Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי מענק של חביי המחוז המחלקה של משאבי אנוש, ביטוח לאומי (CY201605), מענק של מדעי הטבע קרן של מחוז הביי (H2017206101), ואנחנו מאוד אסיר תודה ד ר על גאו Guangping, שסיפק את AAV עבור מחקר זה.

FVB/NJ עכברים התרבית במתקן בעלי חיים של מעבדה מפתח לנוירולוגיה של חביי. כל עכבר ניסויים היו שאושרו על-ידי השנייה בבית החולים של חביי רפואי אוניברסיטת ועדת האתיקה, עפ י התקנון של ניהול חיות מעבדה שיפורסמו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה העממית של סין.
1. הכנת 20% לידוקאין ...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

טכנית, ישנם מספר שלבים קריטיים במהלך הזריקה זה בעכברים ער. ראשית, ראוי המחווה ושליטה המשרד של העכברים לאורך כל המבצע הוא תנאי מוקדם מסירה מוצלחת. שנית, הנקודה הכי קשה הוא מרגיש את החלל בין-חולייתי עם קצה המחט, כפי שנדרש לא להוסיף יותר מדי עמוק ללא התנגדות או להוסיף בכפייה תחת התנגדות חריפה ב?...

AAV יכולים לתווך גנים בהעברת CNS עם מעט תופעות לוואי לטווח ארוך ונפוץ, ולכן הפך לאחד הרכבים המבטיחים ביותר עבור ריפוי גנטי לטיפול במחלות CNS כולל נוירודגנרטיביות (ALS), הנטינגטון (HD), מחלת אלצהיימר (AD), באנזימים מחלות (LSD), מחלת Gaucher (GD) מחלות ceroid עצביים lipofuscinosis (NCL)1. כיום, יותר מ-100 AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם היה מבודד של בני האדם ובעלי החיים. בין אלה, לפחות 12 השתמשו בפרה, ניסויים קליניים, כולל הנפוץ ביותר בשימוש ג'ין וקטורים כגון AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ו- rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
מחלות מערכת העצבים המרכזית שונות דורשות אסטרטגיות שונות משלוח AAV עקב אזורים המושפעים CNS סוגי תאים שונים. CNS אזורים של התא סוגי AAV יכול מגלי משתנה בהתאם serotype כמו גם שיטת מסירה. לדוגמה, rAAVrh10 הוכח מגלי בעיקר האסטרוציטים כאשר נמסר על ידי הזרקה תוך ורידי סיסטמי (IV), ואילו זה transduced נוירונים וגם עכשיו, דונלד כאשר נמסר על ידי במחלה הזרקה4,7. בנוסף, הביאו parenchyma הזרקת התמרה חושית מקומיים כדי באזור ההזרקה, ואילו זריקה לתוך הנוזל מוחי שדרתי (CSF) דרך ע או הזרקת במחלה, גרמו CNS נפוצה של התמרה חושית8 . מחקרים גם הראו עוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל9,10,11. מחלות המשפיעות על אזורים רחבים של מערכת העצבים כגון ALS, במחלה הזרקה לתוך CSF הוכח כדי לכסות את רוב אזורים נגועים על ידי המחלה במינון נמוך, בהשוואה למשלוח מערכתית שיטה4,10. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם שאת המותני ניתן להזריק AAV במודלים של העכבר על ALS, אשר מונע פציעות פוטנציאליות המשויך צנתור laminectomy ולא במחלה4.
ניסיוני מותני ישירה שימש תחילה למסור סוכנים, בייחוד הרדמה, חוט השדרה שיכוך כאבים, הרדמה 188512,13. בדו ח זה, אנו ממחישים הניקוב המותני זה בשיטת הזרקת בעכברים בוגרים בסיועם של 1% לידוקאין הידרוכלוריד, מקומיים אמיד-derived הרדמה, בפתרון הזרקת להעריך, לפקח על איכות הזרקה. זריקות מוצלחות סומנו על ידי לידוקאין-induced שיתוק חולף, בעוד זריקות כושלות לא הראה התנהגות זו. אנו מסווגים את הרמה של חולשה ארעי כאחת חמישה ציונים כדי לעזור לחזות את יעילות הזרקת. לבסוף, אנו מראים כי רמת התמרה חושית rAAVrh10 עשוי להיות שמנבאת את הציון של שיתוק. לכן, שיטת העברה זו במחלה AAV יכול לשמש כדי לשפר את המסירה הגן בתיווך AAV לטיפול ניסיוני של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

הזרקת במחלה (IT) של adeno-הקשורים וירוס (AAV) יש עניין רב ב- CNS ריפוי גנטי מכוח את הבטיחות, noninvasiveness, והיעילות התמרה חושית מעולה שלופה מערכת העצבים. מחקרים קודמים הדגימו העוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל. עם זאת, שיעור גבוה של כשל לא צפוי עקב המגבלה הטכנית של הממשל זה חיות קטנות דווחו. . הנה, הקמנו מערכת הניקוד כדי לציין את מידת ההצלחה מותני אצל בעלי חיים קטנים על-ידי הוספת 1% לידוקאין הידרוכלוריד בתוך תמיסת הזרקה. בהמשך נראה כי מידת החולשה ארעית לאחר ההזרקה ניתן לחזות את יעילות התמרה חושית AAV. לכן, בשיטה זו זריקה זה יכול לשמש כדי למטב טיפולית ניסויים במודלים של העכבר של מחלות מערכת העצבים המרכזית מעשן יותר אזורים רחב של מערכת העצבים.

