Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

यह काम मानव संसाधन और सामाजिक सुरक्षा (CY201605) और हेबै प्रांत (H2017206101) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन से एक अनुदान के हेबै प्रांतीय विभाग से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और हम Guangping गाओ, जो के लिए AAV प्रदान के लिए डॉ के लिए बहुत आभारी हैं इस अध्ययन ।

FVB/एनजे चूहों हेबै न्यूरोलॉजी के प्रमुख प्रयोगशाला के पशु सुविधा में नस्ल थे । सभी माउस प्रयोगों हेबै चिकित्सा विश्वविद्यालय नैतिकता समिति के दूसरे अस्पताल द्वारा अनुमोदित किया गया और विज्ञान और पीप?...

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	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

तकनीकी तौर पर जागे चूहों में आईटी इंजेक्शन के दौरान कई अहम कदम उठाए जाते हैं । सबसे पहले, उचित इशारा और पूरे ऑपरेशन भर में चूहों की फर्म नियंत्रण सफल प्रसव के लिए एक शर्त है । दूसरा, सबसे कठिन बिंदु सुई टि?...

AAV कुछ साइड इफेक्ट के साथ सीएनएस transduction में दीर्घकालिक और व्यापक जीन अभिव्यक्ति मध्यस्थता कर सकते हैं, और इसलिए पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) सहित सीएनएस रोगों का इलाज करने के लिए जीन थेरेपी के लिए सबसे होनहार वाहनों में से एक बन गया है, Huntington रोग (एचडी), अल्जाइमर रोग (AD), lysosomal स्टोरेज डिजीज (एलएसडी), गौचर रोग (GD), और न्यूरॉन ceroid lipofuscinosis (एनसीएल)1. वर्तमान में, अधिक से अधिक १०० AAV serotypes मनुष्यों और जानवरों से अलग किया गया है । इन के अलावा, 12 नैदानिक और नैदानिक परीक्षणों में इस्तेमाल किया गया है, जिनमें सबसे अधिक इस्तेमाल किया जीन वैक्टर जैसे AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh .8, और rAAVrh .101,2,3,4, 5,6.
विभिंन सीएनएस रोगों विभिंन AAV वितरण रणनीतियों विभिंन प्रभावित सीएनएस क्षेत्रों और सेल प्रकार के कारण की आवश्यकता है । सीएनएस क्षेत्र और कक्ष प्रकार जो AAV transduce कर सकते हैं, सीरोटाइप और साथ ही वितरण पद्धति के आधार पर भिन्न होता है । उदाहरण के लिए, rAAVrh10 जब प्रणालीगत नसों इंजेक्शन (IV) द्वारा दिया transduce मुख्य रूप से astrocytes करने के लिए दिखाया गया है, जबकि यह दोनों ंयूरॉंस और glia जब intrathecal इंजेक्शन4,7द्वारा दिया transduced । इसके अतिरिक्त, पैरेन्काइमा इंजेक्शन स्थानीय transduction में इंजेक्शन साइट के आसपास के परिणामस्वरूप, मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) संवहन या intrathecal इंजेक्शन के माध्यम से में इंजेक्शन जबकि 8 transduction व्यापक सीएनएस के परिणामस्वरूप . अध्ययन भी AAV की चिकित्सीय शक्ति का प्रदर्शन किया है-neurodegenerative विकारों में यह प्रशासन द्वारा जीन थेरेपी दिया9,10,11। रोग है कि ALS के रूप में सीएनएस के व्यापक क्षेत्रों को प्रभावित करने में, intrathecal इंजेक्शन सीएसएफ में सबसे अधिक क्षेत्रों है कि एक कम खुराक के साथ रोग से पीड़ित हैं कवर करने के लिए दिखाया गया है, एक प्रणालीगत वितरण पद्धति की तुलना में4,10. हाल के अध्ययनों से यह भी पता चला है कि काठ का पंचर ALS के लिए माउस मॉडलों में AAV इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो laminectomy और intrathecal कैथीटेराइजेशन4के साथ जुड़े संभावित चोटों से बचा जाता है ।
प्रयोगात्मक प्रत्यक्ष काठ का पंचर पहले एजेंटों, विशेष रूप से निश्चेतक, १८८५12,13में analgesia और संज्ञाहरण के लिए रीढ़ की हड्डी के लिए वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस रिपोर्ट में, हम का मूल्यांकन और इंजेक्शन की गुणवत्ता की निगरानी के लिए इंजेक्शन समाधान में 1% lidocaine हाइडरोक्लॉराइड, एक स्थानीय के बीच-व्युत्पंन संवेदनाहारी, की सहायता से वयस्क चूहों में काठ का पंचर आईटी इंजेक्शन विधि उदाहरण देकर स्पष्ट करना । सफल इंजेक्शन lidocaine प्रेरित क्षणिक पक्षाघात द्वारा चिह्नित किया गया था, जबकि विफल इंजेक्शन यह व्यवहार नहीं दिखा था । हम इंजेक्शन दक्षता की भविष्यवाणी में मदद करने के लिए पांच ग्रेड में से एक के रूप में क्षणिक कमजोरी के स्तर पर वर्गीकृत । अंत में, हम बताते है कि rAAVrh10 transduction स्तर पक्षाघात के ग्रेड से भविष्यवाणी की जा सकती है । इसलिए, इस intrathecal AAV प्रसव विधि सीएनएस रोगों की प्रायोगिक चिकित्सा के लिए AAV मध्यस्थता जीन प्रसव को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Intrathecal (आईटी) adeno के इंजेक्शन-जुड़े वायरस (AAV) सीएनएस में अपनी सुरक्षा, इनवेसिव, और उत्कृष्ट transduction प्रभावकारिता के आधार पर सीएनएस जीन थेरेपी में काफी रुचि खींची है । पिछले अध्ययनों AAV की चिकित्सीय शक्ति का प्रदर्शन किया है-neurodegenerative विकारों में आईटी प्रशासन द्वारा जीन थेरेपी दिया । हालांकि, छोटे पशुओं में आईटी प्रशासन की तकनीकी सीमा के कारण अप्रत्याशित विफलता की उच्च दरों की सूचना दी गई है । यहां, हम एक स्कोरिंग प्रणाली इंजेक्शन समाधान में 1% lidocaine हाइडरोक्लॉराइड जोड़कर छोटे जानवरों में काठ का पंचर की सफलता की सीमा को इंगित करने के लिए स्थापित किया । हम आगे बताते है कि क्षणिक कमजोरी की हद तक निंनलिखित इंजेक्शन AAV की transduction क्षमता का अनुमान कर सकते हैं । इस प्रकार, यह इंजेक्शन विधि सीएनएस रोगों के माउस मॉडल में चिकित्सीय परीक्षणों कि सीएनएस के व्यापक क्षेत्रों पीड़ित का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

