Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Эта работа финансировалась грант от ХЭБЭЙ провинций Департамент людских ресурсов и социального обеспечения (CY201605) и гранта от фонда естественных наук провинции Хэбэй (H2017206101), и мы очень благодарны доктора для ГАО Гуанпин, которые предоставили AAV для Это исследование.

FVB/NJ мышей были разведены в объекте животных ключ лаборатории неврологии Хэбэй. Все мыши эксперименты были утверждены второй больницы из провинции Хэбэй медицинского университета этики Комитетом и осуществляется согласно положениям о лабораторных животных управления, принятые минис...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Технически есть несколько критических шагов во время инъекции IT проснулись мышей. Во-первых, надлежащий контроль жест и фирма мышей на протяжении всей операции является необходимым условием для успешной доставки. Во-вторых самые сложные точки чувство межпозвонкового пространства с к?...

AAV может посредничать экспрессии генов долгосрочный и широко распространенных в ЦНС трансдукция с несколько побочных эффектов и таким образом стал одним из наиболее перспективных транспортных средств для генной терапии для лечения заболеваний ЦНС, включая боковой амиотрофический склероз (ALS), Хантингтон болезнь (HD), болезни Альцгеймера (AD), хранения лизосомных заболеваний (ЛСД), болезнь Гоше (GD) и нейрональных цероид lipofuscinosis (NCL)1. В настоящее время более чем 100 AAV серотипов были изолированы от людей и животных. Среди них, по крайней мере 12 были использованы в доклинических и клинических испытаний, в том числе наиболее часто используемые гена векторов, таких как AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 и rAAVrh.101,2,3,,4, 5,6.
Различные заболевания ЦНС требуют разных стратегий AAV доставки из-за различных пострадавших регионов ЦНС и типы клеток. CNS регионов и клеток типы, которые могут передают AAV варьируется в зависимости от серотип а также способ доставки. Например было показано rAAVrh10 передавать преимущественно астроциты при доставке системных внутривенном (IV), в то время как он преобразованы нейронов и глии при доставке Интратекальное инъекций4,7. Кроме того паренхима инъекций привели к местных трансдукции в близости от укола, тогда как в спинномозговой жидкости (CSF) через внутрижелудочкового или Интратекальное инъекции привело к широко распространенной ЦНС трансдукции8 . Исследования также продемонстрировали терапевтических потенции AAV-доставлены генной терапии нейродегенеративных расстройств, его администрации9,10,11. Заболеваний, которые влияют на широких областях ЦНС как ALS было показано Интратекальное инъекции в РСУ охватывают большинство областей, которые страдают от болезни с низкой дозы, по сравнению с системными доставки метод4,10. Недавние исследования также показали, что Люмбальная пункция может использоваться для вставки AAV в моделях мыши для ALS, что позволяет избежать возможных травм, связанных с Ламинэктомия и Интратекальное катетеризация4.
Экспериментальные прямые Люмбальная пункция был впервые использован для доставки агентов, особенно анестетики, спинного для анестезии и наркоза в 1885 году12,13. В настоящем докладе мы иллюстрируем Поясничная пункция это инъекционный метод у взрослых мышей с помощью 1% лидокаина гидрохлорид, местной анестезии Амид производные, в инъекционного раствора для оценки и контроля качества инъекций. Успешное инъекции были отмечены лидокаин индуцированной временный паралич, тогда как неудачных инъекций не показывать это поведение. Мы классифицировать уровень переходных слабость как один из пяти классов, чтобы помочь предсказать эффективность инъекции. Наконец мы покажем, что уровень трансдукции rAAVrh10 могут быть предсказаны класс паралич. Таким образом этот метод доставки AAV Интратекальное может использоваться для повышения AAV-опосредованной ген поставка для экспериментальной терапии заболеваний ЦНС.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Интратекальное (ИТ) для инъекций аденоассоциированный вирус (AAV) привлекла большой интерес в ЦНС генной терапии в силу его безопасность, неивназивности и отличные трансдукции эффективность в ЦНС. Предыдущие исследования продемонстрировали терапевтического потенции AAV-доставлены генной терапии нейродегенеративных расстройств, его администрации. Однако были зарегистрированы высокие темпы непредсказуемым отказа из-за технического ограничения ИТ-администрирования в мелких животных. Здесь мы создали систему скоринга для обозначения степени успех поясничный прокол в мелких животных, добавив 1% лидокаина гидрохлорида в инъекционного раствора. Далее мы покажем, что степень переходных слабость после инъекции может предсказать эффективность трансдукции AAV. Таким образом этот метод впрыска ИТ может использоваться для оптимизации лечебные испытания в моделях мыши ЦНС заболеваний, которые поражают широким регионов центральной нервной системы.

