Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

이 작품 허베이 지방 부의 인적 자원 및 사회 보장 (CY201605)에서 부여와 자연 과학 재단의 허베이 성 (H2017206101)에서 교부 금에 의해 투자 되었다 그리고 우리는 Guangping가 오, AAV에 대 한 제공에 대 한 박사에 게 매우 감사 이 연구는.

FVB/뉴저지 쥐 허베이 신경과 키 실험실의 동물 시설에서 자란 했다. 모든 마우스 실험에 의해 두 번째 병원의 허베이 의료 대학 윤리 위원회 승인 되었고 실험실 동물 관리 과학과의 인민 공화국의 기술에 의해의 규정에 따라 실시 중국입니다.
1. 20 %Lidocaine 염 산 염 재고 솔루션의 준비
<ol><li>Lidocaine 염 산 염의 2 세대의 무게. 부드럽게 살 균 물과 소용돌이의 5-6 mL를 추가 합?...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

기술적으로, 깨어 있는 쥐의 IT 주입 하는 동안 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 적절 한 제스처 및 회사 전체 작업을 통해 쥐의 관리는 배달 하기 위해 필수. 둘째, 그것은 저항 없이 너무 깊게 삽입 하거나 동물 부상 또는 절곡 바늘 팁의 경우 강력한 저항에서 강제로 삽입 하지 필요한 가장 어려운 포인트 바늘 팁과 척추 공간을 느낌입니다. 셋째, lidocaine 인해 일시적인 마비 제공 하지만 객관?...

AAV 몇 가지 부작용, CNS 변환에 장기적이 고 광범위 한 유전자 발현을 중재할 수 및 따라서 루 경화 증 (ALS), 헌팅턴의를 포함 하 여 CNS 질병을 치료 하는 유전자 치료에 대 한 가장 유망한 차량 중 하나 되고있다 (HD) 질병, Alzheimer의 질병 (광고), lysosomal 저장 질병 (LSD), Gaucher 질환 (GD), 그리고 신경 ceroid lipofuscinosis (NCL)1 현재, 이상의 100 AAV serotypes 인간과 동물에서 분리 되었습니다. 이러한 가운데, 적어도 12 전 임상에서 사용 되 고 AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 같은 유전자 벡터를 사용 하는 가장 일반적으로 포함 하는 임상 시험, rAAVrh.8, 및 rAAVrh.10,12,3,4, 5,6.
다른 CNS 질병 때문에 다양 한 영향을 받는 CNS 영역 및 세포 유형 다른 AAV 배달 전략 필요합니다. CNS 영역 및 셀 AAV transduce 수 종류는 serotype에 따라 전달 방법 뿐만 아니라. 예를 들어 rAAVrh10 transduce 주로 조직의 정 맥 주사 (IV)에 의해 전달 하는 때 이다 그것은 신경 및 명과 intrathecal 주입4,7에 의해 전달 될 때 불리고 반면에 표시 되었습니다. 또한, 실질 주입 결과 사출 사이트의 부근을 로컬 변환 반면 intraventricular 통해 뇌 척추 액체 (CSF)에 주입 또는 intrathecal 주입 결과 광범위 한 CNS 변환8 . 연구는 또한 신경 장애에서 AAV 전달 유전자 치료의 치료 힘에 의해 증명 그것 관리9,,1011. ALS 같은 CNS의 넓은 영역에 영향을 주는 질병에 CSF에 intrathecal 주입 체계 배달 방법4,10에 비해 낮은 복용량으로 질병에 의해 시달리는 대부분 영역을 커버 하 표시 되었습니다. 최근 연구는 또한 ALS laminectomy 및 intrathecal catheterization4와 관련 된 잠재적인 부상 방지에 대 한 마우스 모델에서 AAV를 주입 하는 허리 빵 꾸를 사용할 수 있습니다 나타났습니다.
실험적인 직접 요 추 찔린 에이전트, 특히 마 취약, 진통 및 188512,13마 취 척수에 전달 하 처음 사용 되었다. 이 보고서에서 우리 허리 빵 꾸 1 %lidocaine 염 산 염는 지역 아 미드 파생 취 평가 하 고 사출 품질 모니터링 주입 솔루션에서의 도움으로 성인 쥐에 주입 방법으로 그것을 설명 합니다. 반면 실패 한 주사는이 동작을 보여주지 않았다 성공적인 주사 일시적인 마비 lidocaine 유도 의해 표를 했다. 우리는 주입 효율을 예측할 수 있도록 다섯 등급 중 하나로 과도 약점의 수준을 분류. 마지막으로, 우리는 rAAVrh10 변환 수준 마비의 급료에 의해 예측 될 수 있습니다 보여줍니다. 따라서,이 intrathecal AAV 전달 방법 AAV 중재 CNS 질환의 실험적 치료를 위한 유전자 납품을 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Adeno 관련 바이러스 (AAV)의 Intrathecal (IT) 주사는 CNS에 CNS 유전자 치료의 안전, noninvasiveness, 그리고 우수한 전달 효능 덕에 상당한 관심을 받고 있다. 이전 연구는 관리 그것에 의해 신경 장애에서 AAV 전달 유전자 치료의 치료 효능 입증. 그러나, 작은 동물에서 IT 관리의 기술적 제한으로 인해 예측할 수 없는 실패의 높은 속도 보고 되었습니다. 여기, 우리는 주입 솔루션으로 1 %lidocaine 염 산을 추가 하 여 작은 동물에 허리 빵 꾸의 성공 정도 나타내는 점수 시스템 설립. 우리는 추가 주입 다음 과도 함의 정도 AAV의 변환 효율을 예측할 수 있습니다 보여줍니다. 따라서,이 IT 주입 방법 CNS의 넓은 영역을 괴롭히다 CNS 질병 마우스 모델에서 치료 실험을 최적화 하기 위해 사용할 수 있습니다.

