCAECs לתוך צלחת 24-ובכן להוביל תוצאות אופטימליות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 ° C כדי לאפשר תאים לצרף.</li>
	<li>למחרת, לשנות את התקשורת תא לבסיס המדיה עבור שורת תאים (ללא FBS) ובנוסף 5% Lipo-חלבון לקוי סרום (LPDS) או נמוך (2%) מדיה FBS בהתאם הטיפול (ראה 1.7). לאחר מכן, המשך הדגירה במשך 24 שעות ביממה להרעיב את התאים. השתמש μL 500 של מדיה סה כ כל טוב לתוך צלחת 24-. טוב.</li>
	<li>מתייחסים לתאים בשלוש דרכים: להוסיף 10 µg/mL rPCSK9 (או רכב) ולחזור לתאים החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעה, להוסיף 40 µM מימה Dynasore (או רכב, דימתיל סולפוקסיד) ולחזור התאים החממה 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות , או להוסיף 1 מיקרומטר סימבסטטין (או רכב, דימתיל סולפוקסיד) ולחזור התאים החממה 37 ° C עבור 12, 18-24 שעות. להשתמש במדיה עם 5% LPDS rPCSK9 או Dynasore טיפולים. שימוש נמוך (2%) FBS מדיה או מדיה עם 5% LPDS סימבסטטין טיפולים. הערה: לטיפול תאי עם תרכובות הרצוי יכול להיעשות בזמנו של שינוי מדיה עבור הרעבה ליפופרוטאין (שלב 1.6) עבור ניסויים ארוכי טווח, או לפני הניתוח לניסויים לטווח קצר. לחלופין, הטיפול מותאם אישית יכול להיבחר בהתאם לסוג המטרה של הניסויים.</li>
	<li>לאחר מכן, להוסיף 5 µL של LDL מתויג אדום pHrodo (מניות 1 מ"ג/מ"ל) מכל קידוח בריכוז הסופי של 10 µg/mL. לאחר מכן, בזהירות להסיר את בועות מן הבארות.</li>
</ol>2. ניתוח תא גרה
<ol><li>מיד לאחר הוספת LDL שכותרתה, למקם את הצלחת בחממה תא חי ניתוח המערכת (ראה טבלה של חומרים) ולאפשר את הצלחת אל equilibrate במשך 15 דקות להפחית עיבוי בצלחת.</li>
	<li>בינתיים, לפתוח את התוכנה ותזמן את הסריקה על-ידי הוספת הספינה מחזיקה את הצלחת. תמונה 16 תמונות לכל היטב במרווחים 1 שעה 10 X למשך 4 שעות באמצעות הערוצים אדום ושלב.</li>
	<li>ליצור מפת צלחת לשימוש עבור עיבוד נתונים.<ol>
<li>לחץ על הכרטיסיה מאפייני בחר את צלחת מפה. קלט את סוג התא וטיפולים תרכובות בכרטיסיה.</li>
		<li>לחץ על הכרטיסייה ' אזורי ', בחר כל ערכה של משכפל ולאחר שמירה בשם אזורים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הגדרת פרמטרים ניתוח
<ol><li>לאחר הפעלה ניסיונית תושלם, צור תמונה של ערכת בתוכנה כדי לתרגל את המחשב כדי לכמת כל פרמטר הכלולים בערכה ספירה.<ol>
<li>התוכנה, פתח את התצוגה צלחת ולאחר מכן בתיבה ניתוח העבודה Utilities לבחור יצירה או הוסף לאוסף תמונות.</li>
		<li>בחרו אוסף תמונה חדשה, הקלד שם של אוסף תמונות, ובחרו את הערוצים אדום ו שלב בבדיקת בתיבות לצד הערוצים.</li>
		<li>בחר 5 תמונות נוספות ולהוסיף לאוסף תמונות על-ידי הוספת אוסף תמונות הנוכחי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליצור הגדרה עיבוד לתאים. טבלה 1 כולל את הפרמטרים עבור תא HepG2, HK2 ו- HCAE עיבוד הגדרות עבור פרוטוקול זה זרם ה-LDL.<ol>
<li>בתיבה ניתוח העבודה Utilities , בחר הגדרה חדשה לעיבוד. בחר את האוסף תמונה בשם בשלב 2.1.2 מתוך התפריט הנפתח. קלט את הפרמטרים עבור הסוג של תאים בטבלה 1.</li>
		<li>בתיבת התצוגה המקדימה, השתמש התפריט הנפתח כדי לבחור כל תצוגה מקדימה.</li>
		<li>בתיבה מסיכת ניתוח , בדוק את המסכה הנהרות בתיבות אדום עצם מסיכה כדי להציג את האזור, כלול את הניתוח עבור ההגדרה עיבוד. ראה איור 1.</li>
		<li>גלול באוסף תמונות כדי להבטיח שהתאים ואת ה-LDL כלולים במסכה. בחר קובץ לשמור הגדרת עיבוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את קבוצת תמונות מהפעלה ניסיונית.<ol>
<li>פתח את הניסוי בתצוגה צלחת. בתיבה ניתוח העבודה Utilities , לבחור להפעיל את העבודה ניתוח החדשה. בחר את ההגדרה עיבוד שנשמרו.</li>
		<li>שם ניתוח העבודה, בחר את טווח הזמן לניתוח, וסמן הבארות ניסיוני לנתח. לחץ על לחצן הפעלה .</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח ועיבוד נתונים
<ol><li>לאחר סיום העבודה ניתוח, לייצא את הנתונים:<ol>
<li>בחר את ניתוח שהושלמו ' ולחץ על ' תצוגה'. בתפריט ' כלי עזר ', בחר גרף מדד/ייצוא.</li>
