Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van HEBEI provinciale afdeling van menselijke hulpbronnen en sociale zekerheid (CY201605) en een subsidie van Natural Science Foundation Hebei provincie (H2017206101), en we zijn zeer dankbaar Dr Guangping Gao, die de AAV voor Deze studie.

FVB/NJ muizen werden gefokt in de dier faciliteit van sleutel laboratorium van Hebei neurologie. Alle muis experimenten werden goedgekeurd door de tweede ziekenhuis van Hebei medische universiteit ethische Commissie en uitgevoerd volgens de voorschriften van dierlijke Laboratoriumbeheer uitgevaardigd door het ministerie van wetenschap en technologie van de People's Republic van China.
1. bereiding van de stockoplossing van de 20% lidocaïne Hydrochloride
<ol><li>Weeg 2 g van lidocaïne hydro...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Technisch, zijn er verschillende kritische stappen tijdens de injectie van de IT in wakker muizen. Eerste, goede gebaar en firma controle van de muizen gedurende de hele operatie is een voorwaarde voor succesvolle levering. Ten tweede is het moeilijkste punt de lat. ruimte met de naald tip, gevoel als er moet niet te diep invoegen zonder weerstand of invoegen onder dwang onder sterke weerstand in het geval van de dieren verwonden of buigend van de naald-tip. Ten derde, hoewel de tijdelijke verlamming als gevolg van lidoc...

AAV langdurige en wijdverbreide genexpressie in de signaaltransductie CNS met weinig bijwerkingen kan bemiddelen, en daarom is uitgegroeid tot een van de meest veelbelovende voertuigen voor gentherapie om CNS ziekten met inbegrip van Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Huntington van te behandelen ziekte (HD), de ziekte van Alzheimer (AD), opslag Lysosomale ziekten (LSD), de ziekte van Gaucher (GD) en neuronale ceroid lipofuscinose (NCL)1. Momenteel werden meer dan 100 AAV serotypen geïsoleerd van mens en dier. Onder deze, ten minste 12 zijn gebruikt in preklinische en klinische proeven, met inbegrip van de meest gebruikte gebruikt gene vectoren zoals AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 en rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Verschillende CNS aandoeningen vereisen verschillende strategieën van de levering van de AAV als gevolg van de verschillende getroffen regio's van de CNS en celtypes. De CNS regio's en de cel typen die AAV kan transduce is afhankelijk van het serotype evenals leveringsmethode. RAAVrh10 heeft bijvoorbeeld aangetoond dat transduce overwegend astrocyten wanneer geleverd door systemische intraveneuze injectie (IV), terwijl het getransduceerde neuronen én glia wanneer geleverd door intrathecale injectie4,7. Bovendien resulteerde parenchym injectie in lokale transductie tot de omgeving van de injectieplaats, overwegende dat de injectie in de cerebrospinale vloeistof (CSF) via intraventricular of intrathecale injectie in wijdverbreide CNS transductie8 resulteerde . Studies hebben ook aangetoond therapeutische werkzaamheid van gentherapie in neurodegeneratieve aandoeningen AAV-geleverd door beheer9,10,11. Ziekten die invloed hebben op gebieden van het centraal zenuwstelsel zoals ALS, intrathecale injectie in het CB gebleken ter dekking van de meeste gebieden die zijn getroffen door de ziekte met een lagere dosis, in vergelijking met een systemische levering methode4,10. Recente studies hebben ook aangetoond dat Lumbaalpunctie kan worden gebruikt voor het injecteren van AAV in Muismodellen voor ALS, die mogelijke verwondingen laminectomie en intrathecale catheterisatie4is gekoppeld vermijdt.
Experimentele directe Lumbaalpunctie werd eerst gebruikt voor agenten, vooral anesthetica, naar het ruggenmerg voor analgesie en verdoving in 188512,,13. In dit verslag illustreren we de lumbale punctie IT injectie methode in volwassen muizen met behulp van 1% lidocaïne hydrochloride, een lokale amide afkomstige verdovingsmiddel, in de injectie-oplossing te evalueren en controleren van de kwaliteit van de injectie. Succesvolle injecties werden gekenmerkt door lidocaïne-geïnduceerde tijdelijke verlamming, overwegende dat mislukte injecties geen dit gedrag vertonen. We ingedeeld het niveau van voorbijgaande zwakte als één van de vijf klassen om te helpen de efficiëntie van de injectie te voorspellen. Tot slot laten we zien dat het niveau van de transductie rAAVrh10 kan worden voorspeld door de rang van verlamming. Daarom is deze methode voor het bezorgen van de intrathecale AAV inzetbaar verbeteren AAV-gemedieerde gen-voor experimentele therapie van CNS ziekten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Intrathecale (IT) injectie van adeno-associated virus (AAV) heeft veel belangstelling in de therapie van het gen van de CNS uit hoofde van haar veiligheid, noninvasiveness en uitstekende transductie werkzaamheid getrokken in het VNV. Eerdere studies hebben aangetoond de therapeutische werkzaamheid van gentherapie AAV-geleverd in neurodegeneratieve aandoeningen door het bestuur. Echter zijn hoge tarieven van onvoorspelbare falen als gevolg van de technische beperking van IT-beheer in kleine dieren gemeld. Hier, wij opgericht een scoresysteem om aan te geven van de omvang van het succes van Lumbaalpunctie in kleine dieren door 1% lidocaïne waterstofchloride toe te voegen in de injectie-oplossing. Verder laten we zien dat de omvang van de tijdelijke zwakte na injectie de signaaltransductie efficiëntie van AAV kan voorspellen. Dus, is dit IT injectie methode kan worden gebruikt voor het optimaliseren van therapeutische proeven in muismodellen van CNS ziekten die grote regio's van de CNS teisteren.