Мышей показал разной степени переходных слабость сразу после его инъекционного раствора AAV лидокаина гидрохлорид 1% из-за различных качества Интратекальное инъекции. Согласно полуколичественного 5-класс скоринговая система мы создали, мы протестировали трансдукции ?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Здесь мы представляем технику инъекций непосредственно Интратекальное, с использованием 1% лидокаина гидрохлорида в вирусного решение для обеспечения эффективного аденоассоциированный вирус доставки мелких животных и создать систему скоринга для прогнозирования эффективности трансдукции в Центральной нервной системы по степени переходных слабость, вызванных лидокаина.

Непосредственный впрыск Интратекальное рекомбинантного адено связанные вирусов у взрослых мышей

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Этот метод облегчает эффективную внутритекалию доставки адено-ассоциированных вирусных трансгенов у бодрствующих мелких животных для экспериментального лечения заболеваний центральной нервной системы, таких как ALS. Основным преимуществом этого метода является то, что вирусный раствор включает в себя 1%лидокаин гидрохлорид, который вызывает переходный паралич после успешной инъекции. Хотя этот метод обеспечивает визуальный показатель для оценки успеха внутритекалио автоматизированной ситуации, достаточная практика имеет важное значение для повышения успешности доставки.Перед началом процедуры прикрепите 27-го калибра иглы к 25 микролитровому шприцу Гамильтона и выровняете скошенный кончик иглы с объемной шкалой на шприце. Затем осторожно загрузите 8 микролитров от 4 х 10 до 10-го генома копии раствора вируса в шприц, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Затем поместите бодрствующее 30-70-дневное 12-30-граммовую мышь на кусок кровати в положении, подверженном биобезопасности, и накройте верхнюю часть тела стерильной марлей, чтобы успокоить мышь и избежать укуса.Твердо сцепление мыши на тазовом поясе с большим пальцем на одной стороне и указательный палец и средний палец на другой стороне поддержанию кожи между двусторонними тазовых поясов тугой с большим и указательным пальцами. Затем побрить мех между двусторонними тазовыми поясами и стерилизовать открытые кожи с йодом основе скраб и 70%этанола. Для прямой внутритехальной доставки адено-ассоциированного вирусного раствора, пальпировать межпозвонковое пространство вдоль средней линии между двусторонними тазовыми поясами и использовать ногти, чтобы угнетать отступ в кожу, чтобы указать L5 до L6 межпозвонкового пространства.Поверните основание хвоста слегка и осторожно, чтобы выявить середину позвоночника и настроить скошенную иглу к голове животного. С помощью мыши, прочно закрепленной в положении, выровняйте иглу вдоль средней линии позвоночника и вставьте иглу мягко и вертикально в центр отступа, удерживая шприц в центральной сагиттаальной плоскости. Когда игла вступает в контакт с костью, медленно уменьшаем угол примерно до 30 градусов и скольжение иглы в межпозвонковое пространство.Внезапное движение хвоста является признаком успешного входа во внутридуральное пространство. Когда игла входит в межпозвонковое пространство, кончик будет чувствовать себя твердо зажатым. Введи векторный раствор и поддерживайте иглу внутри внутридурального пространства в течение одной минуты.Затем медленно снять иглу с вращением, чтобы свести к минимуму утечку. Немедленно забить преходящую слабость конечностей мыши, чтобы оценить качество инъекции и вернуть мышь в клетку для восстановления после паралича. В соответствующей экспериментальной конечной точке, исправить конечностей и головы вводили мыши в положении склонны на крышку пены коробки и использовать ножницы, чтобы раздеться и удалить кожу с головы до крестца.Зарежьте череп между глазами, прорежьте вдоль средней линии черепа и горизонтальной линии над мозжечок и откройте череп с каждой стороны. Используйте пинцет для удаления затылочной кости и использовать офтальмологические ножницы, чтобы открыть позвоночный канал на двусторонней основе. Вырезать ребра с обеих сторон и тщательно удалить верхнюю часть позвонков.Используйте изогнутые пинцеты, чтобы поднять мозг и разорвать нервы основания черепа. Затем тщательно извлечь весь мозг и спинной мозг и исправить ткани в 4%paraformaldehyde в течение 24 часов. В конце периода фиксации криопротезирование головного и шейного и поясничного спинного мозга в 30%-ном растворе сахарозы на ночь при температуре 4 градуса Цельсия с последующим встраиванием в оптимальное температурное соединение резки перед оснасткой замораживания в жидком азоте.