Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento Provincial de recursos humanos da HEBEI e Segurança Social (CY201605) e uma bolsa da Fundação ciência Natural da província de Hebei (H2017206101), e agradecemos muito ao Dr. Gao Guangping, que forneceu o vírus adeno-associados para Este estudo.

Camundongos FVB/NJ foram criados na instalação de animais de laboratório chave de Neurologia de Hebei. Todos os experimentos de rato foram aprovados pelo segundo Hospital de Hebei médica Universidade Comitê de ética e realizados de acordo com os regulamentos de animais de laboratório, promulgada pelo Ministério da ciência e tecnologia da República Popular da China.
1. preparação da solução-mãe cloridrato de lidocaína 20%
<ol><li>Pese 2 g de cloridrato de lidocaína. Adicione ...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Tecnicamente, há várias etapas críticas durante a injeção de IT em ratos acordados. Primeiro, bom gesto e firme controle dos ratos ao longo de toda a operação é um pré-requisito para o sucesso na entrega. Em segundo lugar, o ponto mais difícil é sentir o espaço intervertebral com a ponta da agulha, como é necessário para não inserir profundamente sem resistência ou inserir forçadamente sob forte resistência no caso de ferir os animais ou dobra a ponta da agulha. Em terceiro lugar, embora a paralisia tra...

AAV pode mediar a expressão do gene a longo prazo e generalizada na transdução de CNS com poucos efeitos colaterais e, portanto, tornou-se um dos veículos mais promissoras para terapia gênica tratar doenças do CNS, incluindo esclerose lateral amiotrófica (ela), Huntington doença (HD), a doença de Alzheimer (AD), doenças de depósito lisossômico (LSD), doença de Gaucher (GD) e neuronal ceroid DoenÃ (NCL)1. Atualmente, mais de 100 sorotipos de vírus adeno-associados têm sido isolados de humanos e animais. Entre estes, pelo menos 12 foram usados em pré-clínicos e clínicos, incluindo o mais comumente usado vetores de gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Doenças de CNS diferentes exigem diferentes estratégias de entrega AAV, devido a várias regiões afectadas do CNS e tipos de células. As regiões de CNS e célula tipos que AAV pode transduce varia dependendo do serótipo bem como método de entrega. Por exemplo, rAAVrh10 tem demonstrado transduce predominantemente astrócitos quando entregue por sistêmica injeção intravenosa (IV), Considerando que ele nao tanto neurônios e glia quando entregue por intratecal injeção4,7. Além disso, a injeção de parênquima resultou na transdução de local para as imediações do local da injeção, Considerando que a injeção no fluido cerebrospinal (CSF) através de intraventricular ou injeção intratecal resultou na transdução generalizada de CNS8 . Estudos também demonstraram potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração9,10,11. Em doenças que afetam grandes áreas do SNC tais como ALS, injeção intratecal para o CSF foi mostrada para cobrir a maior parte das áreas que são afectados pela doença com uma dose mais baixa, em comparação com um método de entrega sistêmica4,10. Estudos recentes têm mostrado também que a punção lombar pode ser usada para injetar o vírus adeno-associados em modelos do rato para ALS, que evita lesões potenciais associados com laminectomia e intratecal cateterismo4.
Experimental punção direta foi usada primeiramente para entregar agentes anestésicos, especialmente, para a medula espinhal para analgesia e anestesia em 188512,13. Neste relatório, podemos ilustrar a punção lombar método de injeção é em ratos adultos, com o auxílio de 1% de cloridrato de lidocaína, um anestésico local Amida derivada, na solução de injeção para avaliar e monitorar a qualidade de injeção. Injeções bem sucedidas foram marcadas por paralisia transitória induzida por lidocaína, Considerando que a falha de injeções não mostrou esse comportamento. Estamos classificados o nível de fraqueza transitória, como uma das cinco classes para ajudar a prever a eficiência de injeção. Finalmente, mostramos que o nível de transdução de rAAVrh10 pode ser previsto pelo grau de paralisia. Portanto, este método de entrega AAV intratecal pode ser usado para melhorar a AAV-mediada gene-entrega para terapia experimental das doenças do CNS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Injeção intratecal (IT) do vírus adeno-associado (AAV) tem atraído considerável interesse na terapia de gene CNS em virtude de sua segurança, noninvasiveness e transdução excelente eficácia no SNC. Estudos anteriores têm demonstrado a potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração. No entanto, altas taxas de falha imprevisível devido a limitação técnica de administração de ti em pequenos animais têm sido relatadas. Aqui, nós estabelecemos um sistema de Pontuação para indicar o grau de sucesso de punção lombar em pequenos animais pela adição de cloridrato de lidocaína a 1% para a solução de injeção. Vamos mostrar ainda mais que a extensão da fraqueza transitória após injeção pode prever a eficiência de transdução de AAV. Assim, este método de injeção de IT pode ser usado para otimizar os ensaios terapêuticos em modelos do rato de doenças CNS que afligem largas regiões do SNC.