		<li>בתפריט ' אזורי ', לבחור כל בארות, בתפריט ' קבוצה ', כדי לקבל הערכים כלומר עבור כל ערכה של בארות כקבוצה לבחור משכפל ו לייצוא הערכים הבודדים עבור כל טוב בחרו ' ללא'.</li>
		<li>מדד אדום אובייקט בתפריט, בחר הכולל אדום אובייקט משולבת בעוצמה (RCU x µm2/image). פרמטר זה מציין הסכום של הטיימס העוצמה (ב RCU) אדום האזור של האות האדום (ב מיקרומטר2) בכל התמונות על פני כל טוב, המתאים ספיגת ה-LDL הכולל על ידי התאים.</li>
		<li>לחץ על הלחצן ' ייצוא נתונים '. בדוק לשבור נתונים לתוך תמונות בודדות. הנתונים מועתקים באופן אוטומטי על הלוח, יכול להדביק את קובץ הגיליון האלקטרוני חדש.</li>
		<li>מדד שלב אובייקט בתפריט, בחר הנהרות (אחוזים). בדוק לשבור נתונים לתוך תמונות בודדות. לחץ על הלחצן ' ייצוא נתונים '. הנתונים מועתק באופן אוטומטי על הלוח, באפשרותך להעתיק את קובץ הגיליון האלקטרוני המכילה נתוני עוצמת משולב אובייקט האדום הכולל.</li>
		<li>להחיל ההמרה של המפגש אחוז מכלל השטח עם המשוואה הבאה. סה כ שטח שלב (/image2מיקרומטר) = הנהרות (%) × × (תמונה גובה (פיקסלים) × רזולוציה) (תמונה רוחב (פיקסלים) × רזולוציה) הערה: הפרמטר הנהרות (%) מציין המפגש אחוז של האזור שלב לכל תמונה, התואם לאזור של התאים בכל טוב. מדד זה יש להמיר לאזור שלב הכולל עבור כל אדם התמונה פעם מיוצאים. ניתן למצוא את מפרטי התמונה לערוץ שלב (תמונה גובה, רוחב ורזולוציה) לשימוש עם הנוסחה לעיל עבור כל כלי ניסיוני על ידי פנייה מאפייני הכלי תחת ערוצי הצבע בתמונה.</li>
		<li>לנרמל משולב-עוצמה הכולל של אדום אובייקט, לאזור שלב הכולל כמחושב 4.1.6 באמצעות הנוסחה הבאה עבור כל תמונה בנפרד כדי לחסל את ההשתנות צפיפות התאים על פני הבארות.<ol>
<li>לחלק את סה כ אדום אובייקט משולב (RCU x µm2/image) ערכי העוצמה של כל תמונה על-ידי המקביל שלו שלב שטח (/image2מיקרומטר) כדי להשיג ערכי LDL ספיגה (RCU) לכל תמונה.</li>
			<li>לאחר מכן, ממוצע הנתונים LDL ספיגה (RCU) של כל התמונות של כל טוב כדי להשיג את ספיגת ה-LDL הממוצע היטב כל ואת אז ממוצע של הערכים ספיגת LDL מכלל הבארות שכפל כדי לקבל קבוצה אמצעים. נתונים אלה עשויים לשמש איור, ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת ההגדרה של הבחירה הינם הערכים הסופיים של ספיגת LDL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

בפרוטוקול הנוכחי, נדגים את הניצול של תא חי הדמיה כשיטה חדש ויעיל יותר למדידת זמן אמת LDL ספיגת מעל הזמן קורס שורות תאים אנושיים שונים. תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2) משמשים במחקרים הקרנת עבור הורדת כולסטרול הרפוי21,22,23,24,25,26, 39,40. לכן, בחרנו את סוג התא לבדיקת היכולת של מערכת הדמיה של תא חי ללימודי זרם ה-LDL. התוצאות שלנו מציינים כי תאים HepG2 תואמים זו טכניקה חדשה והתוצאה בעקומה סיגמואיד דמוי המציין ספיגת LDL רציף משך זמן וזמינותו זרם עד 4.33 h בתור נקודת הקצה הסופי (איור 2A ו- איור 3 ).
כולסטרול הומאוסטזיס ממלא תפקיד מרכזי הפתופיזיולוגיה של nephropathies שונים. אכן, הצטברות כולסטרול ברקמת הכליה הוא תורם מרכזי סיסטיק כליות למחלות כליות כרונית והוא פתולוגיה העיקריים ב-30,29,28,nephropathies שונים31. ומכאן, בדקנו את השיטה שלנו בתאי אדם כליות אפיתל (HK2) כקו תא פופולרי ואמין מנוצל בתחום נפרולוגיה. הנתונים שלנו נתמך גם את הכדאיות של מערכת ההדמייה תא חי כדי למדוד זרם LDL בתאים HK2. כפי שמוצג באיור 2B, תאים HK2 לקח את ה-LDL כולסטרול באופן ליניארי לאורך משך המחקר זרם (4 שעות).
בשל חשיבות המטבוליזם כולסטרול פיתוח, ההתקדמות של טרשת עורקים32,33,41, הגורם המוביל של מחלות לב וכלי דם, אשר בתורו הרוצח מספר אחת בעולם 42, כיוונו כדי לאמת את השיטה שלנו בסוג התא טרשת עורקים-רלוונטי. השתמשנו כלילית עורקי אנדותל תאים אנושיים (HCAECs), שכן הן אחד מסוגי התא הראשון להיחשף עלבון כולסטרול בלומן עורקים של חולים טרשת עורקים. הנתונים שלנו שמוצג באיור 2C מציין כי שיטה זו זרם LDL גם עובד ביעילות עם HCAECs. זהו גרף תוצאות עקומה דמויית סיגמואיד דומה לזה של תאים HepG2.
