Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione da HEBEI Provinciale Dipartimento delle risorse umane e della previdenza sociale (CY201605) e una sovvenzione dalla Fondazione di Hebei Provincia di scienze naturali (H2017206101), e siamo molto grati al Dr. per Guangping Gao, che hanno fornito l'AAV per Questo studio.

Topi FVB/NJ sono stati allevati nella struttura animali di laboratorio chiave di Hebei neurologia. Tutti gli esperimenti del mouse sono stati approvati dal secondo ospedale di Hebei Medical University comitato etico ed effettuati secondo le norme di gestione degli animali di laboratorio promulgata dal Ministero della scienza e della tecnologia della Repubblica popolare di Cina.
1. preparazione della soluzione di riserva di 20% lidocaina cloridrato
<ol><li>Pesano 2 g di cloridrato di lidocain...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Tecnicamente, ci sono diversi passaggi critici durante l'iniezione di IT in topi svegli. In primo luogo, adeguato controllo gesto e studio dei topi in tutta l'intera operazione è un prerequisito per il recapito corretto. In secondo luogo, il punto più difficile è sentimento lo spazio intervertebrale con la punta dell'ago, come è necessario non inserire troppo profondamente senza resistenza o inserire forzatamente sotto forte resistenza nel caso di ferire gli animali o piegare la punta dell'ago. In terzo luogo, anche ...

AAV possono mediare l'espressione genica a lungo termine e diffuso nella trasduzione del CNS con pochi effetti collaterali e quindi è diventato uno dei veicoli più promettenti per la terapia genica per il trattamento di malattie del SNC tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (ALS), Huntington malattia di s (HD), morbo di Alzheimer (annuncio), malattie da accumulo lisosomiale (LSD), malattia di Gaucher (GD) e Lipofuscinosi ceroido (NCL)1. Attualmente, più di 100 AAV sierotipi sono stati isolati dagli esseri umani e animali. Tra questi, almeno 12 sono stati utilizzati in studi preclinici e clinici, tra cui i più comunemente utilizzati vettori del gene come AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Diverse malattie del SNC richiedono diverse strategie di consegna AAV a causa delle varie regioni colpite CNS e tipi di cellule. Le regioni dello SNC e la cella tipi che possono trasdurre AAV varia a seconda del sierotipo così come il metodo di consegna. Ad esempio, rAAVrh10 è stato indicato di trasdurre principalmente astrociti quando consegnato da iniezione sistemica per via endovenosa (IV), considerando che esso trasdotte sia i neuroni e cellule gliali quando consegnato dall'iniezione intratecale4,7. Inoltre, parenchima iniezione ha provocato nella trasduzione del locale alla vicinanza del sito di iniezione, mentre iniezione nel fluido cerebrospinale (CSF) attraverso intraventricolare o iniezione intratecale ha provocato diffuso trasduzione del CNS8 . Gli studi hanno anche dimostrato potenza terapeutica della terapia genica AAV-consegnato nei disordini neurodegenerative da esso amministrazione9,10,11. In malattie che colpiscono vaste aree del SNC quali ALS, iniezione intratecale nel CSF è stato indicato per coprire la maggior parte delle aree che sono afflitti dalla malattia con una dose più bassa, rispetto a un metodo di consegna sistemica4,10. Recenti studi hanno inoltre dimostrato che la puntura lombare può essere usata per iniettare AAV in modelli murini per la SLA, che evita potenziali infortuni connessi con laminectomy e intrathecal cateterizzazione4.
Puntura lombare diretta sperimentale fu usata per trasportare gli agenti, soprattutto anestetici, al midollo spinale per analgesia e anestesia in 188512,13. In questo rapporto, illustriamo la puntura lombare metodo di iniezione di IT in topi adulti con l'ausilio di cloridrato di 1% della lidocaina, un anestetico locale di ammide derivata, della soluzione di iniezione per valutare e monitorare la qualità di iniezione. Iniezioni di successo furono segnate da paralisi transitoria indotta da lidocaina, mentre le iniezioni non riuscite non hanno mostrato questo comportamento. Abbiamo classificato il livello di debolezza transitoria come uno dei cinque gradi per contribuire a predire l'efficacia dell'iniezione. Infine, indichiamo che il livello di trasduzione rAAVrh10 può essere previsto per il grado di paralisi. Pertanto, questo metodo di consegna intrathecal AAV può essere utilizzato per migliorare la consegna del gene AAV-mediata per la terapia sperimentale delle malattie del SNC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Iniezione intratecale (IT) di virus adeno-associato (AAV) ha attirato notevole interesse nella terapia genica CNS in virtù della sua sicurezza, invasività ed eccellente trasduzione efficacia nello SNC. Precedenti studi hanno dimostrato la potenza terapeutica della terapia genica AAV-consegnato nei disordini neurodegenerative da essa amministrazione. Tuttavia, sono stati segnalati alti tassi di guasto imprevedibile a causa dei limiti tecnici di amministrazione IT nei piccoli animali. Qui, abbiamo stabilito un sistema di scoring per indicare la misura del successo della puntura lombare in piccoli animali con l'aggiunta di 1% lidocaina cloridrato nella soluzione di iniezione. Più ulteriormente indichiamo che l'estensione della debolezza transitoria dopo l'iniezione può prevedere l'efficienza di trasduzione di AAV. Così, questo metodo di iniezione IT può essere utilizzato per ottimizzare le prove terapeutiche in modelli murini di malattie del SNC che affliggono vaste regioni del SNC.

