Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra HEBEI provinsen Institut for Human Resources og Social sikkerhed (CY201605) og et tilskud fra Natural Science Foundation i Hebei provinsen (H2017206101), og vi er meget taknemmelige for Dr. Guangping Gao, der har givet AAV for denne undersøgelse.

FVB/NJ mus blev avlet i Dyrefacilitet af nøglen laboratorium af Hebei neurologi. Alle mus eksperimenter blev godkendt af det andet Hospital af Hebei medicinske universitet etiske udvalg og udført efter reglerne i laboratorium animalsk management bekendtgjort ved ministeriet for videnskab og teknologi i People's Republic af Kina.
1. forberedelse af 20% lidocain hydrochlorid stamopløsning
<ol><li>Vej 2 g af lidocain hydrochlorid. 5 – 6 mL sterilt vand og vortex tilsættes forsigtigt. Øge...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Teknisk, der er flere kritiske trin under IT-injektion i vågen mus. Første, ordentlig gestus og fast kontrol med mus under hele hele operationen er en forudsætning for vellykket levering. For det andet føler det vanskeligste punkt den intervertebrale plads med nål-spids, som det er nødvendigt ikke at indsætte for dybt uden modstand eller indsætte med magt under stærk modstand i tilfælde af sårede dyr eller bøjet nål-spids. Tredje, selv om den forbigående lammelse på grund af lidocain giver en objektiv indi...

AAV kan mægle langsigtede og udbredt genekspression i CNS transduktion med få bivirkninger, og derfor er blevet en af de mest lovende køretøjer for genterapi til behandling af CNS sygdomme herunder Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Huntingtons sygdom (HD), Alzheimers sygdom (AD), opbevaring af lysosomale sygdomme (LSD), Gaucher sygdom (GD) og neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. I øjeblikket er mere end 100 AAV serotyper isoleret fra mennesker og dyr. Blandt disse, mindst 12 har været brugt i prækliniske og kliniske forsøg, herunder de mest almindeligt anvendte gen vektorer som AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8, og rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Forskellige CNS sygdomme kræver forskellige AAV levering strategier på grund af de forskellige berørte CNS regioner og celletyper. CNS regioner og celle typer der AAV kan transduce varierer afhængigt af serotype og leveringsmetode. For eksempel, har rAAVrh10 vist sig at transduce overvejende astrocytter når leveret af systemisk intravenøs injektion (IV), der henviser til, at det transduced både neuroner og glia når leveret ved Intratekal injektion4,7. Derudover resulterede parenkym injektion i lokale transduktion til omegnen af injektionsstedet, mens indsprøjtning i cerebrospinalvæske (CSF) gennem intraventrikulært eller Intratekal injektion resulterede i udbredt CNS transduktion8 . Undersøgelser har også vist terapeutiske styrken af AAV-leveret genterapi i neurodegenerative sygdomme af det administration9,10,11. I sygdomme, der påvirker store områder af CNS som ALS, har Intratekal injektion i EFSR'EN vist sig at dække de fleste områder, der er ramt af sygdommen med en lavere dosis, sammenlignet med en systemisk levering metode4,10. Nylige undersøgelser har også vist, at lumbalpunktur kan bruges til at injicere AAV i musemodeller for ALS, som undgår potentielle skader forbundet med laminektomi og Intratekal kateterisation4.
Eksperimentelle direkte lumbalpunktur blev første gang brugt til at levere agenter, især anæstetika, rygmarven til analgesi og anæstesi i 188512,13. I denne rapport viser vi den lumbal punktur IT injektion metode i voksen mus ved hjælp af 1% lidocain hydrochlorid, en lokal AMID-afledte anæstesi, i opløsningen injektion til at evaluere og overvåge injektion kvalitet. Vellykket injektioner var præget af lidocain-induceret forbigående lammelse, mens mislykkede injektioner ikke viste dette problem. Vi klassificerede niveau af forbigående svaghed som en af fem karakterer til at hjælpe med at forudsige injektion effektivitet. Endelig viser vi, at rAAVrh10 transduktion niveau kan forudsiges af kvaliteten af lammelse. Derfor, denne Intratekal AAV leveringsmetode kan bruges til at forbedre AAV-medieret gen-levering for eksperimentel behandling af CNS sygdomme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Intratekal (IT) injektion af adeno-associeret virus (AAV) har tiltrukket betydelig interesse i CNS genterapi i kraft af dets sikkerhed, noninvasiveness og fremragende transduktion effekt i CNS. Tidligere undersøgelser har påvist den terapeutiske styrken af AAV-leveret genterapi i neurodegenerative sygdomme af det administration. Men høje priser af uforudsigelige fejl på grund af en teknisk begrænsning af IT-administration i små dyr er blevet rapporteret. Her, etableret vi et pointsystem for at indikere succes omfanget af lumbalpunktur i små dyr ved at tilføje 1% lidocain hydrochlorid oploesningen injektion. Vi viser yderligere, at omfanget af forbigående svaghed efter injektion kan forudsige AAV transduktion effektivitet. Således, denne IT injektion metode kan bruges til at optimere terapeutiske forsøg i musemodeller af CNS-sygdomme, der plager bred regioner i CNS.

