Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von HEBEI Provinz Department of Human Resources und soziale Sicherheit (CY201605) und einen Zuschuss von Natural Science Foundation der Provinz Hebei (H2017206101) finanziert, und wir sind sehr dankbar, dass Dr. Guangping Gao, versorgte sie mit AAV für Diese Studie.

FVB/NJ Mäuse wurden in der Tierstation Key Laboratory der Hebei Neurologie gezüchtet. Alle Maus-Experimente wurden von der zweiten Krankenhaus von Hebei medizinische Universität Ethikkommission genehmigt und durchgeführt nach den Vorschriften des Labor Tiermanagement unter Beachtung der vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China.
1. Vorbereitung von 20 % Lidocain Hydrochlorid-Stammlösung
<ol><li>Wiegen Sie Lidocain Hydrochlorid 2 g. 5 – 6 mL sterilem Was...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Technisch gibt es mehrere wichtige Schritte während der IT-Injektion bei Mäusen wach. Erste, richtige Geste und Firma Kontrolle der Mäuse während der gesamten Operation ist Voraussetzung für die erfolgreiche Zustellung. Zweitens ist der schwierigste Punkt den Bandscheiben Raum mit der Nadelspitze, Gefühl, wie es notwendig, nicht zu tief ohne Widerstand einfügen oder gewaltsam unter starken Widerstand ist bei verletzen die Tiere oder die Nadelspitze biegen einfügen. Drittens, obwohl die vorübergehende Lähmung du...

AAV kann vermitteln langfristige und weit verbreitete Genexpression in der CNS-Transduktion mit wenigen Nebenwirkungen und daher eines der vielversprechendsten Fahrzeuge für Gen-Therapie zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Huntington es geworden Krankheit (HK), Alzheimer-Krankheit (AD), lysosomale Speicherkrankheiten (LSD), Gaucher-Krankheit (GD) und neuronale Ceroid Lipofuscinosis (NCL)1. Derzeit sind mehr als 100 AAV Serotypen von Mensch und Tier isoliert gewesen. Unter diesen sind mindestens 12 dienten in präklinischen und klinischen Studien, darunter die am häufigsten verwendeten gen Vektoren wie AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 und rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Andere ZNS-Erkrankungen erfordern unterschiedliche AAV Lieferung Strategien aufgrund der verschiedenen betroffenen CNS Regionen und Zelltypen. Die CNS Regionen und Zelle Arten, die AAV transduzieren kann variiert je nach der Serotyp sowie Versandart. Z. B. rAAVrh10 nachweislich überwiegend transduzieren Astrozyten im Auslieferungszustand durch systemische intravenöse Injektion (IV), während es Neuronen und Glia im Auslieferungszustand durch intrathekale Injektion4,7ausgestrahlt. Darüber hinaus führte Parenchym Injektion in lokalen Transduktion bis in die Nähe der Injektionsstelle, während Injektion in den Liquor cerebrospinalis (CSF) durch intraventrikuläre oder intrathekale Injektion führte zu weit verbreiteten CNS Transduktion8 . Studien haben auch therapeutische Potenz der AAV geliefert Gentherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen dadurch Verwaltung9,10,11gezeigt. Bei Erkrankungen, die weite Bereiche des ZNS wie ALS betreffen, hat sich intrathekale Injektion in den Liquor gezeigt, die meisten Bereiche abzudecken, die durch die Krankheit mit einer niedrigeren Dosis, im Vergleich zu einer systemischen Lieferung Methode4,10befallen sind. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass Lumbalpunktion AAV injizieren in Mausmodellen für ALS, die mögliche Verletzungen verbunden mit Laminektomie und intrathekale Katheterisierung4vermeidet einsetzbar.
Experimentelle direkte Lumbalpunktion wurde zuerst verwendet, das Rückenmark zur Analgesie und Anästhesie in 188512,13Agenten, vor allem Anästhetika, anzubieten. In diesem Bericht zeigen wir die lumbale Punktion IT Injektionsverfahren bei Erwachsenen Mäusen mit Hilfe von 1 % Lidocain Hydrochlorid, einem lokalen Amid abgeleitet Betäubungsmittel in die Injektionslösung zur Bewertung und Überwachung der Qualität der Injektion. Erfolgreiche Injektionen waren geprägt von Lidocain-induzierte vorübergehende Lähmung, während fehlerhafte Injektionen nicht dieses Verhalten zeigen. Wir klassifizieren die Höhe der vorübergehende Schwäche als einer der fünf Klassen, um die Effizienz der Injektion vorherzusagen. Schließlich zeigen wir, dass die rAAVrh10 Transduktion Ebene durch den Grad der Lähmung vorhergesagt werden kann. Daher kann diese intrathekale AAV Lieferung Methode verwendet werden, um AAV-vermittelten gen-Lieferung für experimentelle Therapie von ZNS-Erkrankungen zu verbessern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Intrathekale (IT) Injektion von Adeno-assoziierte Virus (AAV) hat großes Interesse in der CNS Gentherapie aufgrund seiner Sicherheit, Noninvasiveness und ausgezeichnete Transduktion Wirksamkeit im ZNS gezogen. Frühere Studien zeigten die therapeutische Wirksamkeit der AAV geliefert Gentherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen dadurch Verwaltung. Jedoch wurden hohe Raten von unvorhersehbaren Ausfall aufgrund der technischen Begrenzung der IT-Administration bei kleinen Tieren berichtet. Hier haben wir ein scoring-System um den Erfolg der Lumbalpunktion bei Kleintieren, inwieweit durch Zugabe von 1 % Lidocain Hydrochlorid in der Injektionslösung. Wir zeigen weiter, dass das Ausmaß der vorübergehende Schwäche nach der Injektion die Transduktion Effizienz der AAV vorhersagen kann. So kann dieser IT-Injektionsverfahren zur Therapiestudien in Mausmodellen der ZNS-Erkrankungen zu optimieren, die weite Bereiche des ZNS zu bedrängen.