Затем используйте криостат для получения 25 микрометров толщиной разделов каждой ткани, хранение замороженных секций в 0,01 молара PBS при 4 градусах по Цельсию, как они получены. Для иммуногистохимического анализа тканей предварительно обработать свободно плавающие секции с 1%перекисью водорода в течение 10 минут с последующим 10-минутным мытьем в PBS. Далее инкубировать образцы в блокирующий раствор, содержащий 5%сыворотки и 0,3%неионные моющие средства в PBS в течение 1 часа, а затем ночь маркировки при 4 градусах по Цельсию с соответствующими первичными антителами интереса.На следующий день, мыть разделы с 3 10 минут моет в PBS плюс Tween и инкубировать слайды с соответствующими соответствующими биотинилированных вторичных антител при комнатной температуре в течение 1 часа после последней стирки. В конце инкубации, мыть разделы 3 раза в свежем PBST, как только что продемонстрировали и инкубировать образцы с бесконечности биотин пероксидазы комплекса в течение 40 минут с последующим окрашиванием с соответствующим хромогенным агентом. Намонтировать помеченные разделы на стеклянный микроскоп слайды и замочить слайды в ангидроус этанола в течение 5 минут, как только установленные разделы полностью высохли.Затем замочите горки в ксилене в течение 10 минут и запечатайте их соответствующей крепления среды. Затем изображение слайдов с легким микроскопом оснащен зарядом в сочетании устройства на 100, 200 и 400 раз увеличения. eGFP иммуностимпляции шейки матки и поясничного отдела ткани спинного мозга показывает мало или в отсутствие трансдукции в поясничном спинном мозге мышей со слабостью оценка 0, слегка расширенной трансдукции у мышей со слабостью оценка 1, и сильные и широко распространенные трансдукции у мышей со слабостью оценка 4 или 5.Количественная оценка интенсивности окрашивания GFP секций тканей спинного мозга у мышей, отображающих различные степени преходящей слабости конечностей, указывает на то, что тяжесть слабости после инъекции раствора вируса тесно коррелирует с степенью трансдукции спинного мозга. В головном мозге, надежные сигналы eGFP обнаруживаются в обонятельной лампы, дорсолатеральной префронтальной коры, зубчатой извилины, и CA3 зоны гиппокампа, мозжечковой коры, и маргинальных областях ствола мозга, в том числе лицевого ядра, хороидного сплетения, и эпендимальных эпителиальных клеток. Моторные нейроны в передних рогах также сильно трансуцируются в различных уровнях спинного мозга.Кроме того, в коре головного мозга обнаруживаются положительные нейроны GFP, включая пирамидальные клетки, а также различные типы глиальных клеток, включая микроглию, астроциты и олигодендроциты. Этот метод позволяет исследователям в области неврологии исследовать терапевтическое воздействие прямых внутритекаальных родов у мелких бодрствующими животными при заболеваниях центральной нервной системы.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Внутричерепное Инъекция адено-ассоциированные вирусные векторы

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Субпиальный адено-ассоциированный вирус 9 (AAV9) Доставка векселей для взрослых мышей

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Аденоассоциированный вирус опосредованной трансген выражение в генетически определенных нейронов спинного мозга

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Постоянного тока транскраниальной стимуляции (ЦТД) у мышей

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Производства, очистки и контроля качества для аденоассоциированный вирус основе векторов

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Двойная прямая инъекция крови в Цистерна Магна как модель субарахноидового кровоизлияния

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Электрокортикографическая запись областей коры головного мозга, манипулируемых с использованием аденоассоциированного вируса, нацеленного на кофилин у мышей

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Внутримозговая инъекция мышам

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Интратекальная инъекция новорожденной мыши для редактирования генома и доставки лекарств

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...