Camundongos mostraram graus diferentes de fraqueza transitória logo após ele injeção da solução AAV no cloridrato de lidocaína 1% devido a vários qualidade de injeção intratecal. De acordo com o semigrau 5 sistema de pontuação que estabelecemos, nós testamos os padrões de transdução da AAV em camundongos com graus diferentes de fraqueza induzida por lidocaína membro (Pontuação 0, n = 2; escore 1, n = 1; marcar 4, n = 4; Pontuação 5, n = 3). EGFP imunocoloração de es...

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Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Este método facilita a eficiente entrega intratecal de transgênicos virais associados ao adeno em animais de pequeno porte acordados para o tratamento experimental de doenças do sistema nervoso central, como a ELA. A principal vantagem deste método é que a solução viral inclui cloridrato de 1%lidocaína que induz uma paralisia transitória após uma injeção bem sucedida. Embora este método forneça um indicador visual para julgar o sucesso da situação automatizada intratecal, a prática suficiente é essencial para melhorar a taxa de sucesso da entrega.Antes de iniciar o procedimento, conecte uma agulha de calibre 27 a uma seringa Hamilton de 25 microliter e alinhe a ponta chanfrada da agulha com a balança volumosa na seringa. Em seguida, carregue cuidadosamente 8 microliters de 4 x 10 para o décimo genoma cópias da solução do vírus na seringa, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, coloque um rato acordado de 30 a 70 dias de idade de 12 a 30 gramas em uma peça de cama na posição propensa em um capô biossegurança e cubra o corpo superior com gaze estéril para acalmar o rato e evitar ser mordido.Segure firmemente o mouse em sua cinta pélvica com o polegar de um lado e o dedo indicador e o dedo médio do outro lado mantendo a pele entre as cintas pélvicas bilaterais esticada com um polegar e dedo indicador. Em seguida, raspe a pele entre as cintas pélvicas bilaterais e esterilize a pele exposta com um esfoliante à base de iodo e 70% de etanol. Para a entrega intratecal direta da solução de vírus associada ao adeno, palpa o espaço intervertebral ao longo da linha média entre as cintas pélvicas bilaterais e use uma unha para deprimir uma recuo na pele para indicar o espaço intervertebral L5 a L6.Gire a base da cauda ligeiramente e suavemente para revelar a linha média da coluna vertebral e ajustar o bisel da agulha em direção à cabeça do animal. Com o mouse firmemente posicionado, alinhe a agulha ao longo da linha média da coluna vertebral e insira a agulha suave e verticalmente no centro do recuo mantendo a seringa em um plano sagital central. Quando a agulha entrar em contato com o osso, diminua lentamente o ângulo para aproximadamente 30 graus e deslize a agulha para o espaço intervertebral.Um súbito movimento de cauda é um sinal de uma entrada bem sucedida no espaço intradural. Quando a agulha entrar no espaço intervertebral, a ponta se sentirá firmemente presa. Injete a solução vetorial e mantenha a agulha dentro do espaço intradural por um minuto.Em seguida, retire lentamente a agulha com rotação para minimizar o vazamento. Escore imediatamente a fraqueza transitória dos membros do rato para avaliar a qualidade da injeção e devolver o mouse à sua gaiola para recuperação da paralisia. No ponto final experimental apropriado, fixar os membros e a cabeça do rato injetado na posição propensa em uma tampa de caixa de espuma e usar uma tesoura para tirar e remover a pele da cabeça para o sacro.Corte o crânio entre os olhos, corte ao longo da linha média do crânio e a linha horizontal acima do cerebelo e abra o crânio de cada lado. Use pinças para remover o osso occipital e use uma tesoura oftálmica para abrir bilateralmente o canal espinhal. Corte as costelas em ambos os lados e remova cuidadosamente a parte superior das vértebras.Use pinças curvas para levantar o cérebro e cortar os nervos da base do crânio. Em seguida, extrair cuidadosamente todo o cérebro e medula espinhal e fixar