Mäuse zeigten unterschiedliche Grade der vorübergehende Schwäche gleich nach es Injektion AAV Lösung in 1 % Lidocain Hydrochlorid aufgrund unterschiedlicher Qualität der intrathekale Injektion. Nach der semi-quantitative 5 Grade scoring-System haben wir eingerichtet, wir testeten die Transduktion Muster der AAV bei Mäusen mit unterschiedlichem Lidocain-induzierte Gliedmaßen Schwäche (score 0, n = 2; Tor 1, n = 1; Note 4, n = 4; 5, n Punkte = 3). EGFP Immunostaining von Rückenmark...

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Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Hier präsentieren wir Ihnen eine direkte intrathekale Injektionstechnik mit 1 % Lidocain Hydrochlorid in eine virale Lösung gewährleisten effizienten Adeno-assoziierten Viren Lieferung an Kleintieren und etablieren ein scoring-System zur Vorhersage der Transduktion Effizienz im zentralen Nervensystem nach dem Grad der vorübergehende Schwäche durch Lidocain induziert.

Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Diese Methode erleichtert die effiziente intrathekale Abgabe von adenoassoziierten viralen Transgenen bei wachen Kleintieren für die experimentelle Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie ALS. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass die virale Lösung 1%Lidocainhydrochlorid enthält, das nach einer erfolgreichen Injektion eine vorübergehende Lähmung induziert. Obwohl diese Methode einen visuellen Indikator für die Beurteilung des Erfolgs der intrathekalen automatisierten Situation bietet, ist eine ausreichende Praxis unerlässlich, um die Erfolgsrate der Lieferung zu verbessern.Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, befestigen Sie eine 27-Spur-Nadel an einer 25-Mikroliter-Hamilton-Spritze und richten Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel an der Volumetskala auf der Spritze aus. Dann 8 Mikroliter von 4 x 10 vorsichtig in die 10. Genomkopien der Viruslösung in die Spritze laden, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden. Als nächstes legen Sie eine wache 30 bis 70 Tage alte 12 bis 30 Gramm Maus auf ein Bettstück in der anfälligen Position in einer Biosicherheitshaube und bedecken Sie den Oberkörper mit steriler Gaze, um die Maus zu beruhigen und zu vermeiden, gebissen zu werden.Greifen Sie die Maus fest auf ihren Beckengürtel mit dem Daumen auf der einen Seite und dem Zeigefinger und Mittelfinger auf der anderen Seite, die die Haut zwischen den bilateralen Beckengürteln mit Daumen und Zeigefinger straff halten. Dann rasieren Sie das Fell zwischen den bilateralen Beckengürteln und sterilisieren Sie die exponierte Haut mit einem Jod-basierten Peeling und 70%Ethanol. Zur direkten intrathekalen Abgabe der adenoassoziierten Viruslösung, palpatieren Sie den Intervertebralen Raum entlang der Mittellinie zwischen den bilateralen Beckengürteln und verwenden Sie einen Fingernagel, um eine Einbuchtung in die Haut zu drücken, um den Bandwirbelraum L5 bis L6 anzuzeigen.Drehen Sie die Basis des Schwanzes leicht und sanft, um die Mittellinie der Wirbelsäule zu offenbaren und passen Sie die Nadelnadel in Richtung des Kopfes des Tieres an. Wenn die Maus fest in Position fixiert ist, richten Sie die Nadel entlang der Mittellinie der Wirbelsäule aus und legen Sie die Nadel sanft und vertikal in die Mitte des Einzugs ein, wobei die Spritze in einer zentralen sagittalen Ebene gehalten wird. Wenn die Nadel mit dem Knochen in Berührung kommt, verringern Sie langsam den Winkel auf etwa 30 Grad und schieben Sie die Nadel in den Intervertebralraum.Ein plötzlicher Schwanzstreifen ist ein Zeichen für einen erfolgreichen Einstieg in den intraduralen Raum. Wenn die Nadel in den Intervertebralen Raum eintritt, fühlt sich die Spitze fest geklemmt. Injizieren Sie die Vektorlösung, und halten Sie die Nadel innerhalb des intraduralen Raumes für eine Minute.Ziehen Sie dann langsam die Nadel mit Rotation ab, um Leckagen zu minimieren. Bewerten Sie sofort die vorübergehende Schwäche der Mausgliedmaßen, um die Injektionsqualität zu bewerten und die Maus in ihren Käfig zurück, um sich von der Lähmung zu erholen. Fixieren Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt die Gliedmaßen und den Kopf der injizierten Maus in der anfälligen Position auf einer Schaumstoffbox-Abdeckung und verwenden Sie eine Schere, um die Haut vom Kopf bis zum Kreuzbein zu entfernen.Clip den Schädel zwischen den Augen, schnitt entlang der Mittellinie des Schädels und die horizontale Linie über dem Kleinhirn und öffnen Sie den Schädel auf jeder Seite. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Okzipitalknochen zu entfernen und verwenden Sie eine Augenschere, um den Spinalkanal bilateral zu öffnen. Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten und entfernen Sie vorsichtig den oberen Teil der Wirbel.Verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um das Gehirn zu heben und die Nerven der Schädelbasis zu trennen. Dann das gesamte Gehirn und Rückenmark sorgfältig extrahieren und das Gewebe in 4%Paraformaldehyd für 24 Stunden fixieren. Am Ende der Fixierungsphase, kryoprotect das Gehirn und Zervix und Lendenrückenmark in 30%Saccharose-Lösung über Nacht bei 4 Grad Celsius gefolgt von einbetten in optimale Schneidtemperatur Verbindung vor dem Einfrieren des Spülens in flüssigen Stickstoff.Verwenden Sie dann einen Kryostat, um 25 Mikrometer dicke Abschnitte von jedem Gewebe zu erhalten, speichern Sie die gefrorenen Abschnitte in 0,01 Molar PBS bei 4 Grad Celsius, wie sie erhalten werden. Für die immunhistochemische Analyse des Gewebes, die frei schwebenden Abschnitte mit 1%Wasserstoffperoxid für 10 Minuten, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche in PBS. Als nächstes inkubieren die Proben in einer Blockierlösung, die 5%Serum und 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel in PBS für 1 Stunde enthält, gefolgt von einer Nachtetikettierung bei 4 Grad Celsius mit den entsprechenden primären Antikörpern von Interesse.Am nächsten Tag die Abschnitte mit 3 10 Minuten Wäscht in PBS plus Tween waschen und die Dias mit den entsprechenden biotinylierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur 1 Stunde nach der letzten Wäsche bebrüten. Am Ende der Inkubation die Abschnitte 3 Mal in frischem PBST waschen, wie gerade gezeigt, und die Proben mit unendlichem Biotinperoxidase-Komplex für 40 Minuten inkubieren, gefolgt von der Färbung mit einem geeigneten chromogenen Mittel. Montieren Sie die beschrifteten Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias und tränken Sie die Dias 5 Minuten lang in wasserfreies Ethanol, sobald die montierten Abschnitte vollständig getrocknet sind.Als nächstes die Dias in Xylol für 10 Minuten einweichen und mit einem geeigneten Montagemedium versiegeln. Dann stellen Sie die Dias mit einem Lichtmikroskop mit einem ladungsgekoppelten Gerät bei 100- und 400-fachen Vergrößerungen vor. Die eGFP-Immunostainierung von Hals- und Lendenrückengewebeabschnitten zeigt wenig oder gar keine Transduktion im Lendenrücken von Mäusen mit einem Schwächenwert von 0, leicht verbesserte Transduktion bei Mäusen mit einem Schwächenwert von 1 und starke und weit verbreitete Transduktionen bei Mäusen mit einem Schwächenwert von 4 oder 5.Die Quantifizierung der GFP-Färbungsintensität von Rückenmarksgewebeabschnitten von Mäusen, die verschiedene Grade der vorübergehenden Gliedmaßenschwäche aufweisen, deutet darauf hin, dass die Schwere der Schwäche nach der Injektion der Viruslösung eng mit dem Ausmaß der Rückenmarkstransduktion korreliert. Im Gehirn werden robuste eGFP-Signale in der Olfaktor-Lampe, dorsolateralen präfrontalen Kortex, Dentate Gyrus und der CA3-Zone des Hippocampus, kleinhirnskaxischen Kortex und Randbereichen des Hirnstamms, einschließlich des Gesichtskerns, des Aderhautplexus und der ependymalen Epithelzellen, detektiert. Motorneuronen in den vorderen Hörnern werden auch stark in verschiedenen Ebenen des Rückenmarks transduziert.Darüber hinaus werden im Kortex GFP-positive Neuronen einschließlich Pyramidenzellen sowie verschiedene Gliazelltypen wie Mikroglia, Astrozyten und Oligodendrozyten nachgewiesen. Diese Technik ermöglicht es Forschern im Bereich der Neurologie, die therapeutischen Wirkungen der direkten intrathekalen Entbindung bei kleinen wachen Tieren auf Erkrankungen des zentralen Nervensystems zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Forschung

Neurowissenschaften

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) bei Mäusen

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Doppelte Direkteinspritzung von Blut in die Cisterna Magna als Modell der subarachnoiden Blutung

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Elektrokortikographische Aufzeichnung von Großhirnrindenbereichen manipuliert mit einem Adeno-assoziierten Virus, das auf Cofilin bei Mäusen abzielt

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Intrazerebroventrikuläre Injektion bei Mäusen

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Intrathekale Injektion von neugeborenen Mäusen zur Genomeditierung und Medikamentenverabreichung

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...