Name: ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring
Uploaded: 2018-11-17T14:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

Эта работа была поддержана следующие гранты ЛАГ: Национальный институт здравоохранения (R56HL132209 и 1R01HL140468) и Майами сердца исследовательского института. KY является получателем американского сердца ассоциации лектор стипендий (18PRE33960070). HepG2 клетки были любезно предоставленных д-р Томас Эммануэль, Университет Майами-Миллер школа медицины46,47,48.

1. Заполнение клеток в пластине 24-а
<ol><li>Аспирационная СМИ клетки, вымыть клетки с 5 мл Dubelco фосфат буфер солевой (dPBS) и аспирационная dPBS. Для HepG2 клеток в 100 мм блюдо, используйте 1,5 мл 0,25% трипсина/ЭДТА, и для HK2 клеток или HCAECs использовать 1,5 мл 0,05% раствора трипсина/ЭДТА для отсоединения клетки.</li>
	<li>Инкубируйте пластину в инкубаторе 37 ° C, 4 минут, или до тех пор, пока отдельные клетки. Нейтрализовать трипсина после 4 минут инкубации, добавив 3 мл полной СМИ для HepG2 и HK2 или 3 мл трипсина, нейтрализации раствора, dPBS плюс 5% плода бычьим сывороточным (ФБС), для HCAEC клеток.</li>
	<li>Перевести клетки в 15 мл конические трубы и центрифуги на 250 g x 5 мин, аспирационная средства массовой информации и вновь приостановить Пелле клеток в полной СМИ.</li>
	<li>Фильтр суспензию клеток нежно через сетчатый фильтр размером 40 мкм разбить ячейки сгустки. Не мойте клетки через стрейнер.</li>
	<li>Подсчитать количество ячеек и пластины их в оптимизированный плотности. Например 5000 ячеек на хорошо HepG2 клеток или 10 000 ячеек на хорошо HK2 клетки или HCAECs в пластине 24-хорошо привести к оптимальные результаты.</li>
	<li>Инкубируйте пластину на ночь при 37 ° C, чтобы позволить клетки для присоединения.</li>
	<li>Следующий день, изменить ячейки СМИ основывать средства массовой информации для линии клетки (без FBS) плюс 5% Lipo-белка дефицит сыворотки (ЛПДС) или low (2%) FBS СМИ в зависимости от лечения (см. 1.7). Затем перейдите к инкубации за 24 ч до голодать клетки. Используйте 500 мкл всего СМИ за хорошо в пластине 24-хорошо.</li>
	<li>Лечить клетки в один из трех способов: добавить 10 мкг/мл rPCSK9 (или транспортного средства) и вернуть клетки до 37 ° C-инкубатор для 1 часа, добавить 40 мкм Dynasore гидрат (или транспортного средства, диметилсульфоксида) и вернуть клетки инкубатора 37 ° C на 10 минут , или добавить 1 мкм симвастатин (или транспортное средство, диметилсульфоксида) и вернуть клетки для инкубатора 37 ° C на 12, 18 или 24 часа. Использование средств массовой информации с 5% ЛПДС для rPCSK9 или Dynasore лечения. Использование низкой (2%) FBS СМИ или СМИ с 5% ЛПДС СИМВАСТАТИН лечения. Примечание: Лечение клетки с желаемой соединений может быть сделано в то время средства массовой информации изменения для липопротеинов голода (шаг 1.6) для долгосрочных экспериментов, или до анализа для краткосрочных экспериментов. Кроме того индивидуальные обращения раз могут быть выбраны на основе типа и цель экспериментов.</li>
	<li>Далее добавьте 5 мкл pHrodo помечены красным ЛПНП (1 мг/мл бульона) для каждой скважины для получения конечной концентрации 10 мкг/мл. Затем тщательно удалите все пузырьки из скважин.</li>
</ol>2. жить анализа клеток
<ol><li>Сразу же после добавления маркированных ЛПНП, место пластину в инкубаторе системы анализа живых клеток (см. Таблицу материалы) и позволяют пластину сбалансировать на 15 минут для уменьшения конденсации в пластине.</li>
	<li>В то же время откройте программу и расписание проверки путем добавления судно, имеющее пластину. Изображения 16 изображений в хорошо интервалом 1 час в 10 X 4 часа, с использованием красного и фазы каналов.</li>
	<li>Создайте карту пластины для обработки данных.<ol>
<li>Нажмите на вкладке Свойства выберите карта пластины. Входной тип ячейки и лечения в закладке соединений .</li>
		<li>Нажмите на вкладку регионов , выберите каждый набор реплицирует и сохранить как регионов.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Настройка параметров анализа
<ol><li>После завершения экспериментального запуска создайте набор изображений в программном обеспечении для подготовки компьютера для количественного определения каждого параметра, включены в наборе подсчета.<ol>
<li>В программном обеспечении чтобы открыть пластины, а затем в поле Анализ работы утилиты выберите создать или добавить в коллекцию изображений.</li>
