Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل بمنحه مقدمة من إدارة مقاطعة خبي من الموارد البشرية والضمان الاجتماعي (CY201605)، ومنحة من "مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة خبي" (H2017206101)، ونحن ممتنون جداً للدكتور قاو شوانغبينغ، الذين قدموا إف هذه الدراسة.

كانت ولدت الفئران ففب/نيو جيرسي في منشأة الحيوان من "المختبرات الرئيسية للأعصاب خبي". جميع الماوس التجارب كانت وافقت "المستشفى من خبي الطبية جامعة أخلاقيات اللجنة الثانية" ونفذت وفقا للوائح إدارة الحيوانات المختبرية أصدرت وزارة العلوم والتكنولوجيا في الجمهورية الشعبية الصين.
<p class="jove_ti...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

من الناحية الفنية، هناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال تكنولوجيا الحقن في الفئران مستيقظا. أولاً، سليم لفتة وشركة مراقبة الفئران طوال العملية برمتها شرط مسبق للنجاح في إيصال. ثانيا، النقطة الأكثر صعوبة هو شعور المسافة الفقرية بطرف الإبرة، أنه من الضروري عدم إدراج عميقا جداً دون مقاومة أ?...

إف يمكن التوسط في التعبير الجيني طويلة الأجل وواسعة النطاق في توصيل الجهاز العصبي المركزي مع عدد قليل من الآثار الجانبية، ولذلك أصبحت واحدة من السيارات الأكثر تبشيرا بالنجاح للعلاج الجيني لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي (المرض)، هنتنغتون المرض (HD) ومرض الزهايمر (AD)، وأمراض التخزين الليزوزومية (LSD)، المرض Gaucher (المدير العام)، والخلايا العصبية سيرويد ليبوفوسسينوسيس (نكل)1. حاليا، أكثر من 100 إف اللقاح تم عزلها من البشر والحيوانات. ومن بين هذه استخدمت على الأقل 12 في السريرية والتجارب السريرية، بما في ذلك الأكثر شيوعاً استخدام ناقلات الجينات مثل AAV1، 2، 4، 5، 6، 8، 9، rAAVrh.8، و rAAVrh.101،2،3،4، 5،6.
أمراض الجهاز العصبي المركزي مختلفة تتطلب استراتيجيات تسليم إف مختلفة نظراً لمختلف المناطق المتضررة في الجهاز العصبي المركزي وأنواع الخلايا. مناطق الجهاز العصبي المركزي وخلية الأنواع التي يمكن ترانسدوسي إف يختلف تبعاً للنمط المصلي المسيطر فضلا عن طريقة التسليم. على سبيل المثال، قد تبين rAAVrh10 ترانسدوسي الغالب astrocytes عندما ألقي بالحقن الوريدية الجهازية (الرابع)، في حين أنها ترانسدوسيد كل من الخلايا العصبية وإطلاق عندما ألقي بحقن intrathecal4،7. بالإضافة إلى ذلك، أدى حقن حمة توصيل المحلية للمناطق المحيطة بموقع الحقن، بينما أدى حقن في السائل الدماغي النخاعي (CSF) عن طريق داخل البطيني أو حقن intrathecal توصيل الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع8 . كما أظهرت الدراسات العلاجية فاعلية العلاج الجيني تسليم إف في اضطرابات الأعصاب بأنه الإدارة9،،من1011. في الأمراض التي تؤثر على مجالات واسعة للجهاز العصبي المركزي مثل المرض، أظهر حقن intrathecal في إطار الخدمات القطرية لتغطية معظم المناطق التي تعاني من المرض بجرعة أقل، مقارنة4،أسلوب تسليم الجهازية10. كما أظهرت الدراسات الأخيرة أن البزل القطني يمكن استخدامها لحقن إف في نماذج الماوس للمرض، الذي يتجنب الإصابات المحتملة المرتبطة بالصفيحة و intrathecal قسطرة4.
كان أول من استخدم البزل القطني المباشرة التجريبية لتسليم الوكلاء، لا سيما من المسكنات، إلى الحبل الشوكي للتسكين والتخدير في عام 188512،13. في هذا التقرير، نحن توضيح الثقب القطني هو حقن الأسلوب في الفئران الكبار مع المعونة من 1% ليدوكائين هيدروكلوريد، مخدر المستمدة من أميد محلية، في الحل الحقن لتقييم ورصد جودة الحقن. الحقن ناجحة اتسمت بالشلل عابر المستحثة ليدوكائين، بينما فشل الحقن لم تظهر هذا السلوك. نحن تصنيف مستوى ضعف عابرة كواحدة من خمس درجات للمساعدة في التنبؤ بكفاءة الحقن. وأخيراً، نحن إظهار أنه قد يمكن التنبؤ بمستوى توصيل rAAVrh10 بدرجة الشلل. ولذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب تسليم إف إينتراثيكال لتعزيز إيصال الجين إف بوساطة للعلاج التجريبي من أمراض الجهاز العصبي المركزي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

