Name: ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring
Uploaded: 2018-11-17T14:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

Bu eser LAS için aşağıdaki hibe tarafından desteklenmiştir: Ulusal Sağlık Enstitüsü (R56HL132209 ve 1R01HL140468) ve Miami kalp Araştırma Enstitüsü. KY Amerikan Kalp Derneği HGUGM Bursu (18PRE33960070) bir alıcı var. HepG2 hücreleri nazikçe Doktor Emmanuel Thomas, Miami Üniversitesi-Miller okul tıp46,47,48tarafından temin edilmiştir.

1. tohum hücreleri bir 24-şey plaka
<ol><li>Medya hücreleri Aspire edin, Dubelco'nın fosfat tamponlu tuz (dPBS) 5 mL hücrelerle yıkama ve dPBS Aspire edin. 100 mm çanak HepG2 hücrelerdeki için 1.5 mL % 0.25 kullanmak tripsin/EDTA, ve HK2 için hücreleri veya HCAECs 1,5 mL % 0.05 tripsin/EDTA çözeltisi hücreleri ayırmak için kullanın.</li>
	<li>37 ° C kuluçka plaka 4 dakika ya kadar hücreleri müstakil kuluçkaya. Tripsin 4 dakika kuluçka sonra HepG2 ve HK2 veya çözüm, dPBS artı % 5 fetal Sığır serum (FBS), nötralize tripsin 3 mL için komple bir medya 3 mL ekleyerek HCAEC hücreler için etkisiz hale getirin.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL konik tüpler içine aktarmak ve 5 min için 250 x g, santrifüj kapasitesi, medya Aspire edin ve hücre Pelet tam medyada yeniden askıya alma.</li>
	<li>Hücre süspansiyon yavaşça hücre kümeleri kadar kırmak için bir 40 mikron kafes süzgeç aracılığıyla filtre. Hücreleri süzgeç aracılığıyla yıkama yok.</li>
	<li>Hücreleri saymak ve onları en iyi duruma getirilmiş bir yoğunluk plakası. Örneğin, iyi HepG2 hücreleri veya HK2 hücreleri veya HCAECs kuyuda bir 24-şey plaka başına 10.000 hücre başına 5000 hücre en iyi sonuçlara neden.</li>
	<li>Gecede 37 ° C'de hücreler eklemek izin vermek için plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, hücre hücre satırı (olmadan FBS) için medya % 5 temel ortama değiştirmek Lipo Protein eksik Serum (LPDS) veya düşük (% 2) FBS medyaya bağlı olarak tedavi (1.7 bakın). Ardından, kuluçka hücreleri açlıktan 24 h için devam edin. 24-şey plaka bir kuyu başına 500 μL Toplam medya kullanın.</li>
	<li>Üç yoldan biriyle hücreleri tedavi: 10 µg/mL rPCSK9 (veya araç) ekleyin ve 1 saat, 37 ° C kuluçka hücrelere Dynasore hidrat (veya araç, dimetil sülfoksit) 40 µM ekleme ve hücreleri 37 ° C kuluçka için 10 dakika geri dönmek , veya 1 µM Simvastatin (veya araç, dimetil sülfoksit) eklemek ve hücreleri 37 ° C kuluçka 12, 18 veya 24 saat boyunca dönmek. Medya % 5 ile kullanmak için rPCSK9 veya Dynasore tedavi LPDS. Düşük (% 2) kullanın FBS veya ortamlardan % 5 LPDS Simvastatin tedavileri ile. Not: istediğiniz bileşikler hücrelerle tedavi medya değişim için zaman lipoprotein açlık (adım 1.6) uzun süreli deneyler için veya analiz öncesinde kısa süreli deneyler için yapılabilir. Alternatif olarak, özelleştirilmiş tedavi kez türü ve deneyler amacı bağlı seçilebilir.</li>
	<li>Sonra pHrodo kırmızı etiketli LDL (1 mg/mL stok) 5 µL 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için her şey için ekleyin. O zaman, dikkatli bir şekilde herhangi bir kabarcıklar kuyulardan çıkarın.</li>
</ol>2. canlı hücre Analizi
<ol><li>Hemen etiketli LDL ekledikten sonra plaka canlı hücre Analizi sistemi kuluçka makinesine yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve yoğunlaşma plaka azaltmak 15 dakika equilibrate için plaka izin.</li>
	<li>Bu arada, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve plaka tutarak gemi ekleyerek tarama planlamak. Resim 16 kare / 10 X 4 kırmızı ve faz kanallarını kullanarak saat boyunca 1 saat aralıklarla kuyuda.</li>
	<li>Veri işleme için kullanmak için bir plaka haritası oluşturun.<ol>
<li>Özellikler sekmesini tıklayın plaka haritaseçin. Girdi belgili tanımlık hücre tipi ve bileşikleri sekmesini tedavi sonuçlarının karşılaştırılması.</li>
		<li>Bölgeler sekmesini, çoğaltır her kümesi seçin ve bölgeleri olarak kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analiz parametrelerini ayarlama
<ol><li>Deneysel bir çalışma tamamlandıktan sonra sayım kümesinde kapsanan her parametre ölçmek için bilgisayarı eğitmek için yazılım bir görüntü kümesi oluşturun.<ol>
<li>Yazılım, plaka görünümü açın, sonra Analiz iş araçları kutusunda Oluştur veya resim koleksiyonu Ekleseçin.</li>
		<li>Yeni resim koleksiyonuseçin, görüntü koleksiyon için bir ad yazın ve faz ve kırmızı kanalları Kanal yanındaki kutuları işaretleyerek seçin.</li>
		<li>5 daha çok resim seçin ve geçerli resim koleksiyonuna ekleyerek resim koleksiyonuna ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri için işleme tanımı oluşturun. Tablo 1 HepG2, HK2 ve HCAE hücre tanımları bu LDL akını protokol işleme parametrelerini içerir.<ol>
<li>Analiz iş araçları kutusunda, Yeni işlem tanımıseçin. Adım 2.1.2 açılır menüden'adlı resim koleksiyonunu seçin. Giriş parametreleri Tablo 1hücrelerden türü için.</li>