כדי לבדוק את תוקפו ואת הרגישות של זה וזמינותו זרם LDL משופר לסינון תרכובות להשפיע על ספיגת LDL-כולסטרול, השתמשנו שלושה פקדים, סוכנים ספיגת להורדת LDL Dynasore ו rPCSK9 ו LDL זרם activator סימבסטטין. . הנה, התייחסנו לעיל הזכיר שורות תאים (HepG2, HK2 ו- HCAECs) עם ריכוזים מיטביים של Dynasore או rPCSK9 לפני וזמינותו זרם. התוצאות שלנו הראה כי כל שלושה קווי בדוקות התא הגיב הטיפולים עם הפחתות משמעותיות LDL זרם מעל 4 שעות קורס (איור 2). למשל, ב- h 4.33 כנקודת בפעם האחרונה, טיפול עם Dynasore-40 µM הקטינה באופן משמעותי זרם ה-LDL HepG2 תאים, התאים HK2, HCAECs על ידי 53%, 68% ו- 54%, בהתאמה (p < 0.0001; איור 2 A-C ו לטבלה 2A-C). בנוסף, rPCSK9-10 µg/mL גרם הפחתה 55% מסומן ב- LDL זרם בתאים HK2 (p < 0.0001; איור 2 B ו לטבלה 2B). יתרה מזאת, הממצאים שלנו הראה כי טיפול HepG2 תאים עם סימבסטטין הביא עלייה ניכרת ספיגת LDL (איור 3), המשנה את הרגישות של שיטה זו לזהות שינויים משמעותיים זרם ה-LDL. מחקרים של הטיפול עם rPCSK9 בתאים HepG2 ו- HCAEC לא נכללות פרוטוקול זה כמו rPCSK9 משמש כטיפול בקרה נוספים עם תוצאות מתועדת היטב, אבל הוא יקר לקנות בכמויות קטנות. לכן rPCSK9 שימשה רק כדי לאמת את פרוטוקול זה בתאים HK2.
חיים תא הדמיה ניתוח, יחד עם המידה פונקציונלי ומתוזמן של זרם LDL, המותר עבור ניטור רציף של בריאות מורפולוגיה של התאים. יתרון זה יכול לזהות ביעילות cytotoxicity הפוטנציאליים של תרכובות יישומית, הופך שיטה זו טכניקה אידיאלית עבור בו-זמנית ניטור פעילות פרמקולוגית של cytotoxicity. דמויות 5-7 להמחיש להחליפן בתמונות של שלושת הקווים תא שנבדקו על נקודת הקצה הסופי (4.33 ח) כהפניה חזותית עבור האפקט של הטיפולים ב- net זרם LDL ו גם מראה בריא המורפולוגיה של תאי בעקבות של נבדק טיפולים. אנו ממליצים על בדיקה ויזואלית של כל תמונות מכל קידוח כדי להבטיח heathy המורפולוגיה של תאי לתקופת המחקר. לדוגמה, בנתונים לא מוצג, כאשר תמונות של HepG2 תאים שטופלו 80 μM Dynasore נבדקו, נצפו סימנים של ניתוק התא קצות התאים הופיעה להיות הרמת רלוונטי, רומז ניתוק התא בריכוזים גבוהים של Dynasore. יתר על כן, ריכוזים גבוהים של סימבסטטין (3-10 μM) גם הובילה מורפולוגיה שונה המציינת המושרה אפופטוזיס כפי שדווח על מינונים גבוהים של סטטינים45. פרוטוקול זה שימש לביצוע טיטור הטיפול Dynasore של 20-80 μM, סימבסטטין ב 0.5-10 μM ריכוז, בעקבות ששימשו התמונות תא לניתוח הבריאות של התאים ולקביעת ctotoxicity הפוטנציאליים של הטיפולים- ריכוזים שונים. תוצאות הציע את השימוש 40 μM עבור Dyansore ו- 1 μM של סימבסטטין כמו ריכוז אופטימלי.
לבסוף, אנו ממליצים לבצע מחקר טיטור צפיפות תא אם קו תא אחר להיבדק בשיטה זו כדי לזהות את מספר התא האופטימלי לכל טוב כדי להשיג תוצאות עקביות. מחקר אופטימיזציה צפיפות שלנו סלולרי הראה כי 10,000 תאים/היטב לתוך צלחת 24-ובכן להוביל לתוצאות זרם LDL עקבית עבור תאים HK2 ו- HCAE. חשוב לציין כי עבור זה LDL זרם assay באמצעות תא חי מערכת הדמיה, טפט של תאים שאינם confluent מופץ באופן שווה על הבארות רצוי כמו גושים של תאים עשוי להצמיח שגיאות הערכים הסופיים LDL מנורמל זרם. הסיבה לכך היא כי על נירמול הנתונים זרם, שטח אובייקט בשלב זה משמש כאמצעי של צפיפות התאים, פרמטר זה יושפעו לרעה כאשר התא גושים נוצרות. הבחנו כי תאים HepG2 יש נטייה גושים טופס כאשר נזרע על צפיפות גבוהה יותר 5,000 תאים/טוב גרימת התוצאות זרם לא עקבי; לכן, השתמשנו תאים 5,000 לכל טוב לתוך צלחת 24-טוב כמו צפיפות מיטבית עבור תאים HepG2.
באופן קולקטיבי, השיטה שלנו מספק פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה לסינון את פעילות פרמקולוגית ואת cytotoxicity של תרכובות ויסות זרם LDL בו-זמנית. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לשימוש עם אחרים ליגנדים שכותרתו fluorescently מזין תא lysosomal כדי להעריך את ספיגת ליגנד בזמן אמת. פרוטוקול זה מציע מפרט עבור InCucyte חיים הדמיה, ניתוח מערכת, הפרוטוקול ניתן להתאים למערכות הדמיה חלופיים, כגון Cellomics.