चूहों ने क्षणिक कमजोरी के विभिन्न अंशों को सही दिखाया इसके बाद AAV सॉल्यूशन का इंजेक्शन 1% lidocaine हाइडरोक्लॉराइड में intrathecal इंजेक्शन की विभिन्न गुणवत्ता के कारण. के अनुसार अर्द्ध मात्रात्मक 5 ग्र?...

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Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

यहाँ हम एक प्रत्यक्ष intrathecal इंजेक्शन तकनीक एक वायरल समाधान में 1% lidocaine हाइडरोक्लॉराइड का उपयोग करने के लिए कुशल adeno से जुड़े वायरस वितरण सुनिश्चित करने के लिए वर्तमान छोटे जानवरों के लिए और एक स्कोरिंग प्रणाली केंद्र में transduction दक्षता की भविष्यवाणी करने के लिए स्थापित lidocaine द्वारा प्रेरित क्षणिक कमजोरी की डिग्री के अनुसार तंत्रिका तंत्र.

रिकॉमबिनेंट Adeno-वयस्क चूहों में जुड़े वायरस के प्रत्यक्ष Intrathecal इंजेक्शन

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

यह विधि एएलएस जैसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों के प्रयोगात्मक उपचार के लिए जाग छोटे जानवरों में एडेनो से जुड़े वायरल ट्रांसजीन के कुशल इंट्राथेकल डिलीवरी की सुविधा प्रदान करती है। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि वायरल समाधान में 1% लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड शामिल है जो एक सफल इंजेक्शन के बाद क्षणिक पक्षाघात को प्रेरित करता है। यद्यपि यह विधि इंट्राथेकल स्वचालित स्थिति की सफलता को पहचानने के लिए एक दृश्य संकेतक प्रदान करता है, वितरण की सफलता दर में सुधार के लिए पर्याप्त अभ्यास आवश्यक है।प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एक 25 माइक्रोलीटर हैमिल्टन सिरिंज के लिए एक 27 गेज सुई देते हैं और सिरिंज पर वॉल्यूमेट्रिक पैमाने के साथ सुई के beveled टिप संरेखित करें। फिर ध्यान से सिरिंज में वायरस समाधान की 10 वीं जीनोम प्रतियों के लिए 4 x 10 के 8 माइक्रोलीटर लोड, बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखते हुए। इसके बाद, एक जाग 30 से 70 दिन पुराने 12 से 30 ग्राम माउस को जैव सुरक्षा हुड में प्रवण स्थिति में एक बिस्तर के टुकड़े पर रखें और माउस को शांत करने और काटे जाने से बचने के लिए ऊपरी शरीर को बाँझ धुंध से ढक दें।एक तरफ अंगूठे के साथ अपने पेल्विक कर्डल पर माउस को मजबूती से पकड़ें और दूसरी तरफ तर्जनी और मिडिल फिंगर को एक अंगूठे और तर्जनी के साथ द्विपक्षीय पेल्विक कर्डल्स तना हुआ के बीच त्वचा रखते हुए। फिर द्विपक्षीय पेल्विक गर्डल्स के बीच फर को शेव करें और आयोडीन आधारित स्क्रब और 70% इथेनॉल के साथ उजागर त्वचा को निष्फल करें। एडेनो से जुड़े वायरस समाधान के सीधे इंट्राथेकल डिलीवरी के लिए, द्विपक्षीय पेल्विक गर्डल्स के बीच मिडलाइन के साथ इंटरवर्टेब्रल स्पेस को पलटें और एल 5 से एल 6 इंटरवर्टेब्रल स्पेस को इंगित करने के लिए त्वचा में इंडेंटेशन को दबाने के लिए नाखून का उपयोग करें।रीढ़ की मिडलाइन को प्रकट करने और जानवर के सिर की ओर सुई के बेवेल को समायोजित करने के लिए पूंछ के आधार को थोड़ा और धीरे-धीरे घुमाएं। माउस के साथ दृढ़ता से स्थिति में तय, रीढ़ की मध्य रेखा के साथ सुई संरेखित करें और सुई को धीरे-धीरे और खड़ी रूप से एक केंद्रीय धनु विमान में सिरिंज रखते हुए इंडेंटेशन के केंद्र में डालें। जब सुई हड्डी के संपर्क में आती है, तो धीरे-धीरे कोण को लगभग 30 डिग्री तक कम करें और सुई को इंटरवर्टेब्रल स्पेस में फिसल जाएं।