		<li>Önizleme kutusunda, Önizleme tümseçmek için menüyü kullanın.</li>
		<li>Analiz maskesi kutusunda İzdiham maskesi ve Kırmızı nesne maske kutuları işlem tanımı için analiz dahil alanını görüntülemek için denetleyin. Bkz: Şekil 1.</li>
		<li>Hücreleri ve LDL maskede eklenir emin olmak için resim koleksiyonu arasında ilerler. Dosya ve işleme tanımını kaydetmek seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deneysel çalışma görüntülerden dizi analiz.<ol>
<li>Deneme plaka görünümünde açın. Denize indirmek yeni analiz iş Analizi iş araçları kutusunda seçin. Kaydedilmiş işlem tanımı'nı seçin.</li>
		<li>Analiz iş adı, analiz için zaman aralığı seçin ve analiz etmek için deneysel wells vurgulayın. Başlat düğmesini tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analiz ve veri işleme
<ol><li>Analiz iş tamamlandıktan sonra verileri verebilirsiniz:<ol>
<li>Tamamlanan analiz seçin ve göstertuşuna basın. Utilities menüsünden Ölçü/grafik vermeseçin.</li>
		<li>Bölgeler menüde Bütün Wells, seçin ve Grup menüde almayı kümelerine wells bir grup olarak ortalama değerler çoğaltır seçin ve vermek için tek tek değerleri her şey için Yok'useçin.</li>
		<li>Kırmızı nesne metrik menüsünde Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk (RCU x µm2/Image)seçin. Bu parametre kırmızı sinyal yoğunluğu (RCU içinde) kez toplamı Toplam LDL alımını hücreleri tarafından karşılık gelen her şey üzerinde kırmızı sinyal (µm2) tüm belgili tanımlık imge içinde alanı gösterir.</li>
		<li>Veri ver düğmesini tıklatın. Bireysel görüntüleri veri yıkmakkontrol. Verileri otomatik olarak bir panoya kopyalanır ve yeni bir elektronik tablo dosyasına yapıştırılabilir.</li>
		<li>Faz nesne metrik menüsünde izdiham (yüzde)seçin. Bireysel görüntüleri veri yıkmakkontrol. Veri ver düğmesini tıklatın. Verileri otomatik olarak bir panoya kopyalanır ve toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk veri içeren elektronik tablo dosyasına kopyalanabilir.</li>
		<li>Aşağıda ki formül ile toplam alan yüzde izdiham dönüşüm uygulanır. Toplam faz alan (µm2/Image) = izdiham (%) × (resim yüksekliği (piksel) × kararlılık) × (resim genişliği (piksel) × kararlılık) Not: her şey hücrelerde alanına karşılık gelen resim başına faz alanının yüzde izdiham izdiham (%) parametresi gösterir. Bu ölçüm her birey için toplam aşama alanına dönüştürülmesi gerektiğini bir kez ihraç görüntü. Faz kanal (resim yüksekliği, genişliği ve çözünürlük) deneysel her araç için yukarıdaki formül ile kullanılmak üzere görüntü spesifikasyonları Gemi özellikleri altında Görüntü kanallarınabakarak bulunabilir.</li>
		<li>Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk olarak 4.1.6 kuyular arasında değişkenlik hücre yoğunluğu ortadan kaldırmak için tek tek her resim için aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanan toplam faz bölgesine normalleştirmek.<ol>
<li>Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk (RCU x µm2/Image) değerleri her resmin resim başına LDL alımı (RCU) değerler elde etmek için onun karşılık gelen Toplam faz alan (µm2/Image) bölün.</li>
			<li>Sonra her şey her şey ortalama LDL Anlamazdın elde edilir ve sonra grup elde etmek için tüm çoğaltma Wells LDL alımını değerlerin ortalamasını tüm görüntülerin LDL alımı (RCU) veri ortalama. Bu veriler son LDL alımını değerlerdir ve illüstrasyon ve yazılım kullanarak istatistiksel analiz için kullanılan.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Geçerli protokol canlı hücre görüntüleme bir zaman ders çeşitli insan hücre hatlarında üzerinden gerçek zamanlı LDL alımını ölçmek için yeni ve daha etkili bir yöntem olarak kullanımını göstermektedir. İnsan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreler kolesterol düşürücü tedavi21,22,23,24,25,26içineleme çalışmalarda yaygın olarak kullanılır, 39,40. Bu nedenle, bu hücre tipi canlı hücre görüntüleme sistemin LDL akını araştırmalar yeteneğini test etmek için seçti. Sonuçlarımız HepG2 hücreleri birarada olabilir ile bu yeni teknik ve sonuç olarak sürekli LDL alımını akını tahlil süresince kadar 4,33 h son bitiş noktası olarak gösteren bir sigmoid benzeri eğride gösterir (Şekil 2A ve Şekil 3 ).
Kolesterol homeostazı çeşitli nephropathies patofizyolojisi içinde önemli bir rol oynar. Nitekim, kolesterol birikimi böbrek dokusunda böbrek fibrozis kronik böbrek hastalığı için lider için büyük bir katkıda bulunuyor ve çeşitli nephropathies28,29,30,31yılında büyük bir patolojisi. Bu nedenle, Nefroloji alanında kullanılan bir popüler ve güvenilir hücre satır olarak insan hücrelerinde renal epitel (HK2) bizim yöntemi incelenmiştir. Bizim veri aynı zamanda LDL akını HK2 hücrelerdeki ölçmek için canlı hücre görüntüleme sistemi fizibilite desteklenen. Şekil 2' deBgösterildiği gibi HK2 hücreleri LDL kolesterol (4 saat) akını çalışma süresi boyunca doğrusal olarak aldı.