Mus viste forskellige grader af forbigående svaghed lige efter det injektion af AAV løsning i 1% lidocain hydrochlorid på grund af forskellige kvalitet af Intratekal injektion. Ifølge den semi-kvantitative 5-grade pointsystem har vi etableret, vi testede transduktion mønstre af AAV i mus med forskellige grader af lidocain-induceret lemmer svaghed (score 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4; score 5, n = 3). EGFP immunfarvning af rygmarv viste enten ingen eller lille transduktion ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Her præsenterer vi en direkte Intratekal injektionsteknik bruger 1% lidocain hydrochlorid i en viral løsning at sikre effektiv adeno-associeret virus levering til små dyr og indføre et pointsystem for at forudsige transduktion effektivitet i centralt nervesystemet forhold til graden af forbigående svaghed induceret af lidocain.

Direkte Intratekal injektion af rekombinant Adeno-associeret virus i voksen mus

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Denne metode letter en effektiv intrathecal levering af adeno-associerede virale transgener i vågne små dyr til eksperimentel behandling af centralnervesystemet sygdomme som ALS. Den største fordel ved denne metode er, at den virale opløsning omfatter 1% lidocainhydrorid, som fremkalder en forbigående lammelse efter en vellykket injektion. Selv om denne metode giver en visuel indikator for at bedømme succes en intrathecal automatiseret situation, tilstrækkelig praksis er afgørende for at forbedre succesraten for levering.Før proceduren påbegyndes, fastgøres en 27 gauge-nål til en 25 mikroliter Hamilton-sprøjte, og den skrå spids af nålen justeres med den volumetriske skala på sprøjten. Læg derefter forsigtigt 8 mikroliter på 4 x 10 til 10th genomkopier af virusopløsningen i sprøjten, idet der skalved være bobler. Dernæst placere en vågen 30 til 70 dage gamle 12 til 30 gram mus på en seng stykke i den udsatte position i en biosikkerhed hætte og dække overkroppen med sterile gaze til at berolige musen og for at undgå at blive bidt.Fast greb musen på sin bækken bælte med tommelfingeren på den ene side og pegefinger og langfinger på den anden side holde huden mellem den bilaterale bækken hofteholdere stram med en tommelfinger og pegefinger. Barber derefter pelsen mellem de bilaterale bækkenholdere og sterilisere den eksponerede hud med en jod baseret krat og 70% ethanol. Ved direkte intrathecal levering af adeno-associeret virusopløsning skal det intervertebrale rum palpere det intervertebrale rum langs midterlinjen mellem de bilaterale bækkenholdere og bruge en fingernegl til at trykke en indrykning ind i huden for at angive L5 til L6 intervertebralt rum.Drej bunden af halen lidt og forsigtigt at afsløre midterlinjen af rygsøjlen og justere facet af nålen mod hovedet af dyret. Når musen er fast fastgjort, justeres nålen langs rygsøjlens midterlinje, og nålen sættes forsigtigt og lodret ind i midten af indrykningen, så sprøjten holdes i et centralt sagittalplan. Når nålen kommer i kontakt med knoglen, langsomt mindske vinklen til ca 30 grader og slip nålen ind i intervertebrale rum.En pludselig hale svirp er et tegn på en vellykket indrejse i intradural rum. Når nålen kommer ind i intervertebrale rum, vil spidsen føle sig fastspændt. Indsprøjt vektoropløsningen, og hold nålen i det intradurale rum i et minut.Træk derefter langsomt nålen tilbage med rotation for at minimere lækage. Umiddelbart score den forbigående svaghed af musen lemmer til at vurdere injektion kvalitet og returnere musen til sit bur for inddrivelse fra lammelse. Ved det relevante eksperimentelle endepunkt fastgør lemmerne og hovedet af den injicerede mus i udsat position på et skumæsedæksel, og brug en saks til at fjerne og fjerne huden fra hovedet til korsbenet.Klip kraniet mellem øjnene, skåret langs midterlinjen af kraniet og den vandrette linje over lillehjernen og åbne kraniet på hver side. Brug pincet til at fjerne occipital knoglen og bruge oftalmologiske saks til at åbne rygmarvskanalen bilateralt. Skær ribbenene på begge sider og fjern forsigtigt den øverste del af ryghvirvler.Brug buede pincet til