עכברים הראה דרגות שונות של חולשה חולף מיד אחרי זה הזרקה של פתרון AAV הידרוכלוריד לידוקאין 1% בשל איכות שונות של הזרקת במחלה. על פי כמותיים חצי כיתה 5 מערכת התוצאות הקמנו, בדקנו את הדפוסים התמרה חושית של AAV בעכברים עם דרגות שונות של האיבר לידוקאין-induced חולשה (ציון 0, n = 2; ציון 1, n =...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

כאן אנו מציגים טכניקה הזרקה ישירה במחלה באמצעות הידרוכלוריד לידוקאין 1% פתרון ויראלי להבטיח משלוח וירוס יעיל adeno-הקשורים לבעלי חיים קטנים ולהקים מערכת הניקוד לחזות התמרה חושית יעילות המרכזי מערכת העצבים על פי מידת חולשה חולפת הנגרמת על ידי לידוקאין.

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

שיטה זו מאפשרת אספקה תוך-פתאתקלית יעילה של מהוומני נגיפיים הקשורים לאדונו בבעלי חיים קטנים ערים לטיפול ניסיוני במחלות של מערכת העצבים המרכזית כגון ALS. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי הפתרון הנגיפי כולל 1%lidocaine הידרוכלוריד אשר גורם שיתוק חולף לאחר זריקה מוצלחת. למרות ששיטה זו מספקת אינדיקטור חזותי לשיפוט ההצלחה של המצב האוטומטי האינטרתתקלי, תרגול מספיק חיוני לשיפור שיעור ההצלחה של המסירה.לפני תחילת ההליך, לצרף מחט מד 27 למזרק המילטון 25 microliter וליישר את הקצה משופע של המחט עם סולם נפחי על המזרק. ואז בזהירות לטעון 8 microliters של 4 x 10 עותקים הגנום העשירי של פתרון הנגיף לתוך המזרק, דואג להימנע בועות. לאחר מכן, מניחים עכבר ער בן 30 עד 70 יום 12 עד 30 גרם על חתיכת מיטה בתקורה נוטה במכסה המנוע biosafety ולכסות את הגוף העליון עם גזה סטרילית כדי להרגיע את העכבר כדי למנוע ננשך.אחז בחוזקה בעכבר על מחוך האגן שלו עם האגודל בצד אחד והאצבע האמצעית והאצבע האמצעית בצד השני, תוך שמירה על העור בין מחוכי האגן הדו-צדדיים מתוחים עם אגודל ואצבע. לאחר מכן לגלח את הפרווה בין מחוכים האגן הדו-צדדיים ולעקר את העור החשוף עם קרצוף מבוסס יוד ו 70% אתנול. למסירה פנימית ישירה של פתרון הנגיף הקשור לאדונו, יש למחוץ את המרחב הבין חולייתי לאורך קו האמצע בין מחוך האגן הדו-צדדי ולהשתמש בציפורניים כדי לדכא כניסה לתוך העור כדי לציין את החלל הבין חולייתי L5 עד L6.סובב את בסיס הזנב מעט בעדינות כדי לחשוף את קו האמצע של עמוד השדרה ולהתאים את השיפה של המחט לכיוון ראש החיה. עם העכבר קבוע בחוזקה למקומו, ליישר את המחט לאורך קו האמצע של עמוד השדרה ולהכניס את המחט בעדינות ואנכית למרכז הכניסה שמירה על המזרק במישור קשת מרכזי. כאשר המחט באה במגע עם העצם, לאט לאט להקטין את הזווית כ 30 מעלות להחליק את המחט לתוך החלל הבין חולייתי.תנועה פתאומית בזנב היא סימן לכניסה מוצלחת לחלל התוך-טבעי. כאשר המחט נכנסת לחלל הבין חולייתי, הקצה ירגיש מהודק היטב. להזריק את הפתרון הווקטורי, ולשמור על המחט בתוך החלל התוך-עורי במשך דקה אחת.ואז לאט למשוך את המחט עם סיבוב כדי למזער את הדליפה. מיד ציון החולשה החולף של גפי העכבר כדי להעריך את איכות ההזרקה ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה להתאוששות מן השיתוק. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, לתקן את הגפיים ואת הראש של העכבר מוזרק במצב נוטה על כיסוי תיבת קצף ולהשתמש מספריים כדי להסיר את העור מהראש אל sacrum.חותכים את הגולגולת בין העיניים, חותכים לאורך קו האמצע של הגולגולת ואת הקו האופקי מעל המוח הקטן ולפתוח את הגולגולת מכל צד. השתמש פינצטה כדי להסיר את העצם העורפית ולהשתמש מספריים עיניים כדי לפתוח את תעלת עמוד השדרה דו צדדית. חותכים את הצלעות משני הצדדים ומסירים בזהירות את החלק העליון של החוליות.