Muizen toonde verschillende graden van tijdelijke zwakte direct na het injecteren van AAV oplossing in 1% lidocaïne hydrochloride als gevolg van verschillende kwaliteit van intrathecale injectie. Volgens het semi-kwantitatieve 5-grade scoresysteem, we hebben vastgesteld, wij de patronen van de transductie van AAV getest in muizen met verschillende graden van lidocaïne-geïnduceerde ledemaat zwakte (score van 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4; score 5, n = 3). EGFP immunokleuring ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Hier presenteren we een directe intrathecale injectietechniek gebruik van 1% lidocaïne waterstofchloride in een virale oplossing om te zorgen voor efficiënte adeno-associated virus levering aan kleine dieren en een scoresysteem te voorspellen transductie efficiëntie in het midden zenuwstelsel volgens de graad van tijdelijke zwakte veroorzaakt door lidocaïne.

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Deze methode vergemakkelijkt de efficiënte intrathecale levering van adeno-geassocieerde virale transgenes in wakkere kleine dieren voor de experimentele behandeling van ziekten van het centrale zenuwstelsel zoals ALS. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de virale oplossing 1% lidocaïnehydrochloride bevat dat een voorbijgaande verlamming veroorzaakt na een succesvolle injectie. Hoewel deze methode een visuele indicator biedt voor het beoordelen van het succes van de intrathecale geautomatiseerde situatie, is voldoende praktijk essentieel om het slagingspercentage van de levering te verbeteren.Voordat u met de procedure begint, bevestigt u een naald van 27 meter aan een 25 microliter Hamilton-spuit en lijnt u de schuine punt van de naald uit met de volumetrische schaal op de spuit. Laad vervolgens voorzichtig 8 microliter van 4 x 10 tot de 10e genoomkopieën van de virusoplossing in de spuit, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Plaats vervolgens een wakkere 30 tot 70 dagen oude 12 tot 30 gram muis op een bed stuk in de gevoelige positie in een bioveiligheid kap en bedek het bovenlichaam met steriel gaas om de muis te kalmeren en om te voorkomen dat gebeten.Stevig grip op de muis op zijn bekkengordel met de duim aan de ene kant en de wijsvinger en middelvinger aan de andere kant houden van de huid tussen de bilaterale bekkengordels strak met een duim en wijsvinger. Scheer vervolgens de vacht tussen de bilaterale bekkengordels en steriliseer de blootgestelde huid met een jodiumgebaseerde scrub en 70% ethanol. Voor directe intrathecale levering van de adeno-geassocieerde virusoplossing, palpate de intervertebrale ruimte langs de middellijn tussen de bilaterale bekkengordels en gebruik een vingernagel om een inkeping in de huid te drukken om de L5 aan L6 tussenwervelruimte aan te geven.Draai de basis van de staart lichtjes en voorzichtig om de middellijn van de wervelkolom te onthullen en pas de schuine kant van de naald aan de kop van het dier aan. Met de muis stevig in positie, lijn de naald langs de middellijn van de wervelkolom en steek de naald voorzichtig en verticaal in het midden van de inkeping houden van de spuit in een centraal sagittale vlak. Wanneer de naald in contact komt met het bot, langzaam verminderen van de hoek tot ongeveer 30 graden en schuif de naald in de tussenwervel ruimte.Een plotselinge staart flick is een teken van een succesvolle binnenkomst in de intradurale ruimte. Wanneer de naald de tussenwervelruimte binnenkomt, voelt de punt stevig vastgeklemd. Injecteer de vectoroplossing en houd de naald gedurende één minuut in de intradurale ruimte.Trek vervolgens langzaam de naald met rotatie om lekkage te minimaliseren. Scoor onmiddellijk de voorbijgaande zwakte van de muisledematen om de injectiekwaliteit te evalueren en de muis terug te brengen naar zijn kooi voor herstel van de verlamming. Bevestig op het juiste experimentele eindpunt de ledematen en het hoofd van de geïnjecteerde muis in de gevoelige positie op een schuimdoosdeksel en gebruik een schaar om de huid van het hoofd naar het heiligbeen te strippen en te verwijderen.Klem de schedel tussen de ogen, snijd langs de middellijn van de schedel en de horizontale lijn boven het cerebellum en open de schedel aan