		<li>Выберите Новую коллекцию изображений, введите имя для коллекции изображений и выберите красный и фазы каналов, установив флажки рядом с каналов.</li>
		<li>Выберите 5 больше изображений и добавить коллекцию изображений, добавив к текущей коллекции изображений.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Создайте определение обработки для клеток. Таблица 1 содержит параметры для HepG2, HK2 и HCAE клеток, обработку определений для этого протокола приток ЛПНП.<ol>
<li>В диалоговом окне Анализ работы утилиты выберите Новое определение обработки. Выберите коллекцию изображений, названный в шаге 2.1.2 из раскрывающегося меню. Входные параметры для типа клеток из таблицы 1.</li>
		<li>В окне предварительного просмотраиспользуйте раскрывающееся меню для выбора Предварительный просмотр всех.</li>
		<li>В поле Анализ маска установите флажок Маски слияния и коробки Красный объект маска для просмотра области включены в анализ для определения обработки. Смотрите Рисунок 1.</li>
		<li>Просмотрите коллекцию изображений, чтобы убедиться, что клетки и ЛПНП включены в маске. Выберите файл и сохранить определение обработки.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Проанализируйте набор изображений из экспериментальной run.<ol>
<li>Откройте эксперимент в режиме пластины. В диалоговом окне Анализ работы утилиты выберите Запустить новое задание анализа. Выберите сохраненный определение обработки.</li>
		<li>Имя задания анализ, выберите диапазон времени для анализа и выделить экспериментальный скважин для анализа. Нажмите кнопку Запуск .</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. анализ и обработка данных
<ol><li>После завершения анализа задания экспорта данных:<ol>
<li>Выберите завершения анализа и нажмите Просмотр. В меню утилиты выберите Метрики/график экспорта.</li>
		<li>В регионах меню выберите Все скважиныи в группу меню, для получения среднего значения для каждого набора скважин как группы выбрать реплицирует и для экспорта отдельные значения для каждой скважины выберите нет.</li>
		<li>В меню красный объект метрики выберите Всего красный объект интегрированной интенсивности (RCU x µm2/Image). Этот параметр указывает сумму раз интенсивности (в РКГ) красный сигнал области красного сигнала (в мкм2) во всех изображениях по каждой скважине, которая соответствует общей ЛПНП поглощение клетками.</li>
		<li>Нажмите кнопку « Экспорт данных ». Проверьте, разбить данные на отдельных изображений. Данные автоматически копируется в буфер обмена и может быть вставлен в новый файл электронной таблицы.</li>
		<li>В фазе объект метрики меню выберите слияния (%). Проверьте, разбить данные на отдельных изображений. Нажмите кнопку « Экспорт данных ». Данные автоматически копируется в буфер обмена и можно скопировать в файл электронной таблицы, содержащие данные всего красный объект интегрированной интенсивности.</li>
		<li>Применить преобразование процент слияния общей площади с помощью следующего уравнения. Общая площадь фазы (µm2/Image) = слияния (%) × (высота изображения (пикселей) × резолюции) (ширина изображения (пикселей) × резолюции) Примечание: параметр слияния (%) указывает процент слияния области фазы на изображение, которое соответствует области ячеек в каждой скважине. Эта метрика должна быть преобразована в полная фаза область для каждого изображения после экспорта. Характеристики изображения для фазы канала (высота изображения, ширина и резолюции) для использования с указанной выше формулы для каждой экспериментальной судна можно найти путем ссылки на Свойства судна по Каналам изображения.</li>
		<li>Нормализовать всего красный объект интегрированной интенсивности и общей площади фазы рассчитывается в 4.1.6, используя следующую формулу для каждого отдельного изображения для ликвидации изменчивость плотности клеток через скважины.<ol>
<li>Разделите значения Всего красный объект интегрированной интенсивности (RCU x µm2/Image) каждого изображения его соответствующий Этап площадь (µm2/Image) для получения значения ЛНП поглощения (РКГ) на изображение.</li>
			<li>Затем в среднем ЛПНП поглощения (РКГ) данных всех изображений каждой скважины для получения Среднее поглощение ЛПНП в каждой скважины и затем средние значения поглощения ЛПНП всех реплицировать скважин для получения средств группы. Эти данные являются конечные значения поглощения ЛПНП и могут быть использованы для иллюстрации и статистический анализ с использованием программного обеспечения по выбору.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