حقن Intrathecal (IT) من الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) لفت اهتمام كبير في العلاج الجيني CNS حكم السلامة، نونينفاسيفينيس، وكفاءة توصيل ممتازة في الجهاز العصبي المركزي. أظهرت الدراسات السابقة فاعلية علاجية للعلاج الجيني تسليم إف في اضطرابات الأعصاب به الإدارة. ومع ذلك، سجلت معدلات عالية من الفشل لا يمكن التنبؤ بها بسبب التقادم التقني لإدارة تكنولوجيا المعلومات في الحيوانات الصغيرة. هنا، قمنا بإنشاء نظام لتسجيل النقاط للإشارة إلى مدى نجاح البزل القطني في الحيوانات الصغيرة عن طريق إضافة 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حقن المحلول. نعرض كذلك أنه يمكن التنبؤ بمدى ضعف عابرة بعد حقن كفاءة توصيل إف. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب أنه حقن لتحسين التجارب العلاجية في نماذج الماوس من أمراض الجهاز العصبي المركزي التي تصيب مناطق واسعة من الجهاز العصبي المركزي.

وأظهرت الفئران درجات مختلفة من الضعف عابر الحق بعد ذلك حقن إف الحل في 1% ليدوكائين هيدروكلوريد نظراً لنوعية مختلفة من حقن intrathecal. وفقا لشبه كمي نظام التهديف الصف 5 وقد أنشأنا، اختبرنا أنماط توصيل إف في الفئران بدرجات مختلفة من الضعف الناجم عن ليدوكائين أطرافهم (نقاط 0، ن = 2؛...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

وهنا يقدم تقنية حقن intrathecal مباشرة باستخدام 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حل فيروسية لضمان تسليم الفيروسات الكفاءة المرتبطة بالغدد للحيوانات الصغيرة، وإنشاء نظام لتسجيل النقاط للتنبؤ بكفاءة توصيل في وسط الجهاز العصبي وفقا لدرجة ضعف عابرة الناجمة عن ليدوكائين.