Gelişme ve ilerleme ateroskleroz32,33,41, dünya çapında bir numaralı katil sırayla olan kardiyovasküler hastalık, önde gelen nedenidir kolesterol metabolizmasında önemi nedeniyle 42, bizim Yöntem ateroskleroz ilgili bir hücreye doğrulamak amaçladık. Bu koroner arter lümen ateroskleroz hastada bir kolesterol aşağılamaya maruz ilk hücre tiplerinden birini olarak biz insan koroner damar endotel hücreleri (HCAECs) kullanılır. Şekil 2'C de gösterilen veriler bu LDL akını yöntemi de etkili HCAECs ile çalışır gösteriyor. HepG2 hücreleri için benzer bir sigmoid benzeri eğrisi sonuç grafiktir.
Geçerlilik ve LDL-kolesterol alımını etkileyen bileşikler süzmek için geliştirilmiş bu LDL akını Testin duyarlılığı sınamak için üç denetim, LDL alımını düşürücü ajanlar Dynasore ve rPCSK9 ve LDL akını harekete geçirmek Simvastatin kullanılır. Burada, biz yukarıdaki tedavi hücre hatları (HepG2, HK2 ve HCAECs) Dynasore veya rPCSK9 akını tahlil önce en iyi duruma getirilmiş konsantrasyonları ile belirtilen. Tüm üç test hücre satır 4 saatlik bir zaman boyunca (Şekil 2) LDL akını önemli indirimleri ile tedavilere yanıt bizim sonuçlar gösterdi. Örneğin, son kez noktası olarak 4,33 h 40 µM Dynasore ile tedavi % 53, %68 ve % 54, LDL akını HepG2 hücreleri, HK2 hücreleri ve HCAECs sırasıyla azaltılmış anlamlı (p < 0,0001; Resim 2 A-C ve Tablo 2A-C). Buna ek olarak, rPCSK9 10 µg/mL, bir işaretli % 55 indirim HK2 hücrelerinde LDL akını neden (p < 0,0001; Resim 2 B ve tablo 2B). Ayrıca, bizim bulgular Simvastatin HepG2 hücrelerle tedavi önemli değişiklikler LDL akını algılamak için bu yöntem duyarlılığını destekleyen LDL alımı (Şekil 3), belirgin artış içinde sonuçlandı gösterdi. RPCSK9 iyi belgelenmiş sonuçları ile bir ek denetim tedavi olarak kullanılır ama küçük miktarlarda satın almak pahalı olarak rPCSK9 HepG2 ve HCAEC hücreleri ile tedavi çalışmaları bu protokol için dahil değildir. Bu nedenle rPCSK9 sadece bu protokol HK2 hücreleri için doğrulamak için kullanılmıştır.
Hücre analizi, LDL akını, sağlık ve hücre morfolojisi sürekli izlenmesi için izin fonksiyonel ve zamanında ölçümü ile birlikte görüntüleme yaşıyor. Bu avantajı verimli bir şekilde aynı anda Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite izlemek için ideal bir tekniği yapım bu yöntemi uygulanan bileşiklerin potansiyel sitotoksisite algılayabilir. Rakamlar 5-7 üzerinde net LDL akını tedavilerin etkisi için görsel bir referans olarak son bitiş noktası (4,33 h) adlı üç test hücre satır temsilcisi görüntüleri göstermek ve ayrıca sınanan aşağıdaki hücrelerinin sağlıklı morfoloji gösterir tedaviler. Hücrelerin heathy morfoloji çalışma süresi için sağlamak için her kuyudan tüm görüntülerin görsel kontrol öneririz. Örneğin, verileri gösterilmez, ne zaman HepG2 hücrelerin görüntülerini 80 mikron ile tedavi Dynasore kontrol, tabağını kaldırma, hücre dekolmanı daha yüksek konsantrasyonları, düşündüren için hücre kenarlarına göründüğü gibi biz hücre dekolmanı belirtileri gözlenen Dynasore. Ayrıca, yüksek konsantrasyonları da değişmiş morfoloji gösteren için liderliğindeki simvastatin (3-10 mikron) olarak yüksek dozlarda statin45için rapor apoptosis indüklenen. Bu iletişim kuralı, 20-80 mikron Dynasore tedavi ve hücre görüntüleri hücreleri durumunu çözümlemek ve tedavilerin potansiyel ctotoxicity belirlemek için kullanılan aşağıdaki Simvastatin, 0,5-10 mikron konsantrasyon, titrasyon gerçekleştirmek için kullanılan çeşitli konsantrasyonları. Sonuçları 40 mikron kullanım için Dyansore ve simvastatin için 1 mikron en uygun konsantrasyonlarda önerdi.
Son olarak, biz başka bir hücre satır bu yöntem ile tutarlı sonuçlar elde etmek için en uygun cep numarasını iyi ücret belirlemek için test edilecek ise bir hücre yoğunluğu titrasyon çalışma yapmak öneririz. Hücre yoğunluğu optimizasyonu çalışmamıza 10.000 hücre/iyi bir 24-şey plaka tutarlı LDL akını sonuçları HK2 ve HCAE hücreler için yol gösterdi. Hücre kümeleri son normalleştirilmiş LDL akını değerleri hataları ortaya çıkmasına gibi canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak bu LDL akını tahlil için eşit olarak dağıtılmış wells birleşmesi hücre monolayer arzu olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bunun nedeni için akın veri normalleştirme, faz nesne alanının hücre yoğunluğu bir önlem olarak kullanılır ve ne zaman hücre kümeleri oluşturulur Bu parametre olumsuz etkilenebilir var. Biz HepG2 hücreler hücreleri/iyi tutarsız akını sonuçlara neden 5.000 yüksek yoğunlukları, seribaşı zaman form kümeleri için bir eğilim var gözlenen; Bu nedenle, biz 5000 hücreleri 24-şey plaka bir kuyu başı en uygun yoğunluk HepG2 hücreler için kullanılır.
