Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra HEBEI provinsielle avdeling av menneskelige ressurser og Social Security (CY201605) og et stipend fra Natural Science Foundation i Hebei provinsen (H2017206101), og vi er veldig takknemlig til Dr. for Guangping Gao, som leverte AAV for Denne studien.

FVB/NJ mus ble avlet i dyr anlegget av nøkkelen laboratorium av Hebei Nevrologi. Alle mus eksperimenter ble godkjent av den andre sykehus av Hebei medisinske universitet etikk og utført i henhold til regelverket laboratorium dyr Management kunngjort av departementet for vitenskap og teknologi av People's Republic of Kina.
1. utarbeidelse av 20% lidokain hydroklorid lagerløsning
<ol><li>Veie 2 g lidokain hydroklorid. Legge til 5-6 mL av sterilt vann og vortex forsiktig. Forhøye kvantum to...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Teknisk, det er flere viktige trinn under IT injeksjon i våken mus. Først, riktig gest og fast kontroll av musene gjennom hele operasjonen er en forutsetning for vellykket leveranse. Andre er det vanskeligste punktet følelsen intervertebral plass med pinne-spissen som ikke må sette inn for dypt uten motstand eller sette makt under sterk motstand i skadet dyrene eller bøye pinne-spissen. Tredje, selv om midlertidig lammelser på grunn av lidocaine gir en objektiv indikator for injeksjon kvalitet, mer trening er nødv...

AAV kan megle langvarig og utbredt genuttrykk i CNS signaltransduksjon noen bivirkninger, og derfor har blitt en av de mest lovende kjøretøyene for genterapi å behandle CNS sykdommer inkludert amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Huntingtons sykdom (HD), Alzheimers sykdom (AD), lysosomale lagring sykdommer (LSD), Gaucher sykdom (GD) og neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. For tiden har mer enn 100 AAV serotyper vært isolert fra mennesker og dyr. Blant disse, minst 12 har blitt brukt i prekliniske og kliniske studier, inkludert de mest brukte genet vektorer som AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 og rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Ulike CNS sykdommer krever forskjellige AAV levering strategier på grunn av ulike berørte CNS regioner og celletyper. CNS regionene og celle som AAV kan transduce avhengig av serotype og leveringsmetode. For eksempel har rAAVrh10 blitt vist å transduce overveiende astrocyttene når levert av systemisk intravenøs injeksjon (IV), mens det transduced både neurons og glia når levert av intratekal injeksjon4,7. I tillegg resulterte parenchyma injeksjon i lokale signaltransduksjon til nærheten av injeksjonsstedet, mens injeksjon i spinalvæske (CSF) gjennom intraventricular eller intratekal injeksjon resulterte i omfattende CNS signaltransduksjon8 . Studier har også vist terapeutiske potens av AAV levert genterapi i nevrodegenerative lidelser av den administrasjon9,10,11. I sykdommer som påvirker brede områder av CNS som ALS, har intratekal injeksjon i CSF vist å dekke de fleste områder som er rammet av sykdommen med en lavere dose, sammenlignet med en systemisk levering metode4,10. Studier har også vist at lumbale punktering kan brukes til å injisere AAV musen modeller for ALS, som unngår potensielle skader forbundet med laminectomy og intratekal catheterization4.
Eksperimentell direkte lumbale punktering ble først brukt til å levere agenter særlig bedøvelse, til ryggmargen analgesi og anestesi i 188512,13. I denne rapporten viser vi den lumbale punktering IT injeksjon metode i voksen mus ved hjelp av 1% lidokain hydroklorid, en lokal amid-avledet bedøvelse, i injeksjon løsningen å evaluere og overvåke injeksjon kvalitet. Vellykket injeksjoner var preget av lidocaine-indusert midlertidig lammelse, mens mislykkede injeksjoner ikke viste dette problemet. Vi klassifisert nivået av forbigående svakhet som en av fem karakterer til å forutse Injeksjonseffektiviteten. Endelig viser vi at rAAVrh10 signaltransduksjon nivået kan bli spådd av karakteren lammelse. Dette intratekal AAV leveringsmåte kan derfor brukes til å forbedre AAV-mediert gen-levering for eksperimentell terapi CNS sykdommer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Intratekal IT injeksjon av adeno-assosiert virus (AAV) har trukket betydelig interesse i CNS genterapi i kraft av sin sikkerhet, noninvasiveness og utmerket signaltransduksjon effekt i CNS. Tidligere studier har vist den terapeutiske potens av AAV levert genterapi i nevrodegenerative lidelser av den administrasjon. Men er høy forekomst av uforutsigbare feil på grunn av tekniske begrensning av IT-administrasjon i små dyr rapportert. Her etablert vi et poengsystem for å angi suksess omfanget av lumbale punktering i små dyr ved å legge til 1% lidokain hydroklorid i injeksjon løsningen. Vi videre vise at omfanget av forbigående svakhet etter injeksjon kan forutsi signaltransduksjon effektiviteten av AAV. Derfor kan denne IT injeksjon metoden brukes til å optimalisere terapeutisk studier i musen modeller av CNS sykdommer som hjemsøker brede områder av CNS.