os tecidos em 4% de paraformaldeído por 24 horas. Ao final do período de fixação, crioprotege o cérebro e a medula espinhal cervical e lombar em solução de 30% de sacarose durante a noite a 4 graus Celsius seguido de incorporação no composto de temperatura de corte ideal antes de quebrar o congelamento em nitrogênio líquido.Em seguida, use um criostat para obter seções de 25 micrômetros de espessura de cada tecido, armazenando as seções congeladas em PBS molar de 0,01 a 4 graus Celsius à medida que são obtidas. Para análise imunohistoquímica dos tecidos, pré-trar as seções flutuantes livres com peróxido de hidrogênio de 1% por 10 minutos seguido de uma lavagem de 10 minutos em PBS. Em seguida, incubar as amostras em solução de bloqueio contendo 5% de soro e detergente não iônico de 0,3% na PBS por 1 hora, seguido pela rotulagem noturna a 4 graus Celsius com os anticorpos primários de interesse apropriados.No dia seguinte, lave as seções com lavagens de 3 10 minutos em PBS mais Tween e incuba os slides com os anticorpos secundários biotinilados correspondentes apropriados à temperatura ambiente por 1 hora após a última lavagem. Ao final da incubação, lave as seções 3 vezes em PBST fresco como apenas demonstrado e incuba as amostras com complexo de peroxidase de biotina infinita por 40 minutos seguido de coloração com um agente cromogênico apropriado. Monte as seções rotuladas em lâminas de microscópio de vidro e mergulhe os slides em etanol anidro por 5 minutos, uma vez que as seções montadas tenham secado completamente.Em seguida, mergulhe os slides em xileno por 10 minutos e sele-os com um meio de montagem apropriado. Em seguida, imagem os slides com um microscópio de luz equipado com um dispositivo acoplado a carga em 100, 200 e 400 vezes ampliações. A imunostaining eGFP de seções de tecido medular cervical e lombar revela pouca ou nenhuma transdução na medula espinhal lombar de camundongos com um escore de fraqueza de 0, transdução ligeiramente aumentada em camundongos com um escore de fraqueza de 1, e transduções fortes e generalizadas em camundongos com um escore de fraqueza de 4 ou 5.A quantificação da intensidade de coloração do GFP das seções de tecido medular de camundongos que apresentam vários graus de fraqueza transitória dos membros indica que a gravidade da fraqueza após a injeção da solução do vírus se correlaciona estreitamente com a extensão da transdução da medula espinhal. No cérebro, sinais robustos de eGFP são detectados na lâmpada olfativa, córtex pré-frontal dorsolateral, giro dentado e na zona CA3 do hipocampo, córtex cerebelar e áreas marginais do tronco cerebral, incluindo o núcleo facial, plexo choroide e as células epiteliais ependímicas. Os neurônios motores nos chifres anteriores também são fortemente transduzidos em diferentes níveis da medula espinhal.Além disso, no córtex, os neurônios positivos GFP, incluindo células piramiadas, são detectados, bem como vários tipos de células gliais, incluindo microglia, astrócitos e oligodenrócitos. Essa técnica permite que pesquisadores da área de neurologia explorem os efeitos terapêuticos do parto intratecal direto em pequenos animais acordados em doenças do sistema nervoso central.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Neurociência

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcraniana por corrente contínua estimulação (tDCS) em ratos

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Dupla injeção direta de sangue na Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnóide

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Registro eletrocorticográfico de áreas do córtex cerebral manipulado usando um vírus associado ao Adeno visando cofilina em camundongos

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Injeção Intracerebroventricular em Camundongos

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Injeção Intratecal de Camundongos Recém-Nascidos para Edição do Genoma e Liberação de Fármacos

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...