마우스 과도 약점의 다른도 바로 뒤 AAV 솔루션의 주사로 intrathecal 주입의 다양 한 품질 1 %lidocaine 염 산 염 보였다. 시스템에 따라 반 양적 5 학년 점수 우리는 설립, 우리 AAV의 변환 패턴에에서 테스트 쥐 lidocaine 유도 사지 약점의 다른도로 (점수 0, n = 2; 1, n 점수 = 1; 4, n 점수 = 4; 점수 5, n = 3). 척수의 EGFP immunostaining 보였다 중 "없음" 또는 "작은 0를 득점 하는 쥐의 요 추 척수?...

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Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

이 방법은 ALS와 같은 중추 신경계 질환의 실험 적 치료를 위해 작은 동물을 깨우는 아데노 관련 바이러스 성 바이러스 성 트랜스게놈의 효율적인 장내 전달을 용이하게한다. 이 방법의 주요 장점은 바이러스 용액이 성공적인 주입 후 일시적인 마비를 유도하는 1 % 리도카인 염산염을 포함한다는 것입니다. 이 방법은 인트라더칼 자동화 상황의 성공을 판단하기위한 시각적 지표를 제공하지만, 전달의 성공률을 개선하기위한 충분한 연습이 필요합니다.시술을 시작하기 전에 27 게이지 바늘을 25 마이크로리터 해밀턴 주사기에 부착하고 바늘의 경부 팁을 주사기의 체적 스케일과 정렬합니다. 그런 다음 조심스럽게 거품을 피하기 위해 주의, 주사기에 바이러스 용액의 10 게놈 사본에 4 x 10의 8 마이크로 리터를로드합니다. 다음으로, 12~30일 생후 12~30그램의 마우스를 침대 조각에 생리용 후드에 배치하고 상체를 멸균 거즈로 덮어 마우스를 진정시키고 물린 것을 피한다.한쪽에 엄지 손가락으로 골반 거들 위에 마우스를 단단히 잡고 다른 쪽의 집게 손가락과 중간 손가락은 엄지 손가락과 집게 손가락으로 팽팽한 양골 골반 거들 사이의 피부를 유지합니다. 그런 다음 양측 골반 거들 사이에 털을 면도하고 요오드 기반 스크럽과 70 %의 에탄올로 노출된 피부를 살균하십시오. 아데노 관련 바이러스 용액의 직접 내트라테칼 전달을 위해, 양측 골반 거들 사이의 중간선을 따라 무척추 동물 공간을 만지고 손톱을 사용하여 피부내들여 들여쓰기를 우울하게 하여 L5 ~ L6 추간판을 나타냅니다.꼬리의 베이스를 약간 부드럽게 회전하여 척추의 중간선을 드러내고 바늘의 벨을 동물의 머리쪽으로 조정합니다. 마우스가 제자리에 단단히 고정되어 있는 가운데, 척추의 중간선을 따라 바늘을 정렬하고 바늘을 들여쓰기의 중앙에 부드럽게 수직으로 삽입하여 주사기를 중앙 각선 평면에 보관합니다. 바늘이 뼈와 접촉하면 각도를 약 30도로 천천히 줄이고 바늘을 추간판으로 미끄러지게 합니다.갑작스런 꼬리 영화는 막막 공간에 성공적으로 진입하는 신호입니다. 바늘이 추간판에 들어가면 팁이 단단히 고정된 느낌이 듭니다. 벡터 용액을 주입하고, 1분 동안 막장 공간 내에서 바늘을 유지한다.그런 다음 누출을 최소화하기 위해 회전으로 바늘을 천천히 철회합니다. 즉시 주사 품질을 평가하고 마비에서 회복을 위해 케이지에 마우스를 반환 마우스 사지의 일시적인 약점을 점수. 적절한 실험적 엔드포인트에서 주입된 마우스의 팔다리와 머리를 폼 박스 커버의 경향이 있는 위치에 고정하고 가위를 사용하여 머리에서 사골까지 피부를 제거하고 제거합니다.눈 사이에 두개골을 잘라 두개골의 중간선과 소뇌 위의 수평 선을 따라 잘라 양쪽에 두개골을 엽니 다. 핀셋을 사용하여 후두 뼈를 제거하고 안과 가위를 사용하여 양간 척추 운하를 엽니다. 양쪽에 갈비뼈를 자르고 척추의 상부 부분을 조심스럽게 제거합니다.구부러진 핀셋을 사용하여 뇌를 들어 올리고 두개골 베이스의 신경을 끊습니다. 그런 다음 뇌와 척수 전체를 조심스럽게 추출하고 24 시간 동안 4 %의 파라 포름 알데히드에서 조직을 수정합니다. 