Toplu olarak, bizim Yöntem Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite LDL akını aynı anda düzenleyen bileşiklerin eleme için bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar. Bu yöntem, ligand alımı gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için lizozomal yuvası girin diğer fluorescently etiketli ligandlar kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Bu iletişim kuralı sunarken InCucyte için özellikleri görüntüleme yaşamak ve analiz sistemi, protokol Cellomics gibi alternatif görüntüleme sistemleri için adapte edilebilir.

Dolaşan LDL kolesterol düzeyleri kalp-damar hastalıkları1, böbrek hastalığı2 gibi çeşitli inflamatuar özünde LDL düşük yoğunluklu Lipoprotein reseptör LDLR-aracılı endositoz çalışmanın önemli bir alan olduğu hastalıklar3 ve genetik bozukluklar mutasyonlar kolesterol taşıma genler4,5,6,7ile. LDLR-aracılı kolesterol akını çalışmalarda kimyasal Dynasore8,9,10, aynı zamanda LDL düzenleyen de dahil olmak üzere Dynamin inhibitörleri gibi birden çok araştırma araçları tanımlaması yol açmıştır proteinler gibi Proprotein konvertaz Subtilisin/Kexin 9 (PCSK9)11,12yazın.
LDL-LDLR endositoz yolu clathrin kaplı çukurlar13içine hücre yüzeyindeki LDL-LDLR kompleks iyon ile başlar. Veziküller sonra taşıma hücre içindeki boşluklara da LDL-LDLR komplekse özümseyerek hücre yüzey membran invagination tarafından oluşturulur. Kurulan vezikül erken ve o zaman geç endosomes geliştikçe, pH LDL ayırma--dan onun reseptör14neden geç endosome içinde bırakır. Geçmişte, LDL akını miktar yöntemleri radyo etiketli 125-LDL Co kuluçka hücreleri ve sonraki çıkarma hücreler miktar15için radyo etiketli protein ile bağlıydı. Bu o zaman kullanım dıı-LDL ve sonraki immunostaining gibi fluorescently etiketli LDL proteinlerin veya floresan okuma bir spektrofotometre veya plaka okuyucu15,16kullanarak için protein çıkarımı tarafından değiştirildi. Fluorescently etiketli LDL da (FACS) sıralama floresans aktif hücreye LDL ve hücre yüzey LDL bağlama17içselleştirilmesi analizi için kullanılmıştır. Hücrelerin canlılık tedavi sırasında izleme veri toplama sonra tedavi için bu yöntemleri izin verirken mümkün değildir.
Geç endosome Asidik pH floresan LDL pH-harekete geçirmek sonda pHrodo sonra içselleştirilmesi18,19fluoresces kırmızı LDL gibi bir kullanımına izin verir. LDL alımını değerlendirme canlı hücrelerdeki sürekli zamanlı kurs için bu özellik sağlar. Bu nedenle, bu iletişim kuralını pHrodo kırmızı-LDL floresans görüntüleme canlı hücre Analizi hücre sağlık için eş zamanlı izleme ile seri olarak ölçü LDL alımı için kullanır. Bu roman tekniği güvenilirliğini olarak üç farklı insan hücre hatları, insan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreleri, insan renal epitel (HK2) hücreleri ve insan koroner damar endotel hücreleri (HCAEC dört saatlik zaman ders üzerinde test sonuçlar gösterir ). Bu hücre satırları LDL izni20,21,22,23,24,25,-26,27 klinik olarak anlamlı , böbrek hastalığı28,29,30,31ve kalp hastalığı32,33, anılan sıraya göre. LDL akını izleme özelliğine ek olarak, bu protokolü ile iki iyi bilinen LDL alım inhibitörleri, Dynasore hidrat ve rekombinant PCSK9 protein yanı sıra LDLR ifade ve LDL alımı, simvastatin statin bir uyarıcı tedavi içerir. Dynasore ve rekombinant PCSK9 her LDL alımını azaltmak için farklı yollar çalışır.