В текущем протоколе мы демонстрируем использования изображений живой клетки как новый и более эффективный метод для измерения реального времени ЛПНП поглощение время курс в различных линий клеток человека. Клетки человека рак печени (HepG2) обычно используются в исследованиях, скрининг гиполипидемической терапии21,,2223,24,25,26, , 39-40. Поэтому мы выбрали этот тип ячейки для тестирования возможностей визуализации системы живой клетки для ЛПНП приток исследований. Наши результаты показывают, что HepG2 клетки, совместимы с этой новой техники и результат в сигмовидной кишки, как кривая, указывающее непрерывное поглощение ЛПНП на время приток assay до 4,33 h как на финальную конечную точку (рисунок 2A и Рисунок 3 ).
Холестерин гомеостаза играет важную роль в патофизиологии различных нефропатии. Действительно накопление холестерина в почечной ткани является крупный вклад почечной фиброз, приводит к хронической болезнью почек и основных патологии в различных нефропатии28,,2930,31. Следовательно мы изучили наш метод в клетках человека эпителия почек (HK2) как популярные и надежные клеточная линия, используемых в области нефрологии. Наши данные также поддерживает возможности живой клетки тепловизионные системы для измерения ЛПНП приток в HK2 клетках. Как показано на рисунке 2B, HK2 клетки take up ЛПНП линейно на всем протяжении приток исследования (4 часа).
Ввиду важности метаболизм холестерина в развитии и прогрессировании атеросклероза32,,3341, ведущей причиной сердечно-сосудистых заболеваний, которые в свою очередь является убийцей номер один во всем мире 42, мы направлены для проверки нашего метода в типе атеросклероз соответствующие ячейки. Мы использовали человека коронарных артерий эндотелиальных клеток (HCAECs), поскольку они являются одним из первых типов клеток подвергаться воздействию холестерина оскорбление в просвет коронарной артерии пациента атеросклероза. Наши данные, показан на рис. 2C указывает, что этот метод приток ЛПНП также работает эффективно с HCAECs. Полученный график является кривой сигмовидной кишки как похож на что из HepG2 клеток.
Чтобы проверить действительность и чувствительности этот повышение ЛПНП приток assay для проверки соединений, влияющих на LDL-холестерина поглощения, мы использовали три управления, ЛПНП снижение поглощения агентов Dynasore и rPCSK9 и ЛПНП приток активатор симвастатин. Здесь, мы рассматривали выше упомянутых клеточных линий (HepG2, HK2 и HCAECs) с оптимизированной концентрации Dynasore или rPCSK9 до приток assay. Наши результаты показали, что все три испытания клеточных линий ответил на лечения с значительного сокращения притока ЛПНП над 4-часовой курс (рис. 2). К примеру, 4.33 h в последний момент, лечение с Dynasore на 40 мкм значительно сократить приток ЛПНП в HepG2 клетки, клетки HK2 и HCAECs на 53%, 68% и 54%, соответственно (p < 0,0001; Рисунок 2 A-C и Таблица 2A-C). Кроме того, rPCSK9 на 10 мкг/мл вызвало заметное сокращение 55% ЛПНП приток в HK2 клетках (p < 0,0001; Рисунок 2 B и Таблица 2B). Кроме того наши исследования показали, что лечение HepG2 клетки с СИМВАСТАТИН привели к заметному увеличению поглощения ЛПНП (рис. 3), поддерживая чувствительность этого метода для обнаружения значительных изменений в ЛПНП приток. Исследования лечения с rPCSK9 в HepG2 и HCAEC клетки не включаются в этот протокол, как rPCSK9 используется в качестве дополнительного контроля лечения с документально результаты, но дорого купить в небольших количествах. Поэтому rPCSK9 использовался только для проверки этот протокол в HK2 клетках.