Topi hanno mostrato diversi gradi di debolezza transitoria subito dopo l'iniezione di soluzione AAV in 1% lidocaina cloridrato a causa di varie qualità di iniezione intratecale. Secondo il sistema Punteggio semi-quantitativa di 5-grado abbiamo stabilito, abbiamo testato i modelli di trasduzione di AAV in topi con diversi gradi di debolezza agli arti indotta da lidocaina (Punteggio 0, n = 2; Punteggio 1, n = 1; Punteggio 4, n = 4; Punteggio 5, n = 3). EGFP immunostaining dei midolli spina...

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Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Qui presentiamo una tecnica di iniezione intratecale diretto utilizzo 1% lidocaina cloridrato in una soluzione virale per garantire una consegna efficiente virus adeno-associato ai piccoli animali e stabilire un sistema di scoring per predire l'efficienza di trasduzione in zona centrale sistema nervoso secondo il grado della debolezza transitoria indotta da lidocaina.

Diretto iniezione intratecale di ricombinanti Virus Adeno-associato in topi adulti

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Questo metodo facilita l'efficiente somministrazione intratecale di transgeni virali adeno-associati in piccoli animali svegli per il trattamento sperimentale di malattie del sistema nervoso centrale come la SLA. Il principale vantaggio di questo metodo è che la soluzione virale include l'1%di cloridrato di lidocaina che induce una paralisi transitoria dopo un'iniezione riuscita. Sebbene questo metodo fornisca un indicatore visivo per giudicare il successo della situazione automatizzata intrateca, è essenziale una pratica sufficiente per migliorare il tasso di successo della consegna.Prima di iniziare la procedura, attaccare un ago calibro 27 a una siringa Hamilton da 25 microliter e allineare la punta smussata dell'ago con la scala volumetrica sulla siringa. Quindi caricare con cura 8 microlitri da 4 x 10 al 10 ° genoma copie della soluzione virale nella siringa, facendo attenzione ad evitare bolle. Quindi, posizionare un topo sveglio di 30-70 giorni da 12 a 30 grammi su un pezzo del letto in posizione incline in un cappuccio di biosicurezza e coprire la parte superiore del corpo con garza sterile per calmare il mouse ed evitare di essere morso.Afferra saldamente il mouse sulla cintura pelvica con il pollice su un lato e l'indice e il dito medio dall'altro lato mantenendo la pelle tra le cinghie pelviche bilaterali tate con un pollice e un indice. Quindi radere la pelliccia tra le cinghie pelviche bilaterali e sterilizzare la pelle esposta con uno scrub a base di iodio e 70% di etanolo. Per la consegna intratecale diretta della soluzione virale adeno-associata, palpare lo spazio intervertebrale lungo la linea mediana tra le cinghie pelviche bilaterali e utilizzare un'unghia per deprimere un'indentazione nella pelle per indicare lo spazio intervertebrale da L5 a L6.Ruotare leggermente e delicatamente la base della coda per rivelare la linea mediana della colonna vertebrale e regolare la smussatura dell'ago verso la testa dell'animale. Con il mouse fissato saldamente in posizione, allineare l'ago lungo la linea mediana della colonna vertebrale e inserire l'ago delicatamente e verticalmente al centro dell'indentazione mantenendo la siringa in un piano sagittale centrale. Quando l'ago entra in contatto con l'osso, diminuire lentamente l'angolo a circa 30 gradi e infilare l'ago nello spazio intervertebrale.Un colpo di coda improvviso è il segno di un ingresso riuscito nello spazio intradurale. Quando l'ago entra nello spazio intervertebrale, la punta si sentirà saldamente bloccata. Iniettare la soluzione vettoriale e mantenere l'ago all'interno dello spazio intradurale per un minuto.Quindi ritirare lentamente l'ago con rotazione per ridurre al minimo le perdite. Segna immediatamente la debolezza transitoria degli arti del topo per valutare la qualità dell'iniezione e riportare il topo nella sua gabbia per il recupero dalla paralisi. All'endpoint sperimentale appropriato, fissare gli arti e la testa del topo iniettato nella posizione prona su un coperchio della scatola di schiuma e utilizzare le forbici per spogliare e rimuovere la pelle dalla testa all'osso sacro.Ritagliare il cranio tra gli occhi, tagliare lungo la linea mediana del cranio e la linea orizzontale sopra il cervelletto e aprire il cranio su ciascun