השתמש פינצטה מעוגלת כדי להרים את המוח ולנתק את העצבים של בסיס הגולגולת. ואז בזהירות לחלץ את המוח כולו ואת חוט השדרה ולתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות. בסוף תקופת הקיבוע, cryoprotect המוח ואת חוט השדרה צוואר הרחם המותני ב 30% פתרון סוכרוז לילה ב 4 מעלות צלזיוס ואחריו הטבעה תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לפני הצמד הקפאה בחנקן נוזלי.לאחר מכן להשתמש cryostat כדי להשיג 25 חלקים עבים מיקרומטר של כל רקמה, אחסון החלקים הקפואים ב 0.01 PBS טוחן ב 4 מעלות צלזיוס כפי שהם מתקבלים. לניתוח אימונוהיסטוכימי של הרקמות, יש לפנות את החלקים הצפים החופשיים עם 1%מי חמצן למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף 10 דקות ב-PBS. הבא דגירה הדגימות בתת פתרון חסימה המכיל 5%סרום ו 0.3% דטרגנט לא יוני ב PBS במשך שעה אחת ואחריו תיוג לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים המתאימים של עניין.למחרת, לשטוף את החלקים עם 3 10 דקות שוטף PBS בתוספת Tween ולהדקר את המגלשות עם נוגדנים משניים biotinylated המתאים בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה לאחר לשטוף האחרון. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים 3 פעמים PBST טרי כפי שהודגם רק להדגים את הדגימות עם קומפלקס פרוקסידאז ביוטין אינסוף במשך 40 דקות ואחריו כתמים עם סוכן כרומוגני המתאים. הר את החלקים המסווים על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית להשרות את המגלשות באתנול נטול מים במשך 5 דקות לאחר החלקים רכוב התייבש לחלוטין.הבא להשרות את השקופיות קסילן במשך 10 דקות ולאטום אותם עם מדיום הרכבה מתאים. לאחר מכן דמיין את השקופיות עם מיקרוסקופ קל המצויד במטען יחד עם הגדלות של 100, 200 ו- 400 פעמים. eGFP immunostaining של חלקי רקמת חוט השדרה צוואר הרחם המותני מגלה טרנסדוקציה קטנה או ללא טרנסדוקציה בחוט השדרה המותני של עכברים עם ציון חולשה של 0, טרנסדוקציה משופרת במקצת בעכברים עם ציון חולשה של 1, ותמרים חזקים ונרחבים בעכברים עם ציון חולשה של 4 או 5.כימות עוצמת הכתמים של GFP של מקטעי רקמת חוט השדרה מעכברים המציגים דרגות שונות של חולשת גפיים ארעית מצביע על כך שחומרת החולשה לאחר הזרקת פתרון הנגיף תואמת באופן הדוק את היקף ההעתקה של חוט השדרה. במוח, אותות eGFP חזקים מזוהים בנורה חוש הריח, קליפת המוח הקדם-מצחית הגבית-מצחית, gyrus שקע, ואת אזור CA3 של ההיפוקמפוס, קליפת המוח הקטן, ואת האזורים השוליים של גזע המוח, כולל גרעין הפנים, מקלעת choroid, ואת תאי האפיתל ependymal. נוירונים מוטוריים בקרניים לפנים הם גם מתמר בחוזקה ברמות שונות של חוט השדרה.יתר על כן, בקליפת המוח, נוירונים חיוביים GFP כולל תאים פירמידליים מזוהים, כמו גם סוגים שונים של תאי גליה כולל microglia, אסטרוציטים, ו oligodendrocytes. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הנוירולוגיה לחקור את ההשפעות הטיפוליות של מסירה תוך-תיתטית ישירה בבעלי חיים ערים קטנים על מחלות של מערכת העצבים המרכזית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subnial Adeno הקשורים וירוסים 9 (AAV9) וקטור משלוח ב עכברים למבוגרים

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

טראנס זרם ישיר גירוי (tDCS) בעכברים

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

הזרקת דם ישירה כפולה לתוך מגנה צ'יסטרנה כודל של דימום Subarachnoid

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

הקלטה אלקטרוקורטיקוגרפית של אזורי קליפת המוח מניפולציה באמצעות וירוס הקשור אדנו מיקוד Cofilin בעכברים

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

הזרקה תוך-מוחית בעכברים

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...