אנדוציטוזה בתיווך LDLR קולטן של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה LDL הוא אזור חשוב של המחקר מאז במחזור רמות הכולסטרול LDL נמצאים בליבה של מחלות לב וכלי דם1, מחלת כליות2 , כמו גם מגוון רחב של דלקתיות מחלות3 והפרעות גנטיות עם מוטציות בכולסטרול תחבורה גנים4,5,6,7. לימודי בתיווך LDLR כולסטרול זרם הובילו זיהוי של כלי מחקר מרובים, כגון מעכבי Dynamin כולל את כימי Dynasore8,9,10, כמו גם מווסת LDL חלבונים כגון Proprotein Convertase סבטיליזין/Kexin הקלד 9 (PCSK9)11,12.
מסלול אנדוציטוזה LDL-LDLR מתחיל עם sequestering המתחם LDL-LDLR על פני התא לתוך בורות מצופים clathrin13. שלפוחית ואז נוצרות על-ידי invagination של קרום התא משטח הפנמת את קומפלקס LDL-LDLR וקואלות להעברה בתוך התא. כמו שלפוחית בנוי שמישראל מוקדם ומאוחר ואז endosomes, ה-pH טיפות בתוך אנדוזום מאוחר, גורם השיוך של LDL מ שלו קולטן14. בעבר, היו תלויים בשיטות של כימות של LDL זרם התווית על-ידי רדיו 125-LDL הדגירה שיתוף עם תאים, מיצוי הבאים של החלבון שאותה ניתן להתאים רדיו מתאי כימות15. ואז זה הוחלף על ידי שימוש fluorescently שכותרתה LDL חלבונים כגון DiI-LDL, ו immunostaining הבאים או חילוץ של חלבון עבור קריאות פלורסנט באמצעות ספקטרופוטומטרים או בצלחת קורא15,16. Fluorescently מתויג LDL גם שימש ב תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) לניתוח של הפנמה של LDL, תא-איגוד ה-LDL-משטח-17. בעוד ששיטות אלה לאפשר איסוף נתונים לאחר הטיפול, פיקוח על הכדאיות של התאים במהלך הטיפול אינה אפשרית.
ה-pH חומצי של אנדוזום מאוחר מאפשר השימוש של בדיקה pH מופעל LDL פלורסנט כגון pHrodo LDL האדום הזה שזוהר לאחר הפנמה18,19. מאפיין זה מאפשר לקורס זמן רציף של LDL הערכת ספיגת בתאים חיים. לכן, פרוטוקול זה מנצל pHrodo אדום-LDL הדמיה זריחה בניתוח תא חי כדי באופן סדרתי מדד ה-LDL ספיגת עם ניטור בו-זמניות לבריאות תא. התוצאות מצביעות על האמינות של טכניקה חדשנית זו, כפי שנבדקו במהלך הזמן ארבע שעות מספר שלוש שורות תאים אנושיים שונים, תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2), תאים אנושיים (HK2) כליות אפיתל, כלילית עורקי אנדותל תאים אנושיים (HCAEC ). שורות תאים אלה יש משמעות קלינית ל- LDL סיווג20,21,22,23,24,25,26,27 , כליות מחלת28,29,30,31, מחלות לב32,33, בהתאמה. בנוסף לניטור זרם LDL, פרוטוקול זה משלבת טיפול עם שני מעכבי ספיגת ידועים של LDL, מימה Dynasore, חלבון רקומביננטי PCSK9, כמו גם של משרן סטטינים של הביטוי LDLR ו LDL ספיגת, סימבסטטין. Dynasore רקומביננטי PCSK9 כל עובד דרך מסלולים שונים כדי להפחית את ספיגת ה-LDL.
Dynasore מפחיתה את ספיגת ה-LDL על ידי חסימת clathrin תלוית אנדוציטוזה של LDL-LDLR מורכבים10,34וזה מעכב מולקולה קטנה של Dynamins10 . PCSK9 רקומביננטי, מצד שני, הוא חבר של peptidase המשפחה S8 נקשר LDLR, מעכב את מיחזור השטח תא לאחר שחרור ה-LDL מהמתחם למביטה על ידי חסימת שינויים נדרשים הסתגלותי35,36 . צפיפות LDLR פני שטח התא ירד בסופו של דבר שמוביל מופחתת ספיגת LDL על ידי התא. סטטינים, תוך ישירות חסימת האנזים רדוקטאז (HMG-CoA) 3-הידרוקסי-3-methylglutaryl-קואנזים ובכך ביוסינטזה כולסטרול, גם ידועים upregulate הביטוי של25,LDLR38 שמוביל מוגברת ספיגת LDL. הרגישות של פרוטוקול זה מאומת על ידי גילוי הפחתה משמעותית ב LDL זרם שורות שלושה תאים אנושיים הרלוונטית קלינית, HK2, HepG2, HCAECs, Dynasore ו/או רקומביננטי PCSK9, ו עלייה ניכרת LDL ספיגת בתאים HepG2 על ידי סימבסטטין מסלול זמן של 4 שעות עם ניטור לבריאות/תא מורפולוגיה. יחדיו, שיטה זו מספקת פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה לסינון במקביל את פעילות פרמקולוגית ואת cytotoxicity של תרכובות מווסת את ספיגת ה-LDL ב תאים חיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="760">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:281px;">pHrodo Red-LDL</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:149px;">L34356</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HepG2 cells</td>