고정 기간이 끝나면 냉동고는 뇌와 자궁 경부 및 요추 척수를 섭씨 4도에서 밤새 30 % 자당 용액으로 보호하고 액체 질소에서 동결하기 전에 최적의 절삭 온도 화합물에 포함시합니다.그런 다음 저온을 사용하여 각 조직의 25 마이크로미터 두께의 섹션을 얻고 냉동 섹션을 섭씨 4도에서 0.01 mm PBS로 저장합니다. 조직의 면역 조직 화학 적 분석을 위해, 10 분 동안 1 %의 과산화수소와 무료 부동 섹션을 퇴각한 다음 PBS에서 10 분 세척하십시오. 다음으로 PBS에서 5%의 혈청과 0.3%의 비이온 세제를 함유한 블로킹 용액에 샘플을 증식한 다음, 적절한 1차 항체를 사용한 섭씨 4도에서 하룻밤 라벨을 부착한다.다음 날, PBS 플러스 트위엔에서 3 10 분 세척으로 섹션을 세척하고 마지막 세척 후 1 시간 동안 실온에서 적절한 바이오티니드 이차 항체로 슬라이드를 배양한다. 인큐베이션이 끝나면, 방금 시연된 대로 신선한 PBST에서 섹션을 3번 세척하고 40분 동안 무한대 비오틴 peroxidase 복합체로 샘플을 배양한 다음 적절한 염색제로 염색합니다. 표지된 부분을 유리 현미경 슬라이드에 장착하고 장착 된 섹션이 완전히 건조되면 5 분 동안 무수 에탄올에 슬라이드를 담그십시오.다음으로 슬라이드를 자일렌에 10분 간 담그고 적절한 장착 매체로 밀봉합니다. 그런 다음 100, 200 및 400 배율의 충전 결합 장치가 장착 된 가벼운 현미경으로 슬라이드를 이미지합니다. 자궁 경부 및 요추 척수 조직 섹션의 eGFP 면역 염색은 약점 점수 0, 약점 점수 1의 마우스에 약간 향상된 트랜스덕션을 가진 마우스의 요추 척수에서 거의 또는 전혀 트랜스포팅을 제시하고, 약점 점수가 4 또는 5인 마우스에서 강하고 광범위한 트랜스덕션을 나타낸다.다양한 정도의 과도 사지 약화를 나타내는 마우스로부터 척수 조직 단면의 GFP 염색 강도의 정량화는 바이러스 용액 주입 후 약점의 심각성이 척수 전도의 정도와 밀접한 상관관계를 나타낸다. 뇌에서, 강력한 eGFP 신호는 후각 전구, 등쪽 전두엽 피질, 전염기류 및 해마의 CA3 영역, 소뇌 피질 및 뇌줄기의 한계 영역에서 검출되며, 얼굴 핵, 코로이드 신경전증 및 에펜디말 상피 세포를 포함한다. 전방 혼의 운동 뉴런은 또한 척수의 다른 수준에서 강하게 전해됩니다.더욱이, 피질에서, 피라미드 세포를 포함하는 GFP 양성 뉴런은 마이크로글리아, 성상세포 및 올리고덴드로시드를 포함하는 각종 신경교 세포 모형뿐만 아니라 검출됩니다. 이 기술은 신경학 필드에 있는 연구원이 중추 신경계 질병에 작은 깨어 있는 동물에 있는 직접적인 장내 납품의 치료 효력을 탐구하는 가능하게 합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

연구

신경과학

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcranial 직류 자극 (tDCS) 마우스

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

수브라크누드 출혈의 모델로 시스테나 마그나에 혈액을 이중 직접 주입

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

쥐에서 코필린을 표적으로 하는 아데노 관련 바이러스를 사용하여 조작된 대뇌 피질 지역의 전기 코르티코그래피 기록

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

생쥐의 뇌내 주사

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

게놈 편집 및 약물 전달을 위한 신생아 마우스의 척수강내 주사

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...