lato. Utilizzare una pinzetta per rimuovere l'osso occipitale e utilizzare forbici oftalmiche per aprire il canale spinale bilateralmente. Tagliare le costole su entrambi i lati e rimuovere con cura la sezione superiore delle vertebre.Usa una pinzetta curva per sollevare il cervello e erta i nervi della base del cranio. Quindi estrarre accuratamente l'intero cervello e il midollo spinale e fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Alla fine del periodo di fissazione, crioproteggere il cervello e il midollo spinale cervicale e lombare in soluzione di saccarosio al 30% durante la notte a 4 gradi Celsius seguita dall'incorporamento in un composto ottimale della temperatura di taglio prima di scattare il congelamento nell'azoto liquido.Quindi utilizzare un criostato per ottenere sezioni spesse 25 micrometri di ciascun tessuto, immagazzinando le sezioni congelate in PBS molare 0,01 a 4 gradi Celsius man mano che vengono ottenute. Per l'analisi immunoistochimica dei tessuti, pretrattare le sezioni galleggianti libere con perossido di idrogeno dell'1% per 10 minuti seguito da un lavaggio di 10 minuti in PBS. Successivamente incubare i campioni in soluzione di blocco contenente il 5% di siero e lo 0,3% di detergente non ionico in PBS per 1 ora seguito da un'etichettatura notturna a 4 gradi Celsius con gli anticorpi primari appropriati di interesse.Il giorno successivo, lavare le sezioni con lavaggi di 3 10 minuti in PBS più Tween e incubare i vetrini con gli anticorpi secondari biotinilati appropriati corrispondenti a temperatura ambiente per 1 ora dopo l'ultimo lavaggio. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni 3 volte in PBST fresco come appena dimostrato e incubare i campioni con complesso di perossidasi di biotina a sfioro per 40 minuti seguito da colorazione con un agente cromogenico appropriato. Montare le sezioni etichettate su vetrini al microscopio e immergere gli scivoli in etanolo anidro per 5 minuti una volta che le sezioni montate si sono completamente asciugate.Successivamente immergere gli scivoli in xilene per 10 minuti e sigillarli con un mezzo di montaggio appropriato. Quindi immagini le diapositive con un microscopio a luce dotato di un dispositivo accoppiato a carica a 100, 200 e 400 volte gli ingrandimenti. L'immunostaining eGFP delle sezioni del tessuto del midollo spinale cervicale e lombare rivela una trasduzione scarsa o nessuna nel midollo spinale lombare dei topi con un punteggio di debolezza di 0, una trasduzione leggermente migliorata nei topi con un punteggio di debolezza di 1 e trasduzioni forti e diffuse nei topi con un punteggio di debolezza di 4 o 5.La quantificazione dell'intensità di colorazione GFP delle sezioni del tessuto del midollo spinale da topi che mostrano vari gradi di debolezza degli arti transitori indica che la gravità della debolezza dopo l'iniezione della soluzione virale è strettamente correlata con l'estensione della trasduzione del midollo spinale. Nel cervello, vengono rilevati robusti segnali eGFP nel bulbo olfattivo, nella corteccia prefrontale dorsolaterale, nel giro dentato e nella zona CA3 dell'ippocampo, nella corteccia cerebellare e nelle aree marginali del tronco encefalico, tra cui il nucleo facciale, il plesso coroideo e le cellule epiteliali ependimali. I motoneuroni nelle corna anteriori sono anche fortemente trasdotti in diversi livelli del midollo spinale.Inoltre, nella corteccia, vengono rilevati neuroni positivi alla GFP tra cui cellule piramidali e vari tipi di cellule gliali tra cui microglia, astrociti e oligodendrociti. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della neurologia di esplorare gli effetti terapeutici del parto intratecale diretto in piccoli animali svegli sulle malattie del sistema nervoso centrale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Ricerca

Neuroscienze

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

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Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

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Stimolazione transcranica corrente continua (tDCS) in topi

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Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Iniezione intracerebroventricolare nei topi

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

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