			<td>E. Thomas Lab, U. Miami</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FBS</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>FP-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Keratinocyte SFM media kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Primary Coronary Artery Endothelial Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Vascular Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Endothelial Cell Growth Kit-VEGF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Human Lipoprotein Deficient Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-999-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">40 &#956;M mesh cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan Blue Staining (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Incucyte Zoom</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Zoom</td>
			<td>Imaging and analysis platform</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dynasore Hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">PCSK9 Recombinant Protein</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring

התקנון של ספיגת כולסטרול LDL דרך אנדוציטוזה בתיווך LDLR הוא אזור חשוב של מחקר שונים פתולוגיות העיקריים כולל הפרעות מטבוליות, מחלות לב וכלי דם, מחלת כליות. בשלב זה אין שיטה זמין כדי להעריך את ספיגת ה-LDL תוך מעקב אחר בו זמנית לבריאות של התאים. המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול, באמצעות תא חי הדמיה ניתוח מערכת, לרכוש מדידות טורי של LDL זרם עם ניטור הבו-זמניות עבור בריאות. טכניקה חדשנית זו נבחנה שלוש שורות תאים אנושיים (תאי אנדותל הכבד, הכליות צינורי אפיתל ולאחר כלילית העורק) במהלך הזמן ארבע שעות מספר. יתר על כן, הרגישות של טכניקה זו תאומת ידועים LDL מעכבי ספיגת, Dynasore, PCSK9 חלבון רקומביננטי, כמו גם על ידי מקדם ספיגה של LDL, סימבסטטין. יחדיו, שיטה זו מספקת פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה בעת ובעונה אחת הקרנות פעילות פרמקולוגית, כמו גם הפיקוח על מורפולוגיה תאים, ומכאן cytotoxicity של תרכובות ויסות זרם ה-LDL. הניתוח יכול לשמש עם מערכות הדמיה שונים ותוכנות אנליטית.

חיים תא הדמיה מאפשר ניטור אמינה של בריאות במהלך לימודי זרם כולסטרול שלוש שורות תאים אנושיים אנחנו לאמת שלנו assay בעוד שלוש שורות תאים אנושיים אשר כולסטרול הומאוסטזיס תקנה משחק תפקיד pathophysiological מרכזי, לרבות תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2), תאים אנושיים (HK2) כליות אפיתל תאי אנדותל עורקים אנושי (HCAECs). השתמשנו מערכת הדמיה של תא חי כדי לבצע וזמינותו ספיגת LDL במסלול זמן 4 שעות עם מדידות טורי במרווחים 1 h. התוצאות שלנו מציינים כי כל סוגי תאים שנבדקו היו תואמות זו טכניקה חדשה ולהוביל עקומות המציינת את ספיגת ה-LDL רציף משך זמן המחקר זרם עם 4.33 h בתור נקודת הקצה הסופי (איור 2). זרם הנתונים באיור 2 התקבלו על ידי נרמול pHrodo הכולל את התווית על-ידי אדום LDL קרינה פלואורסצנטית (סה כ עצם אדום משולב בעוצמה לכל תמונה ב- RCU x µm2/תמונה) לאזור בתא סכום כל תמונה של כל טוב (שלב אובייקט אזור לכל תמונה ב-? /image2מ') לחסל את ההשתנות צפיפות התאים על פני הבארות. יתר על כן, כדי לאמת את הרגישות של LDL זרם וזמינותו לצורך הקרנה תרכובות להשפיע על ספיגת הכולסטרול LDL, היינו שני פקדים חיובי ידוע לעכב LDL זרם, Dynasore, rPCSK9, בקרה חיובית אחת מוכרת LDL תפיסה, סימבסטטין. כפי לאמת את התוצאות שלנו, לאחר הטיפול עם Dynasore, rPCSK9, שלושתם נבדקו שורות תאים אנושיים (HepG2, HK2 ו- HCAEC) הראו הפחתה משמעותית LDL זרם במהלך הזמן מספר 4 שעות (איור 2A-C). לדוגמה, באיור 2A מציג זרם LDL מצטמצם בתאים HepG2 עם טיפול Dynasore במרוצת הזמן, לעומת התאים שטופלו דימתיל סולפוקסיד; בזמן דימתיל סולפוקסיד של הפקד הרכב עבור Dynasore הבקרה היה אין השפעה משמעותית על זרם LDL לעומת קבוצת הביקורת שלא טופלו. יתרה מזאת, הממצאים שלנו הראה עלייה ב- LDL ספיגת על ידי תאים HepG2 לאחר הטיפול עם סימבסטטין (איור 3), המשנה את הרגישות של שיטה זו לזהות שינויים משמעותיים זרם ה-LDL. -על נקודת הזמן 4.5 h, המהווה נקודת זמן אופייני במחקרים ספיגת LDL, זרם LDL באופן משמעותי מופחתת עם טיפול Dynasore או rPCSK9, מוגברת על ידי טיפול סימבסטטין (איור 4).
היתרון העיקרי בשימוש תא חי הדמיה ללימודי ספיגת LDL הוא מערכת זו מספקת תמונות בזמן אמת של התאים כל היטב זה יכול לשמש כדי לפקח על פוטנציאל cytotoxicity של תרכובות שנבדקו. דמויות 5-7 להמחיש להחליפן בתמונות של הקווים תא שלושה נחקרו נקודת הזמן הראשוני (0.33 h), הקצה הסופי (4.33 ח) כהפניה חזותית לזרימה הגדולה-LDL נטו. התמונות לאשר את מורפולוגיה תקינה של תאי בעקבות טיפול Dynasore או rPCSK9, המציינת הן היעילות והבטיחות של תרכובות אלו.