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

هذه الطريقة تسهل التسليم الفعال داخل منطقة المحيط الفوقا للعدوى الفيروسية المرتبطة adeno في الحيوانات الصغيرة مستيقظا للعلاج التجريبية لأمراض الجهاز العصبي المركزي مثل ALS. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الحل الفيروسي يشمل 1٪ ليدوكاين هيدروكلوريد الذي يسبب شلل عابر بعد الحقن الناجح. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر مؤشرا بصريا للحكم على نجاح الوضع الآلي داخلا، والممارسة الكافية أمر ضروري لتحسين معدل نجاح التسليم.قبل البدء في الإجراء، قم بتوصيل إبرة قياس 27 بحقنة هاملتون 25 ميكروليتر ومحاذاة طرف الإبرة المشططوف مع المقياس الحجمي على الحقنة. ثم تحميل بعناية 8 ميكرولترات من 4 × 10 إلى 10 نسخ الجينوم من حل الفيروس في الحقنة، مع الحرص على تجنب فقاعات. بعد ذلك، ضع ماوسًا مستيقظًا من 30 إلى 70 يومًا من العمر 12 إلى 30 جرامًا على قطعة سرير في موضعه المعرض في غطاء للسلامة الحيوية وغط الجزء العلوي من الجسم بشاش معقمة لتهدئة الماوس وتجنب التعرض للعض.قبضة بحزم الماوس على حزام الحوض مع الإبهام على جانب واحد والسبابة والاصبع الأوسط على الجانب الآخر حفظ الجلد بين حزام الحوض الثنائي مشدود مع الإبهام والسبابة. ثم حلق الفراء بين احزمة الحوض الثنائية وتعقيم الجلد المكشوف مع فرك اليود القائم والإيثانول 70٪. للتسليم المباشر داخل المنطقة من حل الفيروس المرتبط بأدينو، جس الفضاء بين الفقرات على طول خط الوسط بين مربط الحوض الثنائي واستخدم ظفرًا لتخريب المسافة البادئة في الجلد للإشارة إلى المساحة الفقرية L5 إلى L6.تدوير قاعدة الذيل قليلا وبلطف للكشف عن خط الوسط من العمود الفقري وضبط شطبة من الإبرة نحو رأس الحيوان. مع الماوس ثابتة بحزم في الموقف، محاذاة الإبرة على طول خط الوسط من العمود الفقري وإدراج إبرة بلطف وعموديا في وسط المسافة البادئة حفظ حقنة في مستوى القوس المركزي. عندما يأتي الإبرة في اتصال مع العظام، وانخفاض ببطء زاوية إلى ما يقرب من 30 درجة وزلة الإبرة في الفضاء بين الفقرات.نفض الغبار ذيل المفاجئ هو علامة على دخول ناجحة في الفضاء داخل الأمعاء. عندما تدخل الإبرة إلى الفضاء الفقري، سوف تشعر التلميح بتضييق الخناق عليها. حقن حل ناقلات، والحفاظ على إبرة داخل الفضاء داخل الأمعاء لمدة دقيقة واحدة.ثم سحب ببطء الإبرة مع دوران للحد من التسرب. على الفور تسجيل الضعف العابر لأطراف الماوس لتقييم جودة الحقن والعودة إلى قفص الماوس للتعافي من الشلل. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، قم بإصلاح أطراف الماوس المحقون ورأسه في موضع العرّضة على غطاء صندوق الرغوة واستخدم المقص لتجريد الجلد من الرأس إلى العجز.قص الجمجمة بين العينين، وقطع على طول خط الوسط من الجمجمة والخط الأفقي فوق المخيخ وفتح الجمجمة على كل جانب. استخدم ملاقط لإزالة العظم القذالي واستخدام مقص العيون لفتح القناة الشوكية ثنائياً. قطع الأضلاع على كلا الجانبين وإزالة بعناية الجزء العلوي من الفقرات.استخدم ملاقط منحنية لرفع الدماغ وقطع أعصاب قاعدة الجمجمة. ثم استخراج بعناية الدماغ كله والحبل الشوكي وإصلاح الأنسجة في 4٪ شبهformaldehyde لمدة 24 ساعة. في نهاية فترة التثبيت، cryoprotect الدماغ وعنق العنق والحبل الشوكي القطني في محلول السكروز 30٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تليها تضمين في مركب درجة حرارة القطع الأمثل قبل المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل.ثم استخدم المبردات للحصول على 25 ميكرومتر سميكة أجزاء من كل نسيج، وتخزين المقاطع المجمدة في 0.01 PBS الضرس في 4 درجات مئوية كما يتم الحصول عليها. للتحليل المناعي الكيميائي للأنسجة، قبل معالجة الأجزاء العائمة الحرة مع بيروكسيد الهيدروجين 1٪لمدة 10 دقائق تليها غسل 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان المقبل العينات في محلول منع تحتوي على 5٪ مصل و 0.3٪ المنظفات غير الأيونية في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة تليها وضع العلامات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة.في اليوم التالي، وغسل المقاطع مع 3 10 غسل دقيقة في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى توين واحتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة الحيوية المناسبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة بعد الغسيل الماضي. في نهاية الحضانة، وغسل أقسام 3 مرات في PBST جديدة كما أظهرت للتو واحتضان العينات مع مجمع peroxidase البيوتين اللانهاية لمدة 40 دقيقة تليها تلطيخ مع عامل chromogenic المناسبة. قم بتركيب المقاطع المسماة على شرائح المجهر الزجاجي ونقع الشرائح في الإيثانول اللامائية لمدة 5 دقائق بمجرد أن تجفف الأجزاء المثبتة بالكامل.المقبل نقع الشرائح في إكسيلين لمدة 10 دقائق وختم لهم مع وسيلة مناسبة تصاعد. ثم صورة الشرائح مع مجهر خفيف مجهزة جهاز الشحن مقرونة في 100، 200، و 400 مرة التكبير. eGFP المناعة من عنق الرحم والأقسام النسيج النخاعي القطني يكشف عن القليل أو لا تحويل في الحبل الشوكي القطني من الفئران مع درجة ضعف 0، وتعزيز قليلا تحويل في الفئران مع درجة ضعف 1، وtransductions قوية وواسعة النطاق في الفئران مع درجة ضعف 4 أو 5.يشير القياس الكمي لشدة تلطيخ GFP لأطراف أنسجة الحبل الشوكي من الفئران التي تعرض درجات مختلفة من ضعف الأطراف العابرة إلى أن شدة الضعف بعد حقن محلول الفيروس ترتبط ارتباطًا وثيقًا بمدى نقل الحبل الشوكي. في الدماغ، يتم الكشف عن إشارات eGFP قوية في لمبة الشم، القشرة الجبهي الظهرية، الجيروسكوبية، وcyrus، ومنطقة CA3 من قرن آمون، قشرة المخ، والمناطق الهامشية من الدماغ، بما في ذلك نواة الوجه، الضفيرة المشيمية، والخلايا الظهارية. الخلايا العصبية الحركية في قرون الأمامية هي أيضا نقل بقوة في مستويات مختلفة من الحبل الشوكي.وعلاوة على ذلك، في القشرة، يتم الكشف عن الخلايا العصبية الإيجابية GFP بما في ذلك الخلايا الهرمية، فضلا عن أنواع الخلايا الدبقية المختلفة بما في ذلك microglia، استروتكس، و oligodendrocytes. هذه التقنية تمكن الباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الآثار العلاجية للتسليم المباشر داخل داخل الحيوانات الصغيرة مستيقظا على أمراض الجهاز العصبي المركزي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

داخل القحف حقن الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcranial التحفيز التيار المباشر (تدكس) في الفئران

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

إنتاج وتنقية ومراقبة الجودة لناقلات القائم على الفيروسات المرتبطة بالغدة

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

مزدوجة الحقن المباشر للدم في ماغنا سيستيرنا كنموذج للنزف تحت العنكبوتية

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

التسجيل الكهربائي لمناطق القشرة الدماغية التي تم التلاعب بها باستخدام فيروس مرتبط بال أدينو يستهدف كوفلين في الفئران

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

الحقن داخل بطانة الرحم البطينية في الفئران

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...