अचानक पूंछ का झटका इंट्राड्यूरल स्पेस में सफल प्रवेश का संकेत है। जब सुई इंटरवर्टेब्रल स्पेस में प्रवेश करती है, तो टिप दृढ़ता से क्लैंप महसूस करेगी। वेक्टर समाधान इंजेक्ट करें, और एक मिनट के लिए इंट्राड्यूरल स्पेस के भीतर सुई बनाए रखें।फिर रिसाव को कम करने के लिए धीरे-धीरे सुई को रोटेशन के साथ वापस लें। इंजेक्शन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने और पक्षाघात से वसूली के लिए माउस को अपने पिंजरे में वापस करने के लिए माउस अंगों की क्षणिक कमजोरी को तुरंत स्कोर करें। उपयुक्त प्रायोगिक अंत बिंदु पर, फोम बॉक्स कवर पर प्रवण स्थिति में इंजेक्शन माउस के अंगों और सिर को ठीक करें और सिर से त्वचा को पट्टी करने और हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें।खोपड़ी को आंखों के बीच क्लिप करें, खोपड़ी के मिडलाइन के साथ काटें और सेरिबैलम के ऊपर क्षैतिज रेखा और खोपड़ी को प्रत्येक तरफ खोलें। ऑक्सीपिटल की हड्डी को हटाने के लिए चिमटी का प्रयोग करें और रीढ़ की हड्डी को द्विपक्षीय रूप से खोलने के लिए नेत्र कैंची का उपयोग करें। दोनों तरफ पसलियों को काटें और ध्यान से कशेरुकी के ऊपरी भाग को हटा दें।मस्तिष्क को उठाने और खोपड़ी के आधार की नसों को तोड़ने के लिए घुमावदार चिमटी का उपयोग करें। फिर ध्यान से पूरे मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी निकालने और 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊतकों को ठीक करें। निर्धारण अवधि के अंत में, क्रायोप्रोटेक्ट मस्तिष्क और गर्भाशय ग्रीवा और काठ की रीढ़ की हड्डी को 30% सुक्रोज समाधान में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर और तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीजिंग से पहले इष्टतम काटने के तापमान यौगिक में एम्बेडेड करके।फिर प्रत्येक ऊतक के 25 माइक्रोमीटर मोटी वर्गों को प्राप्त करने के लिए क्रायोस्टेट का उपयोग करें, 0.01 मोलर पीबीएस में जमे हुए वर्गों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें क्योंकि वे प्राप्त किए जाते हैं। ऊतकों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए, 10 मिनट के लिए 1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ मुफ्त फ्लोटिंग सेक्शन का प्रीट्रीट करें और इसके बाद पीबीएस में 10 मिनट का वॉश करें। अगला 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% सीरम और 0.3% गैर-आयनिक डिटर्जेंट वाले समाधान को अवरुद्ध करने में नमूनों को इनक्यूबेट करें और इसके बाद ब्याज की उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर लेबलिंग करें।अगले दिन, पीबीएस प्लस ट्वीन में 3 10 मिनट की धुलाई के साथ वर्गों को धोएं और अंतिम धोने के बाद 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर उपयुक्त संबंधित बायोटिनेलेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइड को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, ताजा पीबीएसटी में 3 बार वर्गों को धोएं क्योंकि बस का प्रदर्शन किया गया था और 40 मिनट के लिए इन्फिनिटी बायोटिन पेरोक्सिडास कॉम्प्लेक्स के साथ नमूनों को 20000 बद्ध किया गया था जिसके बाद एक उपयुक्त क्रोमोजेनिक एजेंट के साथ धुंधला हो जाता है। ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर लेबल किए गए सेक्शन को माउंट करें और एक बार घुड़सवार वर्गों के पूरी तरह से सूख जाने के बाद 5 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल में स्लाइड सोख लें।