Живой клетки визуализации анализа, а также функциональные и своевременного измерение притока ЛПНП, допускается для непрерывного мониторинга здоровья и морфологию клеток. Это преимущество может эффективно обнаруживать потенциальные цитотоксичность применяемых соединений, что делает этот метод идеальной техникой одновременно мониторинга фармакологической активности и цитотоксичность. Цифры 5-7 иллюстрируют представитель образы трех проверенных клеточных линий на финальную конечную точку (4.33 h) как визуальную ссылку для эффекта лечения на чистый приток ЛПНП, а также показывает здорового морфологию клеток после испытания лечение. Мы рекомендуем визуальный осмотр всех изображений из каждой скважины заверить вересковый морфологию клеток на время исследования. Например, в данных не отображаются, когда изображения HepG2 клеток лечение с 80 мкм Dynasore были проверены, мы наблюдали признаки клеток отряд, как по краям клетки представляется, отрывая пластину, предлагая мобильный отряд в более высоких концентрациях Dynasore. Кроме того высокие концентрации препарата СИМВАСТАТИН (3-10 мкм), также привело к указанием измененных морфология индуцированного апоптоза как сообщалось на высоких дозах статины45. Этот протокол был использован для выполнения титрование Dynasore лечения на 20-80 мкм, и симвастатин в концентрации 0,5-10 мкм, после чего ячейка изображения были использованы для анализа здоровье клеток и определения потенциальных ctotoxicity лечения на различные концентрации. Результаты предложили использовать 40 мкм для Dyansore и 1 мкм для СИМВАСТАТИН как оптимальной концентрации.
И наконец мы предлагаем, выполняя исследования титрования плотность клеток, если другая линия клетки должна быть протестированы с помощью этого метода для того, чтобы определить оптимальное ячейки номер в хорошо для получения согласованных результатов. Наши клетки плотность оптимизации исследование показало, что 10 000 клеток/хорошо в пластине 24-ну привести к последовательной ЛПНП приток результаты для HK2 и HCAE клеток. Важно отметить, что этот assay приток ЛПНП, с использованием живой клетки изображений системы, монослой клеток не притока, равномерно распределены на скважинах желательно как скопления клеток может привести к ошибкам в окончательный нормализованных значений приток ЛПНП. Причина этого заключается в том, что для нормализации данных приток, области объекта фаза используется как мера плотность клеток и этот параметр может пострадать при образуются скопления клеток. Мы наблюдали, что HepG2 клетки имеют тенденцию к форме сгустки когда осеменены на плотности выше 5000 клеток/хорошо вызывая несовместимым приток результаты; Таким образом мы использовали 5000 клетки в колодец в пластине 24-Ну как оптимальной плотности для HepG2 клеток.
Коллективно наш метод предоставляет платформу средняя высокая пропускная способность для скрининга фармакологической активности и цитотоксичность соединений, регулирующий приток ЛПНП одновременно. Этот метод может быть легко адаптирована для использования с другими дневно меченых лиганды, которые ввести лизосомальных отсек для оценки поглощения лиганд в режиме реального времени. Хотя этот протокол предлагает спецификации для InCucyte живут визуализации и анализа системы, протокол может быть адаптирован для альтернативных систем тепловидения, например целломике.