Mus viste ulike grader av forbigående svakhet rett etter det injeksjon av AAV løsning i 1% lidokain hydroklorid på grunn av ulike kvaliteten av intratekal injeksjon. Ifølge semi kvantitative 5 førsteklasses scoring system har vi etablert, vi testet signaltransduksjon mønstre av AAV i mus med forskjellige grader av lidocaine-indusert lem svakhet (skala 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4, scorer 5, n = 3). EGFP immunostaining av spinal snorer viste enten ingen eller liten signal...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Her presenterer vi en direkte intratekal injeksjon teknikken bruker 1% lidokain hydroklorid i en viral løsning å sikre effektiv adeno-assosiert virus levering til små dyr og etablere et poengsystem for å forutsi signaltransduksjon effektivitet i central nervesystemet etter forbigående svakhet av lidocaine.

Direkte intratekal injeksjon av rekombinant Adeno-assosiert virus i voksen mus

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Denne metoden letter effektiv intratekal levering av adeno-assosierte virale transgener i våkne små dyr for eksperimentell behandling av sykdommer i sentralnervesystemet som ALS. Den største fordelen med denne metoden er at virusløsningen inkluderer 1% lidokainhydroklorid som induserer en forbigående lammelse etter en vellykket injeksjon. Selv om denne metoden gir en visuell indikator for å bedømme suksessen til den intratekale automatiserte situasjonen, er tilstrekkelig praksis avgjørende for å forbedre suksessraten for leveringen.Før du begynner prosedyren, fest en 27 gauge nål til en 25 mikroliter Hamilton sprøyte og justere skråspissen av nålen med volumetrisk skala på sprøyten. Deretter forsiktig laste 8 mikroliter på 4 x 10 til 10th genom kopier av virusoppløsningen i sprøyten, ta vare på å unngå bobler. Deretter plasserer du en våken 30 til 70 dagers gammel 12 til 30 gram mus på et sengestykke i utsatt stilling i en biosikkerhetshette og dekker overkroppen med steril gasbind for å roe musen og for å unngå å bli bitt.Ta godt tak i musen på bekkenbeltet med tommelen på den ene siden og pekefingeren og langfingeren på den andre siden som holder huden mellom de bilaterale bekkenbeltene stramme med tommel og pekefinger. Barber deretter pelsen mellom de bilaterale bekkenbeltene og steriliser den eksponerte huden med en jodbasert skrubb og 70% etanol. For direkte intratekal levering av den adeno-tilknyttede virusløsningen, palper intervertebralrommet langs midtlinjen mellom de bilaterale bekkenbeltene og bruk en negl for å trykke inn en innrykk i huden for å indikere L5 til L6 intervertebral plass.Roter bunnen av halen litt og forsiktig for å avsløre ryggradens midtlinje og juster nålens skråkant mot dyrets hode. Med musen festet godt på plass, juster nålen langs midtlinjen av ryggraden og sett nålen forsiktig og vertikalt inn i midten av innrykket som holder sprøyten i et sentralt skyttenplan. Når nålen kommer i kontakt med beinet, sakte redusere vinkelen til ca 30 grader og slipp nålen inn i mellomvirvelrommet.En plutselig haleflikk er et tegn på en vellykket inntreden i intraduralrommet. Når nålen kommer inn i mellomvirvelrommet, vil spissen føles godt fastklemt. Injiser vektorløsningen, og hold nålen innenfor intraduralrommet i ett minutt.Trekk deretter kanylen langsomt ut med rotasjon for å minimere lekkasje. Skår umiddelbart den forbigående svakheten til muselemmer for å evaluere injeksjonskvaliteten og returnere musen til buret for gjenoppretting fra lammelsen. Ved riktig eksperimentelt endepunkt, fest lemmer og hode av den injiserte musen i utsatt stilling på et skumboksdeksel og bruk saks til å strippe og fjerne huden fra hodet til sakrummet.Fest skallen mellom øynene, kutt langs midtlinjen av skallen og den horisontale linjen over lillehjernen og åpne skallen på hver side. Bruk pinsett for å fjerne det occipitale beinet og bruk oftalmisk saks for å åpne spinalkanalen bilateralt. Klipp ribbeina på begge sider og fjern forsiktig den øvre delen av ryggvirvlene.Bruk buede pinsett for å løfte hjernen og bryte