at løfte hjernen og afskære nerverne i kraniet base. Derefter forsigtigt udtrække hele hjernen og rygmarven og fastsætte væv i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Ved afslutningen af fikseringsperioden, kryobeskytte hjernen og livmoderhalskræft og lænde rygmarv i 30% saccharose opløsning natten over ved 4 grader Celsius efterfulgt af indlejring i optimal skæretemperatur sammensatte før snap frysning i flydende nitrogen.Brug derefter en kryostat til at opnå 25 mikrometer tykke dele af hvert væv, opbevaring af de frosne sektioner i 0,01 molar PBS ved 4 grader Celsius, som de er opnået. For immunhisemisk analyse af vævene forbehandles de fritflydende sektioner med 1 %hydrogenperoxid i 10 minutter efterfulgt af en 10 minutters vask i PBS. Derefter inkuberes prøverne i blokerende opløsning, der indeholder 5%serum og 0,3%nonionisk vaskemiddel i PBS i 1 time efterfulgt af natten mærkning ved 4 grader Celsius med passende primære antistoffer af interesse.Den næste dag vaskes sektionerne med 3 10 minutters vask i PBS plus Tween, og rutsjebanerne inkuberes med de relevante tilsvarende biotinylerede sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time efter den sidste vask. Ved inkubationens afslutning vaskes afsnittene 3 gange i frisk PBST som blot påvist og inkuberes prøverne med infinity biotinperoxidasekompleks i 40 minutter efterfulgt af farvning med et passende krogent middel. Monter de mærkede sektioner på glasmikroskopdias og læg diasene i vandfri ethanol i blød i 5 minutter, når de monterede sektioner er helt tørret.Næste sættetid dias i xylen i 10 minutter og forsegle dem med en passende montering medium. Derefter billede dias med et lys mikroskop udstyret med en ladning koblet enhed på 100, 200 og 400 gange forstørrelser. eGFP immunostaining af cervikal og lumbal rygmarvsvæv sektioner afslører ringe eller ingen transduktion i lænde rygmarven af mus med en svaghed score på 0, lidt forbedret transduktion i mus med en svaghed score på 1, og stærke og udbredte transduktioner i mus med en svaghed score på 4 eller 5.Kvantificering af GFP farvning intensiteten af rygmarvsvæv sektioner fra mus viser forskellige grader af forbigående lemmer svaghed indikerer, at sværhedsgraden af svaghed efter virusopløsning injektion nøje korrelerer med omfanget af rygmarvstransduktion. I hjernen, robust eGFP signaler påvises i olfaktoriske pære, dorsolateral præfrontal cortex, dentate gyrus, og CA3 zone af hippocampus, cerebellar cortex, og marginale områder af hjernestammen, herunder ansigtskerne, choroid plexus, og ependymal epitelceller. Motor neuroner i den forreste horn er også stærkt transduced i forskellige niveauer af rygmarven.Desuden, i cortex, GFP positive neuroner, herunder pyramideceller påvises samt forskellige glia celletyper, herunder mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytter. Denne teknik gør det muligt for forskere på neurologi området til at udforske de terapeutiske virkninger af direkte intrathecal levering i små vågne dyr på centralnervesystemet sygdomme.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiel Adeno-associeret Virus 9 (AAV9) Vector Levering i Voksne Mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associeret Virus-medieret transgen udtryk i genetisk definerede neuroner i rygmarven

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transkranial jævnstrøm Stimulation (TDC'er) i mus

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, oprensning og kvalitetskontrol for Adeno-associeret Virus-baseret vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Dobbelt direkte injektion af blod i Cisterna Magna som en model af Subarachnoid Blødning

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Elektrokortografisk optagelse af cerebral cortex-områder manipuleret ved hjælp af en Adeno-associeret virus, der er målrettet cofilin hos mus

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Intracerebroventrikulær injektion hos mus

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Intratekal injektion af nyfødt mus til genomredigering og lægemiddelafgivelse

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...