ЛПНП, низкой плотности липопротеинов LDLR рецептор-опосредованный эндоцитоз является важной областью исследования, поскольку циркулирующего уровня холестерина ЛПНП в ядро1сердечно-сосудистых заболеваний, почечной болезни2 , а также различных воспалительных болезни3 и генетических расстройств с мутациями в холестерин транспорта генов4,5,6,7. Исследования в LDLR-опосредованной холестерина приток привели к идентификации нескольких исследовательских инструментов, например ингибиторов Динамин, включая химические Dynasore8,9,10, а также ЛПНП регулирующая белки такие Proprotein конвертазы Субтилизин/Kexin тип 911,(PCSK9)12.
Пути эндоцитоза ЛНП-LDLR начинается с поглощения ЛНП-LDLR комплекс на поверхности клеток в Клатрин покрытием ямы-13. Везикулы образуются затем invagination клеточной поверхности мембраны интернализации ЛНП-LDLR комплекс в вакуолей для транспорта внутри клетки. Как сформированные везикул созревает в ранний и поздний затем endosomes, рН капель внутри конце endosome, вызывая диссоциации ЛПНП от его рецептор14. В прошлом методы количественной оценки ЛПНП приток зависит от Радио меченых 125-ЛПНП Сопредседатель инкубации с клетки и последующего извлечения из клеток для количественной оценки15цианокобаламина, меченного белка. Это затем был заменен использование дневно помечены ЛПНП белков например DiI-ЛПНП и последующей иммуноокрашивания или извлечения белков для флуоресцентных чтений, используя спектрофотометр или пластины читателя15,16. Дневно помечены ЛПНП также использовался в активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) для анализа интернализации ЛПНП и клеток поверхности ЛПНП привязки17. Хотя эти методы позволяют сбора данных после лечения, мониторинг жизнеспособность клеток во время лечения не возможен.
Кислой рН в конце endosome позволяет использовать рН активированный флуоресцентного ЛПНП зонда как pHrodo красный ЛПНП, которая флуоресцирует после интернализации18,19. Это свойство позволяет курс время непрерывной оценки поглощения ЛПНП в живых клеток. Таким образом этот протокол использует pHrodo красный-ЛПНП флуоресценции изображений в жить анализа клеток для серийно мера ЛПНП поглощения с параллельного мониторинга здоровья клеток. Результаты свидетельствуют о надежности этой новой техники как протестированного 4-часовой курс в три разных человека клеточных линий, клетки человека рак печени (HepG2), человека почечных клеток эпителия (HK2) и человека коронарных артерий эндотелиальных клеток (HCAEC ). Эти клеточные линии клинически значимых для ЛПНП Распродажа20,21,,2223,24,25,26,27 , почечной болезни28,,2930,31и болезни сердца32,33, соответственно. Помимо контроля за притоком ЛПНП, этот протокол включает в себя лечение с двух известных ЛПНП ингибиторы, Dynasore гидрата и Рекомбинантный белок PCSK9, а также статинов индуктором выражение LDLR и поглощения ЛПНП, симвастатин. Dynasore и рекомбинантные PCSK9 каждого работать через различные пути, чтобы уменьшить поглощение ЛПНП.
Dynasore – это небольшая молекула ингибитор Dynamins10 и уменьшает поглощение ЛПНП, блокируя Клатрин зависимых эндоцитоза ЛНП-LDLR комплекс10,34. Рекомбинантных PCSK9, с другой стороны, является членом пептидаза S8 семьи, которая связывается с LDLR и препятствует его переработки на поверхности клеток после выпуска ЛПНП от интернализированных комплекса, блокируя необходимые конформационные изменения35,36 . Поверхностная плотность LDLR снижение клеток в конечном итоге приводит к снижение ЛПНП поглощения в ячейке. Статины, хотя непосредственно блокирования фермента редуктазы 3-гидрокси-3-methylglutaryl кофермент (HMG-CoA) и таким образом биосинтез холестерина, также известны upregulate выражение LDLR25,38 ведет к увеличению поглощения ЛПНП. Чувствительность этого протокола проверяется путем обнаружения значительных сокращений в ЛПНП приток в трех клинически значимых человека клеточных линий, HK2, HepG2 и HCAECs, Dynasore и/или рекомбинантные PCSK9 и заметное увеличение поглощения ЛПНП в HepG2 клетках СИМВАСТАТИН в 4-часовой курс с мониторинга для морфологии клеток/здоровья. Взятые вместе, этот метод обеспечивает платформу средняя высокая пропускная способность для одновременно скрининг фармакологической активности и цитотоксичность соединений, регулирующих потребление LDL в живых клетках.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="760">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:281px;">pHrodo Red-LDL</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:149px;">L34356</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HepG2 cells</td>
			<td>E. Thomas Lab, U. Miami</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FBS</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>FP-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Keratinocyte SFM media kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Primary Coronary Artery Endothelial Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Vascular Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Endothelial Cell Growth Kit-VEGF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Human Lipoprotein Deficient Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-999-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">40 &#956;M mesh cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan Blue Staining (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Incucyte Zoom</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Zoom</td>
			<td>Imaging and analysis platform</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dynasore Hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">PCSK9 Recombinant Protein</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring

Регулирование LDL холестерина поглощения через LDLR-опосредованный эндоцитоз является важной областью исследования в различных основных патологий, включая метаболические расстройства, сердечно-сосудистые заболевания и заболевания почек. В настоящее время существует не доступный метод для оценки поглощения ЛПНП при одновременно мониторинга здоровья клеток. Настоящее исследование представляет протокол, с помощью системы анализа изображений живой клетки, приобрести последовательных измерений ЛПНП притока с параллельного мониторинга здоровья клеток. Этот роман технику испытывается в трех линий клеток человека (печеночная, почечная трубчатых эпителиальных и коронарной артерии эндотелиальных клеток) за 4-часовой курс. Кроме того чувствительность этого метода проверяется с известным ингибиторы, Dynasore и рекомбинантных белков PCSK9 ЛПНП, а также ЛПНП поглощение промоутер, симвастатин. Вместе взятые, этот метод обеспечивает платформу средняя высокая пропускная способность для одновременно скрининг фармакологической активностью, а также мониторинг морфологии клеток, поэтому цитотоксичность соединений, регулирующий приток ЛПНП. Анализ может использоваться с различными системами визуализации и аналитического программного обеспечения.

Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

Этот протокол обеспечивает эффективный подход к измерению LDL холестерина поглощения с показателями притока реального времени с использованием живой клетки системы в различных типах клеток. Эта техника обеспечивает платформу для фармакологической активности соединений, затрагивающих ЛПНП приток во время мониторинга для морфологии клеток и поэтому потенциальные цитотоксичность на экране.