elke kant. Gebruik een pincet om het occipitaal bot te verwijderen en gebruik oogheelkundige schaar om het ruggenmergkanaal bilateraal te openen. Snijd de ribben aan beide zijden en verwijder voorzichtig het bovenste deel van de wervels.Gebruik gebogen pincet om de hersenen op te heffen en de zenuwen van de schedelbasis te verbreken. Dan zorgvuldig extraheren van de hele hersenen en het ruggenmerg en bevestig de weefsels in 4%paraformaldehyde voor 24 uur. Aan het einde van de fixatieperiode beschermt cryoprotect de hersenen en het rug- en lumbale ruggenmerg in 30% sacharoseoplossing 's nachts bij 4 graden Celsius, gevolgd door inbedden in een optimale snijtemperatuursamenstellingsamenstelling voordat de vrieskou in vloeibare stikstof wordt ingevroren.Gebruik vervolgens een cryostat om 25 micrometer dikke delen van elk weefsel te verkrijgen, waarbij de bevroren secties in 0,01 molaire PBS worden opgeslagen bij 4 graden Celsius zoals ze worden verkregen. Voor immunohistochemische analyse van de weefsels, pretreat de vrij zwevende secties met 1% waterstofperoxide gedurende 10 minuten, gevolgd door een 10 minuten wassen in PBS. Vervolgens broeden de monsters in het blokkeren van oplossing met 5% serum en 0,3% niet-ionisch wasmiddel in PBS gedurende 1 uur, gevolgd door 's nachts etikettering op 4 graden Celsius met de juiste primaire antilichamen van belang.De volgende dag was je de secties met 3 10 minuten wasbeurten in PBS plus Tween en broed de glijbanen uit met de juiste bijbehorende biotinylated secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur na de laatste wasbeurt. Aan het einde van de incubatie, was de secties 3 keer in verse PBST zoals net aangetoond en incubeer de monsters met oneindig biotine peroxidase complex gedurende 40 minuten, gevolgd door vlekken met een geschikte chromogene agent. Monteer de gelabelde secties op glazen microscoopplaten en laat de glijbanen 5 minuten in watervrije ethanol weken zodra de gemonteerde secties volledig zijn opgedroogd.Vervolgens weken de glijbanen in xyleen gedurende 10 minuten en verzegelen ze met een geschikte montage medium. Beeld vervolgens de dia's met een lichtmicroscoop uitgerust met een lading gekoppeld apparaat op 100, 200, en 400 keer vergrotingen. eGFP immunostaining van cervicale en lumbale dwarslaesieweefsel secties onthult weinig of geen transductie in het lumbale ruggenmerg van muizen met een zwakte score van 0, licht verbeterde transductie bij muizen met een zwakte score van 1, en sterke en wijdverspreide transducties bij muizen met een zwakte score van 4 of 5.Kwantificering van de GFP-kleurintensiteit van dwarslaesie van dwarslaesie van muizen met verschillende gradaties van voorbijgaande ledematen, geeft aan dat de ernst van de zwakte na de injectie met virusoplossing nauw correleert met de omvang van de dwarslaesie. In de hersenen worden robuuste eGFP-signalen gedetecteerd in de olfactorische bol, dorsolaterale prefrontale cortex, dentate gyrus en de CA3-zone van de hippocampus, cerebellaire cortex en marginale gebieden van de hersenstam, waaronder de gezichtskern, choroid plexus en de ependymale epitheliale cellen. Motorneuronen in de voorste hoorns worden ook sterk omgezet in verschillende niveaus van het ruggenmerg.Bovendien, in de cortex, GFP positieve neuronen met inbegrip van piramidale cellen worden gedetecteerd, evenals verschillende glia celtypes, waaronder microglia, astrocyten, en oligodendrocyten. Deze techniek stelt onderzoekers in de neurologie veld in staat om de therapeutische effecten van directe intrathecale levering bij kleine wakkere dieren op ziekten van het centrale zenuwstelsel te verkennen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcraniële gelijkstroom stimulatie (TDC's) in muizen

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Dubbele directe bloedinjectie in de Cisterna Magna als model van subarachnoïdale bloeding

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Elektrocorticografische opname van hersenschorsgebieden gemanipuleerd met behulp van een Adeno-geassocieerd virus gericht op cofilin bij muizen

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Intracerebroventriculaire injectie bij muizen

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...