आगे की स्लाइड्स में जाइलीन को 10 मिनट के लिए भिगोकर उन्हें उपयुक्त बढ़ते मीडियम से सील करें। फिर 100, 200 और 400 गुना आवर्धन पर चार्ज युग्मित डिवाइस से लैस हल्के माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड्स की छवि। गर्भाशय ग्रीवा और काठ रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के ऊतकों के eGFP इम्यूनोस्टेटिंग 0 की कमजोरी स्कोर के साथ चूहों की काठ रीढ़ की हड्डी में कम या कोई लेनदेन से पता चलता है, 1 की कमजोरी स्कोर के साथ चूहों में थोड़ा बढ़ाया लेनदेन, और 4 या 5 की कमजोरी स्कोर के साथ चूहों में मजबूत और व्यापक संकुचन ।क्षणिक अंग कमजोरी की विभिन्न डिग्री प्रदर्शित चूहों से रीढ़ की हड्डी के ऊतकों वर्गों की जीएफपी धुंधला तीव्रता का मात्राकरण इंगित करता है कि वायरस समाधान इंजेक्शन के बाद कमजोरी की गंभीरता रीढ़ की हड्डी के संकुचन की सीमा के साथ निकटता से संबंधित है। मस्तिष्क में, घ्राण बल्ब, शयनागार प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, डेंटेट जाइरस, और हिप्पोकैम्पस के CA3 क्षेत्र, सेरिबेलर कॉर्टेक्स, और ब्रेनस्टेम के सीमांत क्षेत्रों में मजबूत ईजीएफपी संकेतों का पता लगाया जाता है, जिसमें चेहरे के न्यूक्लियस, कोरॉयड प्लेक्सस और एपेंडाइल एपिथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं। पूर्वकाल सींग में मोटर न्यूरॉन्स भी रीढ़ की हड्डी के विभिन्न स्तरों में दृढ़ता से स्थानांतरित कर रहे हैं।इसके अलावा, कॉर्टेक्स में, पिरामिड कोशिकाओं सहित जीएफपी सकारात्मक न्यूरॉन्स का पता लगाया जाता है और साथ ही माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स सहित विभिन्न ग्लियल सेल प्रकार भी पाए जाते हैं। यह तकनीक न्यूरोलॉजी क्षेत्र में शोधकर्ताओं को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों पर छोटे जाग जानवरों में प्रत्यक्ष इंट्राथेकल डिलीवरी के चिकित्सीय प्रभावों का पता लगाने में सक्षम बनाती है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

एडिनो - जुड़े वायरल vectors के intracranial इंजेक्शन

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

उपशोषक एडोनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वयस्क चूहे में वेक्टर डिलिवरी

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-संबद्ध वायरस-रीढ़ की हड्डी की आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन्स में मध्यस्थता Transgene अभिव्यक्ति

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

चूहों में Transcranial प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना (tDCS)

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Adeno-जुड़े वायरस आधारित वैक्टर के लिए उत्पादन, शुद्धिकरण, और गुणवत्ता नियंत्रण

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

सबराचनॉइड हेमरेज के मॉडल के रूप में सिस्टर्ना मैग्ना में रक्त का डबल डायरेक्ट इंजेक्शन

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

सेरेब्रल कॉर्टेक्स क्षेत्रों की इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक रिकॉर्डिंग चूहों में कोफिलिन को लक्षित करने वाले एडेनो-एसोसिएटेड वायरस का उपयोग करके हेरफेर किया गया

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

चूहों में इनट्रेसेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

जीनोम संपादन और दवा वितरण के लिए नवजात माउस का इंट्राथेकल इंजेक्शन

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...