LDL холестерина поглощения Assay с использованием живой клетки изображений анализ с ячейкой мониторинг состояния

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Мы представляем метод живого анализа изображения поглощения холестерина ЛПНП в различных типах клеток человека. Это позволяет проверять на соединения, которые изменяют транспортировку холестерина ЛПНП. Основным преимуществом использования живой клеточной визуализации для количественной оценки притока ЛПНП является то, что она позволяет контролировать морфологию клеток на протяжении всей продолжительности анализа, поэтому потенциально токсичные соединения могут быть обнаружены.Для начала, аспирировать средства массовой информации от ранее подготовленных клеток, и мыть клетки с 5 миллилитров фосфата Dulbecco буфера солевого раствора. Аспирировать DPDS. Далее, чтобы отделить клетки от 100-миллиметровой тарелки, добавьте 1,5 миллилитров 0,25%трипсина-ЭДТА для клеток HepG2 и добавьте 1,5 миллилитров 0,05%трипсина-ЭДТА для ячеек HK2 или HCAECs.Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение четырех минут. Затем нейтрализуем трипсин, добавив 3 миллилитров полных средств массовой информации для клеток HepG2 и HCAEC. Используйте 3 миллилитров трипсина нейтрализуя раствор, компромисс DPDS с 5%fetal бычьей сыворотки или FBS для клеток HK2.Перенесите клетки в 15 миллилитровых конических труб, затем центрифуга труб при 250г в течение пяти минут. После спина, аспирировать средства массовой информации, и повторного перерасхода ячейки гранулы в полном средствах массовой информации. Фильтр клетки подвески мягко через 40 микрон сетки ситечко, чтобы разбить ячейки сгустки.Подсчитайте клетки и пластины их в оптимизированной плотности в 24-хорошо пластины. Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию, чтобы клетки прикрепляются. На следующий день, изменить сотовые средства массовой информации на базовые средства массовой информации без FBS для клеточной линии, плюс 5%липопротеинов недостаточно сыворотки, или 2%FBS средств массовой информации.Используйте 500 микролитров общего объема средств массовой информации на колодец в 24-хорошо пластины. Затем продолжайте инкубацию в течение 24 часов, чтобы голодать клетки. Наряду с голоду шаг или на следующий день, клетки могут рассматриваться с желаемыми соединениями и соответствующие элементы управления.Через 24 часа после голода, добавить 5 микролитров pHrodo красный помечены ЛПНП в каждой хорошо, содержащей 500 микролитров средств массовой информации, чтобы получить окончательную концентрацию 10 микрограмм на миллилитр. Аккуратно удалите пузырьки из колодцев. Сразу же после добавления помечены ЛПНП, поместите пластину в инкубатор системы анализа живых клеток и дайте пластине равноденствия в течение 15 минут, чтобы уменьшить конденсации в пластине.В то время как клетки инкубируются, откройте программное обеспечение и запланируете сканирование, добавив сосуд, держащий пластину. Изображение 16 изображений на колодец, добавить один час интервалов в 10 раз увеличение в течение четырех часов с помощью красных и фазных каналов. Затем создайте карту пластин для обработки данных, выберите вкладку свойств и выберите карту пластины.Вввеку типа клетки в вкладку клеток и процедуры в составе крана. Затем нажмите на вкладку регионов, выберите каждый набор репликаций и назначьте регионы. После завершения экспериментального запуска создайте набор изображений в программном обеспечении для обучения компьютера количественной оценке каждого параметра, включенного в набор подсчета голосов.В программном обеспечении откройте представление пластины, затем в поле для работы анализа утилиты, выберите создать или добавить в коллекцию изображений. Выберите новую коллекцию изображений, ввемите имя для коллекции изображений и выберите красные и фазовые каналы, проверив коробки рядом с каналами. Выберите еще пять изображений из разных колодцев и точек времени и добавьте их в коллекцию изображений, добавив к текущей коллекции изображений.В поле утилиты для анализа рабочих мест выберите новое определение обработки, выберите коллекцию изображений из выпадают из меню, вести параметры типа ячеек. В поле предварительного просмотра используйте меню высадки, чтобы выбрать предварительный просмотр всех. В поле маски анализа проверьте маску слияния и красные ящики для маски объекта, чтобы просмотреть область, включенную в анализ для определения обработки.