Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
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この作品は、河北省の人材開発省と社会保障 (CY201605) からの助成金と河北省 (H2017206101) の自然科学財団からの助成金によって賄われていたし、広平 Gao の AAV をいただいた先生にはとても感謝しております本研究では。

FVB/ニュージャージー州マウス キー河北内科研究室の動物施設で飼育されました。すべてのマウスの実験によって第 2 病院の河北医科大学倫理委員会の承認され、科学省と中華人民共和国の技術によって公布された実験動物管理の規制に従って実施中国。
1. 20% リドカイン塩酸原液の調製
<ol><li>リドカイン塩酸塩の 2 グラムの重量を量る。5-6 mL の滅菌水の渦をそっと追?...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

技術的には、目を覚ましマウスにおける IT 注入中にいくつかの重要な手順があります。まず、適切な操作全体を通じてマウスのジェスチャーと事務所のコントロールが正しく配信されるための前提条件。第二に、最も困難な点はない抵抗せずにあまりにも深く挿入または動物が負傷または針の先端を曲げの場合強い抵抗の下で強制的に挿入する必要がある、針の先端と椎間腔を感じです。第...

AAV はいくつかの副作用と中枢神経系の情報伝達における長期的かつ広範な遺伝子発現を仲介することができます、したがって筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、ハンチントンを含む中枢神経系疾患を治療する遺伝子治療のための最も有望な車の 1 つになりました病気 (HD)、アルツハイマー病 (AD)、ライソゾーム病 (LSD)、ゴーシェ病 (GD)、神経セロイドリポフスチン症 (NCL)1。現在、100 以上の AAV の血清型は人間や動物から分離されています。これらのうち、少なくとも 12 は、臨床で使用されている、最もよくを含む臨床試験使用遺伝子ベクターなど AAV1、2、4、5、6、8、9、rAAVrh.8、および rAAVrh.101,2,3,4、 5,6。
中枢神経系のさまざまな病気は、様々 な中枢神経系の影響を受ける地域や細胞の種類により異なる AAV 配信戦略を必要とします。中枢神経系領域およびセル AAV が変換できる型は血清型によって異なります配信方法だけでなく。たとえば、rAAVrh10 は、ニューロンとグリア細胞髄腔内注入4,7で配信されたときそれが導入に対し、主に全身の静脈内投与 (IV)、配信時はアストロ サイトを変換する示されています。実質内注入は、注射部位の近くにローカル伝達の結果さらに、広範な中枢神経系伝達8 結果として脳から脳脊髄液 (CSF) 注入またはくも膜下腔内注射に対し.研究も示している神経変性疾患における AAV 配信遺伝子療法の治療上の効力によって管理9,10,11。ALS など中枢神経系の広範な領域に影響する疾患、全身配信メソッド4,10と比較して、低い線量と病気に悩まされ、ほとんどの区域をカバーする CSF への髄腔内注入を示されています。最近の研究では、その腰椎穿刺は、ALS は、椎弓切除術、髄腔内カテーテル4に関連付けられている潜在的な傷害を避けるためのマウスモデルの AAV を注入する使用ことができますが示されています。
実験直接腰椎穿刺は、配信エージェント、特に麻酔薬、鎮痛および 188512,13の麻酔で、脊髄に初めて使われました。本報告では、腰椎穿刺、評価してインジェクションの品質を監視する注入剤でアミド由来のローカルの麻酔 1% リドカイン塩酸塩の助けを借りて成体マウスの IT 注入法を示しています。成功した注射は、失敗した注射がこの現象を示さなかったに対しリドカインによる一時的なまひ状態によって示されました。注入効率を予測する 5 つの等級の 1 つとして一時的な弱さのレベルを分類しました。最後に、麻痺の等級によって rAAVrh10 伝達レベルを予測できることを示す.したがって、このくも膜下腔の AAV の配信方法は、中枢神経系疾患の治療実験 AAV を介した遺伝子導入を強化する使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