nervene i skallen base. Deretter trekker du forsiktig ut hele hjernen og ryggmargen og fikser vevet i 4% paraformaldehyd i 24 timer. På slutten av fikseringsperioden, kryoprotect hjernen og cervical og lumbal ryggmargen i 30% sukrose løsning over natten på 4 grader Celsius etterfulgt av innebygging i optimal skjæretemperatur sammensatte før snap frysing i flytende nitrogen.Bruk deretter en kryostat for å oppnå 25 mikrometer tykke deler av hvert vev, og lagre de frosne delene i 0,01 molar PBS ved 4 grader Celsius som de oppnås. For immunohistokjemisk analyse av vevet, forbehandle de frie flytende seksjonene med 1% hydrogenperoksid i 10 minutter etterfulgt av en 10 minutters vask i PBS. Deretter inkubere prøvene i blokkeringsløsning som inneholder 5% serum og 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel i PBS i 1 time etterfulgt av overnattingmerking ved 4 grader Celsius med de riktige primære antistoffene av interesse.Neste dag vask seksjonene med 3 10 minutters vasker i PBS pluss Tween og inkuber lysbildene med passende tilsvarende biotinylert sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1 time etter siste vask. På slutten av inkubasjonen vasker du seksjonene 3 ganger i fersk PBST som nettopp demonstrert og inkubere prøvene med infinity biotin peroxidase kompleks i 40 minutter etterfulgt av farging med et passende kromogent middel. Monter de merkede seksjonene på glassmikroskopsklier og suge lysbildene i vannfri etanol i 5 minutter når de monterte seksjonene er fullstendig tørket.Deretter suge lysbildene i xylen i 10 minutter og forsegle dem med et passende monteringsmedium. Deretter bilde lysbildene med et lett mikroskop utstyrt med en lade koblede enhet på 100, 200 og 400 ganger forstørrelser. eGFP immunstaining av cervical og lumbal ryggmargsvev seksjoner avslører liten eller ingen transduksjon i lumbale ryggmargen av mus med en svakhet score på 0, litt forbedret transduksjon hos mus med en svakhet score på 1, og sterke og utbredte transduksjoner hos mus med en svakhet score på 4 eller 5.Kvantifisering av GFP-fargingsintensiteten av ryggmargsvevsseksjoner fra mus som viser ulike grader av forbigående lemsvakhet indikerer at alvorlighetsgraden av svakheten etter virusinjeksjonen korrelerer tett med omfanget av ryggmargstransduksjonen. I hjernen oppdages robuste eGFP-signaler i olfaktorisk pære, dorsolateral prefrontal cortex, dentate gyrus og CA3-sonen til hippocampus, cerebellar cortex og marginale områder av hjernestammen, inkludert ansiktskjernen, choroid plexus og ependymal epitelceller. Motornevroner i fremre horn er også sterkt transdusert i forskjellige nivåer av ryggmargen.Videre, i cortex, GFP positive nevroner inkludert pyramidale celler oppdages samt ulike glial celletyper inkludert microglia, astrocytter, og oligodendrocytes. Denne teknikken gjør det mulig for forskere i nevrologifeltet å utforske de terapeutiske effektene av direkte intratekal levering hos små våkne dyr på sykdommer i sentralnervesystemet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assosiert Virus 9 (AAV9) Vector Levering i voksne mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assosiert Virus-mediert Transgene uttrykk i genetisk definerte nerveceller i ryggmargen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transkraniell likestrøm stimulering (tDCS) i mus

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produksjon, rensing og kvalitetskontroll for Adeno-assosiert Virus-basert vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Dobbel direkte injeksjon av blod inn i Cisterna Magna som modell av Subaraknoid blødning

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Elektrokortikografisk opptak av hjernebarkområder manipulert ved hjelp av et adeno-assosiert virus rettet mot cofilin hos mus

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Intracerebroventrikulær injeksjon hos mus

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Intratekal injeksjon av nyfødt mus for genomredigering og legemiddellevering

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...