Dynasore Dynamins10 küçük molekül inhibitörü ve clathrin bağımlı endositoz LDL-LDLR karmaşık10,34engelleyerek LDL alımını azaltır. Rekombinant PCSK9, öte yandan, peptidaz LDLR için bağlar ve onun hücre yüzeyine LDL içselleştirilmiş karmaşık gerekli konformasyon değişiklikleri35,36 bloke ederek bırakmadan sonra geri dönüşüm engeller S8 ailesinin bir üyesidir . Azalma hücre yüzey LDLR yoğunluğu sonunda hücre tarafından düşük LDL alımı için yol açar. Statinler, doğrudan 3-hidroksi-3-methylglutaryl-koenzim (HMG-CoA) redüktaz enzim ve böylece kolesterol sentezi, engelleme de upregulate için artan LDL alımı için önde gelen LDLR25,38 ifade bilinir. Bu iletişim kuralı duyarlılığını LDL akını üç klinik insan hücre hatları, HK2, HepG2 ve HCAECs, Dynasore ve/veya rekombinant PCSK9, ve HepG2 hücreleri tarafından LDL Anlamazdın belirgin bir artış önemli indirimler algılayarak doğrulanır Simvastatin hücre morfolojisi/sağlık için izleme ile dört saatlik zaman ders. Birlikte ele alındığında, bu yöntem için aynı anda tarama Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite bileşiklerin canlı hücrelerdeki LDL alımını düzenleyen bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="760">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:281px;">pHrodo Red-LDL</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:149px;">L34356</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HepG2 cells</td>
			<td>E. Thomas Lab, U. Miami</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FBS</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>FP-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Keratinocyte SFM media kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Primary Coronary Artery Endothelial Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Vascular Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Endothelial Cell Growth Kit-VEGF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-100-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Human Lipoprotein Deficient Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-999-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">40 &#956;M mesh cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan Blue Staining (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Incucyte Zoom</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Zoom</td>
			<td>Imaging and analysis platform</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dynasore Hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">PCSK9 Recombinant Protein</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ldl cholesterol uptake assay using live cell imaging analysis with cell health monitoring

LDL kolesterol alımını LDLR aracılı endositoz ile düzenlenmesi çalışmada metabolik bozukluğu, kalp-damar hastalıkları ve böbrek hastalığı da dahil olmak üzere çeşitli büyük patolojileri önemli bir alandır. Şu anda, aynı anda için hücrelerin sağlığını izleme sırasında LDL alımını değerlendirmek için kullanılabilir hiçbir yöntemi yoktur. Çalışmada eşzamanlı hücre sağlık için izleme ile LDL akını seri ölçümler elde etmek için canlı hücre görüntü analiz sistemi kullanan bir Protokolü sunar. Bu roman tekniği üç insan hücre hatlarında (karaciğer, böbrek borulu epitel ve koroner arter endotel hücreleri) dört saat boyunca test edilmiştir. Ayrıca, bu teknik duyarlılığını iyi bilinen LDL alım inhibitörleri, Dynasore ve rekombinant PCSK9 protein ile yanı sıra bir LDL alımını organizatörü, Simvastatin tarafından doğrulanır. Birlikte ele alındığında, bu yöntem aynı anda Farmakolojik aktivite eleme hem de hücre morfolojisi, dolayısıyla sitotoksisite LDL akını düzenleyen bileşiklerin izleme için bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar. Analiz farklı görüntüleme sistemleri ve analitik yazılım ile kullanılabilir.

Hücre canlı görüntüleme sağlayan güvenilir üç insan hücre satır kolesterol akını çalışmaları sırasında hücre sağlığını izlenmesinde Biz bizim tahlil hangi kolesterol homeostazı yönetmelik insan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreleri, insan renal epitel (HK2) hücreleri ve insan koroner arter endotel hücreleri de dahil olmak üzere büyük bir patofizyolojik rol oynar üç insan hücre hatlarında doğrulanmış (HCAECs). Biz canlı hücre görüntüleme sistemi LDL alımını tahlil seri ölçümler ile 4 h saat ders 1 saat aralıklarla gerçekleştirmek için kullanılır. Bizim sonuçları test tüm hücre tipleri bu yeni teknik ve sonucu sürekli LDL alımını 4,33 h akın çalışma süresi için son bitiş noktası (Şekil 2) gösteren eğrileri ile uyumlu olduğunu gösterir. Şekil 2 ' de gösterilen akını veri toplam pHrodo kırmızı etiketli LDL floresans normalleştirme tarafından elde edilmiştir (Toplam RCU x µm2 görüntü başına kırmızı nesne entegre yoğunluk/görüntü) her görüntünün her şey (faz nesne alanının µ görüntüde başına toplam hücre alanına hücre yoğunluğu değişkenliği wells ortadan kaldırmak için m2/Image). Ayrıca, LDL kolesterol alımını etkileyen bileşikler eleme amacıyla LDL akını Testin duyarlılığı doğrulamak için biz LDL akını, Dynasore ve rPCSK9 inhibe bilinen iki olumlu ve LDL ikna etmek için bilinen bir pozitif denetimi kullanılır alımı, Simvastatin. Dynasore ve rPCSK9, tedavi sonuçlarımız tarafından doğrulanmış olarak üç önemli indirimler LDL akını bir 4 h saat boyunca (Şekil 2A-C) gösterdi insan hücre hatları (HepG2, HK2 ve HCAEC) test. Örneğin, Şekil 2A LDL akını Dynasore tedavi süresi boyunca DMSO ile tedavi hücrelere kıyasla ile HepG2 hücrelerdeki azalır gösterir; DMSO denetimi işlenmemiş kontrol grubuna göre LDL akını üzerinde önemli bir etkisi vardı Dynasore için araç kontrol olarak. Ayrıca, bizim bulgular LDL alımını Simvastatin (Şekil 3) ile tedavi takip, LDL akını önemli değişiklikleri algılamak için bu yöntem duyarlılığını destekleyen HepG2 hücreleri tarafından belirgin bir artış gösterdi. Tipik süresi noktasıdır LDL alımı çalışmaları, 4.5 h zaman nokta hakkında LDL akını önemli ölçüde ya Dynasore ya da rPCSK9 tedavi ile azalır ve Simvastatin tedavi (Şekil 4) artırılması.
Bu sistem gerçek zamanlı görüntüler hücrelerinin incelenmesi bileşikler potansiyel sitotoksisite izlemek için kullanılan her şey verir canlı hücre LDL alımı çalışmaları için Imaging kullanarak bir büyük avantaj sağlıyor. Şekil 5-7 net LDL akını için görsel bir referans olarak ilk kez noktası (0.33 h) ve son bitiş noktası (4,33 h) araştırdı üç hücre hatları temsilcisi görüntüleri göstermektedir. Görüntüleri Dynasore veya rPCSK9 tedavileri takip, etkinliği ve güvenliği bu bileşiklerin gösteren hücre normal morfoloji onaylayın.