תא חי ניתוח נותן כולסטרול כמותיים טורי אמין זרם מדידות עם טיפולים שונים
היתרון העיקרי של שימוש בפרוטוקול זה עם תא חי מערכת הדמיה היא היכולת לאסוף נתונים לאורך זמן ולהשוות LDL זרם נקודות זמן מרובות במקום בנקודה בפעם האחרונה אחד מבוצע גם באופן מסורתי. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים לחשב זרם reductionin אחוז LDL בנקודת זמן מסוף, כמו גם במרווחים 1 h לאורך זמן. בטבלה 2 מסכמת את צמצום הזרמת LDL ב שלושה קווי בדוקות התא האנושי לאחר 10 דקות לפני הטיפול עם 40 µM Dynasore או טיפול קדם 1 h rPCSK9 µg/mL 10. ב- h 4.33 כנקודת סיום המחקר הסופי, טיפול עם Dynasore-40 µM הקטינה באופן משמעותי זרם ה-LDL HepG2 תאים, התאים HK2, HCAECs על ידי 53%, 68% ו- 54%, בהתאמה (טבלה 2 א-ג) וכתוצאה הטיפול rPCSK9-10 µg/mL 55% צמצום LDL זרם ב HK2 תאים (טבלה 2B). בנוסף לכימות נקודת זמן מסוף כמו מבחני מסורתי, אנו מסוגלים לבצע ניתוח כמותי ההפחתה של LDL זרם עקב טיפול בכל נקודה בזמן הניסוי. לדוגמה, הטבלה 2B מראה כי טיפול עם rPCSK9 ב HK2 תאים הביאה לירידה של LDL ספיגת 79% ב- 1.33 h, 67% ב- 2.33 h, 59% ב- 3.33 h פוסט הטיפול בהשוואה לתאים ללא טיפול. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לניתוח כמותי של זרם ה-LDL לאחר הטיפול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig1.jpg"> איור 1 : עיבוד הגדרת מסיכת. להחליפן בתמונות של תאים HK2 מתוארים בעקבות היישום של הגדרת עיבוד מתאים (מפורט בטבלה1). הראו areHK2 תאים בלי מיסוך (A), עם שלב Maskapplied (B), עם אדום אובייקט מסכת חלה (C), או עם פאזה וגם אדום אובייקט מסכות חלה (D). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig2.jpg"> איור 2 : צמצום LDL ספיגת באמצעות חי תא מערכת הדמיה במהלך הזמן מספר 4.33 h. חיים תא ניתוח המערכת משמשת למדידת זרם ה-LDL ב תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HEPG2) (A), אנושי כליות צינורי (HK2) בתאי אפיתל (B) ותאים האנושי עורקים אנדותל (HCAE) (C). התאים טופלו Dynasore (10 דקות לפני ההפעלה) או rPCSK9 (1h לפני ההפעלה) כפקדים חיובי. דימתיל סולפוקסיד שימש ככלי טיפולי Dynasore. פקדים חיובי ירד באופן משמעותי זרם LDL כל תא 3 שורות. ערכי LDL זרם התקבלו על ידי נרמול עוצמת הכולל עצם אדום משולב (RCUxµm2/image) אל אזור אובייקט הכולל שלב (/image2מיקרומטר). הנתונים הם mean±SEM. N = 6 בארות/קבוצה. הנתונים הם נציג של 2 או 3 ניסויים עצמאית. לעומת < 0.0001 p ריק, ו- # # # vs < 0.0001p דימתיל סולפוקסיד, באמצעות ANOVA דו-כיווני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig3.jpg"> איור 3 . הגברת ספיגת LDL באמצעות תא חי מערכת הדמיה במהלך הזמן מספר 4.33h. חיים תא ניתוח המערכת משמשת למדידת זרם LDL בתאי סרטן הכבד האנושי (HEPG2). ספיגת LDL הוא גדל באופן משמעותי בעקבות טיפול עם סימבסטטין h 12 (), 18 h (B) או 24 שעות (C) באמצעות המדיה המכילה 2% FBS. נקודת הזמן 24 שעות ביממה בוצעה גם עם המדיה המכילה 5% LPDS (ללא FBS). דימתיל סולפוקסיד שימש שליטה שלילי. ערכי LDL זרם התקבלו על ידי נרמול עוצמת הכולל עצם אדום משולב (RCU x µm2/image) אל אזור אובייקט הכולל שלב (/image2מיקרומטר). הנתונים הם mean±SEM. N = 6 בארות/קבוצה. הנתונים הם נציג של הניסוי עצמאי אחד. < 0.0001 p vs דימתיל סולפוקסיד, באמצעות מבחן t של סטודנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig4.jpg"> איור 4 . הפחתה משמעותית של זרם LDL ע י סוכנים ספיגת להורדת LDL בנקודת הזמן 4.3 h. זרם ה-LDL פוחת באופן משמעותי בתוך תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2) (A), אנושי כליות צינורי (HK2) בתאי אפיתל (B) ותאים האנושי עורקים אנדותל (HCAE) (ג) לאחר הטיפול עם ספיגת LDL מעכבי Dynasore במשך 10 דקות או rPCSK9 למשך שעה. זרם ה-LDL מתגברת בצורה ניכרת על ידי סימבסטטין בתאים HepG2 לאחר טיפולים h, 12, 18 או 24 (D). הנתונים הם mean±SEM. N = 6 בארות/קבוצה. הנתונים הם נציג של 2 או 3 ניסויים עצמאית. p < 0.0001 באמצעות ANOVA דו-כיווני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig5.jpg"> איור 5 . מופחת LDL זרם hepatocellular תאי קרצינומה (HepG2) על-ידי סוכן ה-LDL ספיגת להורדת, Dynasore. להחליפן בתמונות של שלב אובייקט, האובייקט אדום עבור תאים HepG2 מתוארים ב- 0.33 h (לוחות שמאלה) ולהציג נקודת הקצה של 4.33 h (לוחות נכון) מצב תקין של תאים. 40 µM Dynasore, ידועים כדי להפחית את ספיגת ה-LDL-כולסטרול, שימש בקרה חיובית (C). התמונות צולמו בהגדלה X 10. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig6.jpg"> איור 6 . מופחת LDL זרם בתאי אדם כליות צינורי אפיתל (HK2) על ידי סוכנים ספיגת להורדת LDL, Dynasore, rPCSK9. להחליפן בתמונות של שלב אובייקט, האובייקט אדום עבור תאים HK2 מתואר 0.33 h (לוחות שמאלה), נקודת הקצה 4.33 h (לוחות נכון) הצג מצב תקין של התאים. 40 µM Dynasore (ג), או rPCSK9 µg/mL 10 (ד), ידועים כדי להפחית את ספיגת הכולסטרול LDL, שימשו השליטה חיובי. תמונות נלקחים בהגדלה X 10. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig7.jpg"> איור 7 . מופחת LDL זרם בתאים אנושיים עורקים אנדותל (HCAECs) על-ידי סוכן ה-LDL ספיגת להורדת, Dynasore. להחליפן בתמונות של שלב אובייקט ואובייקט אדום עבור HCAECs מתואר 0.33 h (לוחות שמאלה), נקודת הקצה 4.33 h (לוחות נכון) הצג מצב תקין של התאים. 40 µM Dynasore, ידועים כדי להפחית את ספיגת ה-LDL-כולסטרול, שימש בקרה חיובית (C). התמונות צולמו בהגדלה X 10. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הנתונים הם mean±SEM. N = 6 בארות/קבוצה. הנתונים הם נציג של 2 או 3 ניסויים עצמאית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58564/58564table1.jpg"> טבלה 1: עיבוד הגדרת פרמטרים. פרמטרים אלה הם ספציפיים עבור מערכת ניתוח שימוש בפרוטוקול זה. צריך להגדיר פרמטרים כדי לנתח אדום באזור הערוץ האדום ואת האזור של התא בערוץ שלב. הגדרות הפרמטר עבור HepG2, HK2, HCAE תא קווים מוצגים.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/58564/58564table2.jpg"> בטבלה 2: שינוי ב- LDL זרם בתאים HepG2, HK2, HCAE שטופלו Dynasore, rPCSK9 או סימבסטטין ב ה 4.3 (א) HepG2 תאים, תאים HK2 (B), HCAE (ג) תאים ותאים HepG2 (D).

Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

פרוטוקול זה מספק גישה יעילה מדידת ספיגת כולסטרול LDL במחירים זרם בזמן אמת באמצעות תא חי הדמיה למערכת סוגי תאים שונים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה למסך את פעילות פרמקולוגית של תרכובות להשפיע על זרם LDL תוך מעקב אחר עבור תא ומורפולוגיה cytotoxicity ומכאן פוטנציאליים.

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

אנו מציגים שיטה לניתוח תמונה חיה של ספיגת כולסטרול LDL לסוגי תאים אנושיים שונים. זה מאפשר לסנן עבור תרכובות, לשנות את ההובלה של כולסטרול LDL. היתרון העיקרי של שימוש בהדמיית תאים חיים לכימות זרם LDL, הוא שהוא מאפשר ניטור מורפולוגיה של התא לאורך כל תקופת ההתמדה, כך שניתן לזהות את התרכובות הרעילות.כדי להתחיל, שאפו את התקשורת מהתאים שהוכנו בעבר, ושטפו את התאים ב-5 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט של דולבקו. שאפו את ה-DPDS. לצד לנתק את התאים מהצלחת 100 מילימטר, להוסיף 1.5 מיליליטר של 0.25%Trypsin-EDTA עבור תאי HepG2, ולהוסיף 1.5 מיליליטר של 0.05%טריפסין-EDTA פתרון עבור תאי HK2, או HCAECs.דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות. לאחר מכן לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 3 מיליליטר של מדיה מלאה עבור התאים HepG2 ו HCAEC. השתמש 3 מיליליטר של פתרון נטרול טריפסין, לסכן את DPDS עם 5%נסיוב בקר עוברי או FBS עבור תאי HK2.מעבירים את התאים לצינורות חרוטיים 15 מיליליטר, ואז צנטריפוגה הצינורות ב 250g במשך חמש דקות. לאחר הספין, שאף את התקשורת ולחץ מחדש על גלולת התא במדיה מלאה. סנן את התאים מתלים בעדינות דרך מסננת רשת של 40 מיקרון כדי לפרק גושי תאים.לספור את התאים צלחת אותם בצפיפות אופטימיזציה בצלחת 24 באר. דגירה הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים לצרף. למחרת, שנה את מדיית התא למדיית הבסיס ללא FBS עבור קו התא, בתוספת סרום חסר ליפופרוטאין של 5%, או מדיה של 2%FBS.השתמש 500 microliters של מדיה הכוללת לגם בצלחת 24 באר. ואז להמשיך את הדגירה במשך 24 שעות כדי להרעיב את התאים. יחד עם שלב הרעב או למחרת, תאים עשויים להיות מטופלים עם תרכובות רצויות פקדים מתאימים.24 שעות לאחר רעב, להוסיף 5 microliters של pHrodo אדום שכותרתו LDL לכל באר המכילה 500 microliters של מדיה כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר. בזהירות להסיר את כל הבועות מן הבארים. מיד לאחר הוספת LDL שכותרתו, מניחים את הצלחת באינקובטור מערכת ניתוח תא חי ולאפשר את הצלחת לצייד במשך 15 דקות כדי להפחית את עיבוי בצלחת.