アデノ随伴ウイルス (AAV) の髄腔内 (IT) 注入は、中枢神経系中枢神経系遺伝子治療の安全、非侵襲性、優れた伝達効果のおかげでかなりの関心を集めています。前の調査は管理で、それによって神経変性疾患における AAV 配信遺伝子療法の治療の有効性を実証しています。ただし、高率で小動物の IT 管理の技術的な制限により予期しない失敗が報告されています。ここでは、我々 は注射液に 1% リドカイン塩酸塩を加えることによって小動物での腰椎穿刺の成功の程度を示す得点システムを確立しました。さらに注入過渡の弱さの程度が AAV の伝達効率を予測できることを示します。したがって、この IT 注入法は、中枢神経系の幅広い領域を苦しめる中枢神経系疾患のマウスモデルでの治療試験を最適化するために使用できます。

マウスは 1% リドカイン塩酸塩を投与するとの様々 な質のためにそれの直後に一時的な弱さの程度が異なるの AAV 溶液注入示した。半定量の 5 段階採点システムを設けて、に従って私達はリドカイン誘導肢の弱さの程度が異なるとマウスの AAV の伝達パターンをテスト (スコア 0、n = 2; スコア 1、n = 1; スコア 4、n = 4; スコア 5、n = 3)。脊髄の EGFP 免疫マウスの no か少し?...

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Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

小動物に効率的なアデノ随伴ウイルス配信しているし、中央に伝達効率を予測するスコアリング システムを確立するウイルス ソリューションで 1% リドカイン塩酸塩を使用して直接髄腔内注入法を紹介します。リドカインによる一時的な弱さの程度によると神経系。