Canlı hücre Analizi verir güvenilir seri nicel kolesterol akını ölçümleri ile çeşitli tedaviler
Canlı bir hücre görüntüleme sistemi ile bu iletişim kuralını kullanan bir büyük avantajı saat ders boyunca veri toplamak ve LDL akını olarak geleneksel olarak yapılan bir son kez puan yerine birden fazla zaman puan karşılaştırmak için yeteneğidir. Bu iletişim kuralını kullanan, biz terminal zamanda noktada yanı sıra saat ders boyunca 1 saat aralıklarla yüzde reductionin LDL akını hesaplamak edebiliyoruz. Tablo 2 özetler LDL akını 10 dk öncesi tedavi 40 µM ile aşağıdaki üç test edilmiş insan hücre hatlarında azalma Dynasore veya 1 h ön arıtma ile 10 µg/mL rPCSK9. 4,33 h son çalışma bitiş noktası olarak 40 µM Dynasore ile tedavi azaltılmış anlamlı LDL akını HepG2 hücreleri, HK2 hücreleri ve HCAECs % 53, %68 ve % 54, sırasıyla (Tablo 2A-C) ve LDL azalma % 55 10 µg/mL, rPCSK9 ile tedavi sonuçlandı HK2 akını (tablo 2B)hücreleri. Terminal süresi noktası olduğu gibi geleneksel deneyleri miktarının yanı sıra, biz LDL akını nedeniyle tedavi, her zaman bir noktada deneme azalma kantitatif analiz gerçekleştirmek edebiliyoruz. Örneğin, tablo 2B LDL alımını bir azalma hücre sonuçlandı 1.33 h % 79, %67 2,33 h HK2 rPCSK9 ile tedavi, %59 3.33 h tedavi edilmezse hücrelere göre tedavi sonrası gösterir. Bu iletişim kuralı, tedaviden sonra LDL akını kantitatif analiz için güvenilir bir yöntem sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig1.jpg"> Resim 1 : Tanımı maskesi işleme. HK2 hücre temsilcisi görüntüleri ( Tablo 1' de ayrıntılı) uygun işlem tanımının uygulama takip tasvir edilmektedir. AreHK2 hücreleri ile faz Maskapplied (B),(a)maskeleme olmadan kırmızı nesne uygulanan maskesi (C) veya uygulanan faz ve kırmızı nesne maskeleri (D) ile gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig2.jpg"> Resim 2 : LDL alımını canlı kullanarak azaltma 4,33 h saat boyunca görüntüleme sistemi hücre. Canlı hücre Analizi sistemi LDL akını insan hepatik Karsinomu (HEPG2) hücreleri(a), insan renal tübüler epitel (HK2) hücreleri (B) ve insan koroner arter endotel (HCAE) hücreleri (C) ölçmek için kullanılır. Hücreleri olumlu denetimler olarak Dynasore (belgili tanımlık koşmak önce 10 dak) veya rPCSK9 (belgili tanımlık koşmak önce 1 h) ile tedavi edildi. DMSO Dynasore tedavisi için bir araç olarak kullanılmıştır. Pozitif denetimleri tüm 3 hücre hatlarında LDL akını önemli ölçüde azalmıştır. LDL akını değerleri toplam faz nesne alanına (µm2/Image) Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk (RCUxµm2/Image) normalleştirme tarafından elde. Veri çoğu mean±SEM. N = 6 kuyu/grup. 2 veya 3 bağımsız deneyler temsilcisi verilerdir. p < 0,0001 vs boş, ve ###p < 0,0001 vs DMSO, iki yönlü ANOVA kullanarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig3.jpg"> Şekil 3 . LDL alımını görüntüleme sistemi 4,33 h saat boyunca canlı hücre kullanarak artış. Canlı hücre Analizi sistemi insan hepatik Karsinomu (HEPG2) hücrelerinde LDL akını ölçmek için kullanılır. LDL alımı % 2 içeren medyayı kullanarak tedavi Simvastatin ile 12 h (A), 18 h (B) veya 24 h (C) önemli ölçüde arttı FBS. 24 h saat noktası da % 5 içeren medya ile gerçekleştirildi (olmadan FBS) LPDS. DMSO negatif kontrol kullanıldı. LDL akını değerleri toplam faz nesne alanına (µm2/Image) Toplam kırmızı nesne entegre yoğunluk (RCU x µm2/Image) normalleştirme tarafından elde. Veri çoğu mean±SEM. N = 6 kuyu/grup. Bir bağımsız deney temsilcisi verilerdir. p < 0,0001 vs DMSO, öğrenci t-testi kullanarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig4.jpg"> Şekil 4 . Önemli LDL akını azaltma LDL alımını düşürücü ajanlar 4.3 h zamanda noktada tarafından. LDL akını insan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreleri(a), insan renal tübüler epitel (HK2) hücreleri (B) ve LDL alımı ile tedavi aşağıdaki insan koroner arter endotel (HCAE) hücreleri (C) önemli ölçüde azalır inhibitörleri Dynasore 10 dk veya rPCSK9 1 saat için. LDL akını belirgin Simvastatin HepG2 hücrelerdeki 12, 18 veya 24 s tedaviler sonra (D) artırılır. Veri çoğu mean±SEM. N = 6 kuyu/grup. 2 veya 3 bağımsız deneyler temsilcisi verilerdir. p < 0,0001 iki yönlü ANOVA kullanarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig5.jpg"> Şekil 5 . LDL akını hepatosellüler karsinom (HepG2) hücrelerinde LDL alımını düşürmek Aracı, Dynasore tarafından azaltılmış. Faz nesne ve HepG2 hücreler için kırmızı nesne temsilcisi görüntülerini 0,33 h (sol kapı aynası) olarak tasvir edilir ve 4,33 h bitiş noktası (doğru panelleri) hücreleri sağlıklı durumunu göster. 40 µM Dynasore, LDL-kolesterol alımını azaltmak için bilinen olumlu denetimi (C) olarak kullanılmıştır. Görüntüleri 10 X büyütme oranında alındı. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig6.jpg"> Şekil 6 . LDL akını insan hücrelerinde renal tübüler epitel (HK2) LDL alımını düşürmek aracılar, Dynasore ve rPCSK9 azaltılmış. Temsilcisi görüntüleri aşama nesne ve 0,33 h (sol kapı aynası) ve 4,33 h bitiş noktası (doğru paneller) tasvir HK2 hücreler için kırmızı nesne hücreleri sağlıklı durumunu göster. 40 µM Dynasore (C), veya 10 µg/mL rPCSK9 (D), LDL kolesterol alımını azaltmak için bilinen pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Görüntüleri 10 X büyütme oranında alınır. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig7.jpg"> Şekil 7 . LDL akını insan koroner arter endotel hücrelerinde (HCAECs) LDL alımını düşürmek Aracı, Dynasore tarafından azaltılmış. Faz nesne ve kırmızı nesne için 0,33 h (sol kapı aynası) ve 4,33 h bitiş noktası (doğru paneller) tasvir HCAECs temsilcisi görüntülerini hücreleri sağlıklı durumunu göster. 40 µM Dynasore, LDL-kolesterol alımını azaltmak için bilinen olumlu denetimi (C) olarak kullanılmıştır. Görüntüleri 10 X büyütme oranında alındı. Ölçek çubuğu = 100 µm. veri çoğu mean±SEM. N = 6 kuyu/grup. 2 veya 3 bağımsız deneyler temsilcisi verilerdir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58564/58564table1.jpg"> Tablo 1: tanımı parametreleri işleme. Bu parametreler, bu protokol için kullanılan analiz sistemi için özeldir. Kırmızı kırmızı kanalı alanında ve faz kanal hücreye alan çözümlemek için parametrelerin ayarlanması gerekir. HepG2, HK2, parametre ayarlarını HCAE hücre hatları sunulmaktadır.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/58564/58564table2.jpg"> Tablo 2: HepG2, HK2 ve HCAE hücrelerinde LDL akını yüzde değişim tedavi Dynasore, rPCSK9 veya Simvastatin ile 4.3 h'de (A)HepG2 hücreleri, (B) HK2 hücreleri, (C) HCAE hücreleri ve (D) HepG2 hücreleri.

Watch this Scientific Journal Video about LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring at JoVE.com

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

Bu iletişim kuralı görüntüleme sistemi içinde çeşitli hücre tiplerinin bir canlı hücre kullanarak gerçek zamanlı akını oranları ile LDL kolesterol alımını ölçme verimli bir yaklaşım sağlar. Bu teknik Farmakolojik aktivite LDL akını hücre morfolojisi ve dolayısıyla potansiyel sitotoksisite izleme sırasında etkileyen bileşiklerin ekran için bir platform sağlar.

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Biz çeşitli insan hücre tipleri içine LDL kolesterol alımı canlı görüntü analizi için bir yöntem saklı. Bu bileşikler için ekran sağlar, LDL kolesterol taşıma değiştirmek. LDL akını niceleme için canlı hücre görüntüleme kullanmanın en büyük avantajı, bu nedenle potansiyel toksik bileşikler tespit edilebilir, böylece tetkik süresi boyunca hücre morfolojisi izleme sağlar.Başlamak için, daha önce hazırlanmış hücreler kapalı medya aspire, ve Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu 5 mililitre ile hücreleri yıkayın. DPDS aspire. 100 milimetrelik çanak hücreleri ayırmak için yanında, HepG2 hücreleri için% 0,25 Tripsin-EDTA 1.5 mililitre ekleyin ve HK2 hücreleri için 0.05% Trypsin-EDTA çözeltisi 1.5 mililitre ekleyin, veya HCAECs.Plakaları 37 derecede dört dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra HepG2 ve HCAEC hücreleri için komple medya 3 mililitre ekleyerek Tripsin nötralize. 3 mililitre Tripsin nötralize solüsyonu kullanın, HK2 hücreleri için %5 fetal sığır serumu veya FBS ile DPDS'yi tehlikeye at.Hücreleri 15 mililitrelik konik tüplere aktarın, sonra tüpleri 250g'de beş dakika santrifüj edin. Döndükten sonra, medya aspire ve tam ortamda hücre pelet yeniden askıya. Hücre kümelerini kırmak için hücreleri 40 mikron örgü süzgeçten yavaşça filtreleyin.Hücreleri sayın ve 24 kuyulu bir plakaiçinde optimize edilmiş bir yoğunlukta plakalayın. Hücrelerin bağlanmasını sağlamak için tabağı bir gecede 37 derece yekponlayın. Ertesi gün, hücre hattı için FBS olmadan temel ortam hücre ortamı nı değiştirin, artı% 5 lipoprotein eksik serum, ya da% 2 FBS medya.24 kuyuluk bir tabakta kuyu başına 500 mikrolitre toplam ortam kullanın. Sonra hücreleri açlıktan 24 saat boyunca kuluçka devam edin. Açlık adım veya ertesi gün ile birlikte, hücreler istenilen bileşikler ve uygun kontroller ile tedavi edilebilir.Açlıktan 24 saat sonra, mililitre başına 10 mikrogram lık son konsantrasyonelde etmek için 500 mikrolitre ortam içeren her kuyuya 5 mikrolitre pHrodo kırmızısı LDL etiketli pHrodo kırmızısı ldl ekleyin. Dikkatle kuyulardan herhangi bir kabarcıklar kaldırın. Etiketli LDL'yi ekledikten hemen sonra, plakayı canlı hücre analiz sistemi