בזמן שהתאים דגירה, לפתוח את התוכנה ולתזמן את הסריקה על ידי הוספת כלי מחזיק את הצלחת. תמונה 16 תמונות ל הבאר, להוסיף מרווחי שעה אחת בהגדלה 10x במשך ארבע שעות באמצעות ערוצי אדום פאזה. לאחר מכן צרו מפת לוח לשימוש לעיבוד נתונים, בחרו בכרטיסיה 'מאפיינים' ובחרו במפת הלוח.הזן את סוג התא בכרטיסיה ובטיפולים של התאים בהקשה המורכבת. לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה אזורים, בחר כל קבוצה של שכפולים והקצה אזורים. לאחר השלמת ריצה ניסיונית, צור ערכת תמונות בתוכנה כדי לאמן את המחשב לכמת כל פרמטר הכלול בקבוצת הספירה.בתוכנה, פתח את תצוגת הלוח, ולאחר מכן בתיבה כלי שירות של עבודת ניתוח, בחר צור או הוסף לאוסף התמונות. בחרו אוסף תמונות חדש, הקלו שם לאוסף התמונות ובחרו בערוצי האדום והפסים על-ידי סימון התיבות שלסמוך לערוצים. בחרו חמש תמונות נוספות מ בארות ונקודות זמן שונות והוסיפו אותן לאוסף התמונות על-ידי הוספה לאוסף התמונות הנוכחי.בתיבה כלי שירות של פעולות ניתוח, בחר הגדרת עיבוד חדשה, בחר את אוסף התמונות מהתפריט הנפתח, הזן את הפרמטרים עבור סוג התאים. בתיבת התצוגה המקדימה, השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור תצוגה מקדימה של הכל. בתיבה מסיכת ניתוח, סמן את מסיכת הקונפלונס ואת תיבות מסיכת האובייקט האדום כדי להציג את האזור הכלול בניתוח עבור הגדרת העיבוד.גלול באוסף התמונות כדי להבטיח שהתאים וה- LDL ייכללו במסכה. בחר קובץ ושמור את הגדרת העיבוד. לאחר מכן, פתח את תצוגת לוח הניסוי כדי לנתח את ערכת התמונות מההפעלה הניסיונית.בתיבה כלי שירות של משרות ניתוח, בחר הפעל עבודת ניתוח חדשה ובחר את הגדרת העיבוד השמורה. תן שם לעבודת הניתוח, בחר את טווח הזמן לניתוח והדגש את בארות הניסוי לניתוח. בחר בלחצן ההפעלה.לאחר השלמת עבודת הניתוח, יצא את הנתונים, בחר את הניתוח שהושלם ולחץ על תצוגה. בתפריט כלי השירות, בחר ייצוא תרשים מטרי. בתפריט אזורים, בחר את כל בארות בתפריט הקבוצה, כדי לקבל את הערך הממוצע עבור כל קבוצה של בארות כקבוצה, בחר שכפולים.ולייצוא הערכים הבודדים עבור כל באר, בחר אף אחד. בתפריט מטרי של אובייקט אדום, בחר בעוצמה המשולבת הכוללת של האובייקט האדום. בחר בלחצן ייצוא הנתונים.בדוק את נתוני ההתפרקות לתמונות בודדות. הנתונים מועתקים באופן אוטומטי בלוח ונועברים לקובץ גיליון אלקטרוני חדש. בתפריט המדד של אובייקט הפאזה, בחר את ההתכנסות ולאחר מכן לחץ על לחצן ייצוא הנתונים.בכרטיסיה בקשה, סמן את אורך הנתונים בתמונות בודדות. הנתונים מועתקים באופן אוטומטי בלוח ונוכלים להיות מודבקים בקובץ הגיליון האלקטרוני המכיל נתוני עוצמה משולבים כוללים של אובייקט אדום. כעת ניתן לנרמל את הנתונים המיוצאים, בהתאם לצעדים 4.1.7 ו- 4.1.8 של הפרוטוקול, כדי להשיג ערכי ספיגת LDL סופיים.לאחר טיפול עם Dynasore או PCSK9 רקומביננטי, כל שלושת קווי התא האנושי נבדק הראו הפחתה משמעותית זרם LDL על פני קורס זמן של ארבע שעות. זרמי LDL מופחת קרצינומה של הכבד האנושי או תאי HepG2, עם טיפול של Dynasore לאורך זמן כמובן, לעומת התאים שטופלו DMSO כפקד. הדמיית תאים חיים של זרם LDL בתאי HepG2 בנקודות זמן שונות הראתה עלייה בשוק ספיגת LDL בעקבות טיפול עם Simvastatin התומך ברגישות של שיטה זו כדי לזהות שינויים משמעותיים בזרם LDL.תמונות בזמן אמת שנחקרו בנקודת הזמן הראשונית ובנקודת הסיום הסופית, מאשרות את המורפולוגיה הרגילה של התאים לאחר הטיפול בדינאסור, מה שמצביע על היעילות והבטיחות של תרכובת זו. לאחר הוספת LDL אדום נוסף לתאים כדי לשמר את פעילותו הפלואורסצנטית, חשוב להגן על הצלחת מפני אור עד שהיא ממוקמת באינקובטור מערכת ההדמיה של התא החי. תאים מאיברים שונים יכולים להגיב באופן שונה לטיפולים, כלומר בכיוונים מנוגדים, או שהם עשויים להגיב באותם כיוונים אך מראים שיעורים שונים של שינוי בקליטת הכולסטרול.רק עם הדמיית התא החי ניתן לזהות הבדלים כאלה ולמתת במדויק.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

קביעת ספירת תאים יונקים, גודל התא ובריאות נייד באמצעות ת Moxi מיני מונה אוטומטי Cell

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...