Прокрутите коллекцию изображений, чтобы обеспечить включение ячеек и ЛПНП в маску. Выберите файл и сохраните определение обработки. Затем откройте экспериментальное представление пластины для анализа набора изображений из экспериментального запуска.В поле утилиты для анализа рабочих мест выберите новое задание анализа и выберите сохраненное определение обработки. Назовите задание по анализу, выберите диапазон времени для анализа и выделите экспериментальные скважины для анализа. Выберите кнопку запуска.Как только задание по анализу завершено, экспорт данных, выберите завершенный анализ и просмотр прессы. В меню утилит выберите экспорт метрики графика. В меню регионов выбирайте все колодцы и в групповом меню, чтобы получить среднее значение для каждого набора скважин в группе, выбирайте репликации.А для экспорта индивидуальных ценностей для каждого колодец, не выбирайте ни одного. В меню метрики красных объектов выберите общую интенсивность интегрированного красного объекта. Выберите кнопку экспорта данных.Проверьте разбить данные на отдельные изображения. Данные автоматически копируются на буфер обмена и могут быть вкосяты в новый файл электронной таблицы. В меню метрики объектов фазы выберите слияние, а затем нажмите кнопку экспорта данных.В оперативной вкладке проверьте разбиваем данные на отдельные изображения. Данные автоматически копируются на буфер обмена и могут быть втыкнулись в файл электронной таблицы, содержащий общие данные интегрированной интенсивности красных объектов. Теперь экспортируемые данные могут быть нормализованы, согласно шагам 4.1.7 и 4.1.8 протокола, для получения окончательных значений поглощения ЛПНП.После лечения с Dynasore или рекомбинантных PCSK9, все три проверенных человеческих клеточных линий показали значительное сокращение притока ЛПНП в течение четырех часов времени курса. Приток ЛПНП сократился в человеческих печеночным карцинома или HepG2 клеток, с лечением династии с течением времени, по сравнению с клетками, обработанными DMSO в качестве контроля. Live клеточной визуализации притока ЛПНП в клетках HepG2 в разное время точки показали увеличение рынка поглощения ЛПНП после лечения симвастатином поддержки чувствительности этого метода для обнаружения значительных изменений в притоке ЛПНП.Изображения в режиме реального времени, исследованные в начальной точке времени и конечной конечной точке, подтверждают нормальную морфологию клеток после лечения династии, что указывает на эффективность и безопасность этого соединения. После добавления дополнительных красных помечены ЛПНП в клетки, чтобы сохранить его флуоресцентной деятельности, важно, чтобы защитить пластину от света, пока он не помещен в инкубатор системы визуализации живых клеток. Клетки из разных органов могут по-разному реагировать на лечение, то есть в противоположных направлениях, или они могут реагировать в тех же направлениях, но показывают различные темпы изменения уровня поглощения холестерина.Только с живой визуализации клеток такие различия могут быть обнаружены и точно количественно.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-камера и цифровой обработки изображений Количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток в Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Определение количества клеток млекопитающих, размер ячейки и клеточной здравоохранения на основе использования Moxi Z Мини Автоматизированная Сотовые Счетчик

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D изображений агрегации белков в живых клетках

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Живая съемка Пробирной для оценки роли Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; И сфингомиелиназы в Ремонт порообразующих токсинного ран

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Семенники

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Белково-селективные GPCR Конформации Измеряется с использованием FRET датчиков в прямом эфире клеточной суспензии Флуорометр Пробирной

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Изучение белка качества системы управления<em&gt; D. discoideum</em&gt; Использование Терморегулируемая живых изображений сотовый

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Автоматизированное производство человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных корковых и дофаминергических нейронов с интегрированным мониторингом live-Cell

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Визуализация субклеточных структур в живых клетках сверхвысокого разрешения

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...