kuluçka makinesine yerleştirin ve plakadaki yoğuşmayı azaltmak için plakanın 15 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.Hücreler kuluçkaya yatarken, yazılımı açın ve plakayı tutan damarı ekleyerek tazyiki planlayın. Resim 16 görüntüleri başına iyi, kırmızı ve faz kanalları kullanarak dört saat boyunca 10x büyütme bir saat aralıklarla ekleyin. Ardından, veri işleme için kullanılacak bir plaka eşlemi oluşturun, özellikler sekmesini seçin ve plaka eşlemi seçin.Hücre türünü hücre sekmesine ve bileşik musluktaki tedavilere giriş. Ardından bölgeler sekmesine tıklayın, her çoğaltma kümesini seçin ve bölgeleri atayın. Deneme çalışması tamamlandıktan sonra, bilgisayarı sayım kümesinde bulunan her parametreyi ölçmek için eğitmek için yazılımda bir görüntü kümesi oluşturun.Yazılımda, plaka görünümünü açın, ardından analiz iş yardımcı programları kutusunda, oluşturma yı veya resim koleksiyonuna eklemeyi seçin. Yeni görüntü koleksiyonu seçin, görüntü koleksiyonu için bir ad yazın ve kanalların yanındaki kutuları işaretleyerek kırmızı ve faz kanallarını seçin. Farklı kuyulardan ve zaman noktalarından beş görüntü daha seçin ve geçerli görüntü koleksiyonuna ekleyerek bunları görüntü koleksiyonuna ekleyin.Çözümleme iş yardımcı programları kutusunda, yeni işleme tanımını seçin, açılır menüden görüntü koleksiyonunu seçin, hücre türüne ait parametreleri girdi. Önizleme kutusunda, tüm önizlemeyi seçmek için açılır menüyü kullanın. Çözümleme maskesi kutusunda, işleme tanımı için analizde yer alan alanı görüntülemek için birleştirme maskesini ve kırmızı nesne maskesi kutularını işaretleyin.Hücrelerin ve LDL'nin maskeye dahil olduğundan emin olmak için görüntü koleksiyonunda ilerleyin. Dosyayı seçin ve işleme tanımını kaydedin. Ardından, deneme çalışmasındaki görüntü kümesini analiz etmek için deneme plakası görünümünü açın.Çözümleme iş yardımcı programları kutusunda, yeni çözümleme işini başlat'ı seçin ve kaydedilen işleme tanımını seçin. Analiz işini adlandırın, analiz için zaman aralığını seçin ve analiz etmek için deneysel kuyuları vurgulayın. Başlatma düğmesini seçin.Analiz işi tamamlandıktan sonra, verileri dışa aktarın, tamamlanan çözümlemesi seçin ve görünüme basın. Yardımcı programlar menüsünde metrik grafik dışa aktarmayı seçin. Bölgeler menüsünde, grup olarak her kuyu kümesi için ortalama değeri elde etmek için tüm kuyuları ve grup menüsünde çoğaltmaları seçin.Ve her kuyu için ayrı değerleri ihraç etmek için, hiçbiri seçin. Kırmızı nesne metrik menüsünde, toplam kırmızı nesne tümleşik yoğunluğunu seçin. Veri verme düğmesini seçin.Verileri tek tek görüntülere ayırmayı denetleyin. Veriler bir panoda otomatik olarak kopyalanır ve yeni bir elektronik tablo dosyasına yapıştırılabilir. Aşama nesnesi metrik menüsünde, birleşimi seçin ve ardından veri dışa aktarma düğmesini tıklatın.İstem sekmesinde, verileri tek tek görüntülere ayırmayı denetleyin. Veriler otomatik olarak bir panoya kopyalanır ve toplam kırmızı nesne tümleşik yoğunluk verilerini içeren elektronik tablo dosyasına yapıştırılabilir. Şimdi son ldl alım değerleri elde etmek için, protokol 4.1.7 ve 4.1.8 adımlarına göre, dışa aktarılan veriler normale döndürülebilir.Dynasore veya rekombinant PCSK9 ile tedavi sonrasında, her üç test insan hücre hatları dört saatlik bir zaman ders içinde LDL akını önemli azalmalar gösterdi. LDL akını insan hepatik karsinom veya HepG2 hücrelerinde azalır, zaman içinde Dynasore tedavisi ile, bir kontrol olarak DMSO ile tedavi hücreleri ile karşılaştırıldığında. Farklı zaman noktalarında HepG2 hücrelerindeki LDL akınının canlı hücre görüntülemesi, SIMvastatin ile yapılan tedavi sonrasında LDL alımında bir pazar artışı olduğunu ve ldl akınındaki önemli değişiklikleri tespit etmek için bu yöntemin hassasiyetini desteklediğini göstermiştir.İlk zaman noktası ve son bitiş noktasında incelenen gerçek zamanlı görüntüler, Dynasore tedavisinden sonra hücrelerin normal morfolojisini doğrular, bu bileşiğin etkinliğini ve güvenliğini gösterir. Floresan aktivitesini korumak için hücrelere daha fazla kırmızı etiketli LDL ekledikten sonra, canlı hücre görüntüleme sistemi kuluçka yerleştirilene kadar ışıktan plakakorumak için önemlidir. Farklı organlardan gelen hücreler tedavilere farklı yanıt verebilir, zıt yönlerde anlamı, ya da aynı yönde yanıt verebilir ama kolesterol alımında farklı değişim oranları gösterebilir.Sadece canlı hücre görüntüleme ile bu tür farklılıklar tespit ve doğru ölçülebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı Kullanımı Memeli Hücre Sayımı, Hücre Boyutu ve Hücre Sağlık Belirlenmesi

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...