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

この方法は、ALSなどの中枢神経系疾患の実験的処置のために、覚醒小動物におけるアデノ関連ウイルストランス遺伝子の効率的なアデノ関連ウイルストランス遺伝子の効率的な内腔送達を促進する。この方法の主な利点は、ウイルス溶液が正常に注射した後に一過性麻痺を誘発する1%リドカイン塩酸塩を含むということです。この方法は、自動状態の結果を判断するための視覚的な指標を提供するが、配信の成功率を向上させるためには十分な練習が不可欠である。手順を開始する前に、27マイクロリットルのハミルトン注射器に27ゲージの針を取り付け、針のベベリング先端をシリンジの容積スケールに合わせます。その後、慎重に気泡を避けるために注意して、注射器にウイルス溶液の10番目のゲノムコピーに4 x 10の8マイクロリットルをロードします。次に、バイオセーフティフードの起こりやすい位置にあるベッドピースの上に30〜70日齢の12〜30グラムのマウスを置き、上半身を無菌ガーゼで覆い、マウスを落ち着かせ、噛まれないようにします。片方の側に親指を置き、反対側の人差し指と中指で骨盤ガードルの上にマウスをしっかりと握り、両側の骨盤ガードルの間の皮膚を親指と人差し指で張ります。その後、両側骨盤ガードル間の毛皮を剃り、ヨウ素ベースのスクラブと70%エタノールで露出した皮膚を殺菌する。アデノ関連ウイルス溶液の直接の内腔内送達のために、両側骨盤ガードル間の正中線に沿って椎間空間を触診し、指の爪を使用して皮膚へのインデントを抑制し、L5〜L6椎間腔を示す。尾の基部を少し軽く回転させて背骨の正中線を明らかにし、針のベベルを動物の頭に向かって調整します。マウスをしっかりと固定して、脊椎の正中線に針を合わせ、注射器を中央の矢状平面に保つインデントの中央に針を静かに垂直に挿入します。針が骨に接触したら、ゆっくりと角度を約30度に下げ、針を椎間腔に滑り込まします。突然の尾のフリックは、硬膜内空間への正常な入り口の兆候です。針が椎間スペースに入ると、先端はしっかりと締め付けられた感じになります。ベクター溶液を注入し、1分間硬膜内空間内で針を維持する。その後、ゆっくりと漏れを最小限に抑えるために回転で針を引き出します。マウスの手足の一過性の弱さをすぐにスコアリングして注射の品質を評価し、マウスをそのケージに戻して麻痺から回復します。適切な実験エンドポイントで、注入されたマウスの手足と頭部をフォームボックスカバーの起こりやすい位置に固定し、はさみを使用して頭から仙点に皮膚を剥ぎ取って取り除きます。目の間に頭蓋骨をクリップし、頭蓋骨の正中線と小脳の上の水平線に沿って切り取り、両側の頭蓋骨を開きます。後頭部骨を取り除き、眼科用はさみを使用して脊柱管を両側で開きます。両側のリブを切り、椎骨の上部を慎重に取り除きます。湾曲したピンセットを使用して脳を持ち上げ、頭蓋骨の基部の神経を切断します。その後、慎重に脳と脊髄全体を抽出し、24時間4%パラホルムアルデヒドで組織を修正します。固定期間の終わりに、脳と子宮頸部および腰椎脊髄を摂氏4度で一晩30%スクロース溶液で凍結保護し、続いて液体窒素中で凍結する前に最適な切断温度化合物に埋め込む。次に、クライオスタットを使用して各組織の厚さ25マイクロメートルの部分を得て、得られるように0.01モルPBSで凍結したセクションを摂氏4度で保存する。組織の免疫組織化学的分析のために、1%過酸化水素で遊離浮遊部を10分間退出し、続いてPBSで10分間洗浄する。次に、PBSに5%血清および0.3%非イオン性洗剤を含むブロッキング溶液中のサンプルを1時間インキュベートし、その後、適切な一次抗体を有する摂氏4度で一晩標識する。翌日、PBSとTweenで3 10分の洗浄でセクションを洗浄し、最後の洗浄後1時間室温で適切な対応するビオチン化二次抗体でスライドをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように新鮮なPBSTで3回セクションを洗浄し、40分間インフィニティビオチンペルオキシダーゼ複合体でサンプルをインキュベートし、適切な発色剤で染色します。ラベル付き切片をガラス顕微鏡スライドに取り付け、取り付けられた切片が完全に乾燥したら、スライドを無水エタノールに5分間浸します。次に、スライドをキシレンに10分間浸し、適切な取り付け媒体で密封します。その後、100、200、400倍の倍率で電荷結合装置を装備した軽い顕微鏡でスライドをイメージします。子宮頸部および腰椎脊髄組織切片のeGFP免疫染色は、弱点スコア0のマウスの腰椎脊髄への伝達をほとんどまたは全く明らかにし、弱点スコア1のマウスではわずかに増強された伝達、および弱点スコア4または5のマウスで強く広範な伝達を明らかにする。種々の一時的な肢の弱さを示すマウスからの脊髄組織切片のGFP染色強度の定量化は、ウイルス溶液注射後の弱点の重症度が脊髄伝達の程度と密接に相関することを示している。脳では、嗅球、側側前頭前野、デンテート回、海馬、小脳皮質、脳幹の限界領域(顔面核、脈絡膜叢、および頭蓋上皮細胞を含む)のCA3ゾーンで、堅牢なeGFP信号が検出される。前角の運動ニューロンも脊髄の異なるレベルで強く伝達される。また、皮質では、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含む様々なグリア細胞タイプと同様に、錐体細胞を含むGFP陽性ニューロンが検出される。この技術により、神経学分野の研究者は、中枢神経系疾患に対する小さな覚醒動物の直接眼内送達の治療効果を探究することができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

マウスにおける経頭蓋直流電流刺激 (tDCS)

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

くも膜下出血のモデルとしての水槽マグナへの血液の二重直接注射

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

マウスにおけるコフィリンを標的とするアデノ関連ウイルスを用いて操作した大脳皮質領域の電気コルチコチコ

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

マウスにおける脳室内注射

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...