Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por una subvención de HEBEI Provincial Departamento de recursos humanos y Seguridad Social (CY201605) y una beca de la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Hebei (H2017206101), y estamos muy agradecidos al Dr. para Gao Guangping, quien proporcionó la AAV para Este estudio.

Ratones FVB/NJ fueron criados en las instalaciones de animales de laboratorio clave de Hebei Neurología. Todos los experimentos de ratón fueron aprobados por el segundo Hospital de Hebei médica Universidad Comité de ética y llevado a cabo conforme a las normas de la gerencia del animal de laboratorio promulgada por el Ministerio de ciencia y tecnología de la República Popular de China.
1. preparación de solución madre del clorhidrato de lidocaína 20%
<ol><li>Pesar 2 g de clorhidrat...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Técnicamente, hay varios pasos críticos durante la inyección de IT en ratones despiertos. En primer lugar, adecuado gesto y firma el control de los ratones a lo largo de toda la operación es un requisito previo para la entrega exitosa. En segundo lugar, el punto más difícil es sentir el espacio intervertebral con la punta de la aguja, ya que es necesario no introducir demasiado profundamente sin resistencia o introduzca por la fuerza bajo fuerte resistencia en el caso de herir a los animales o doblar la punta de la...

AAV puede mediar la expresión génica a largo plazo y generalizados en la transducción del CNS con pocos efectos secundarios y por lo tanto, se ha convertido en uno de los vehículos más prometedoras para la terapia génica para el tratamiento de enfermedades del SNC incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), Huntington enfermedad (HD), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedades de depósito lisosomal (LSD), la enfermedad de Gaucher (GD) y neuronal ceroid lipofuscinosis ceroid (NCL)1. En la actualidad, más de 100 serotipos AAV se han aislado de los seres humanos y animales. Entre ellos, al menos 12 han sido utilizados en preclínicos y ensayos clínicos, incluyendo el más comúnmente utilizan vectores del gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 y rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Enfermedades del SNC diferentes requieren diferentes estrategias de entrega AAV debido a las diversas regiones afectadas de CNS y tipos de la célula. Las regiones de CNS y célula tipos que AAV puede transducir varía según el serotipo así como método de entrega. Por ejemplo, rAAVrh10 ha demostrado que transduce predominantemente astrocitos al entregado por la inyección intravenosa sistémica (IV), mientras que transduced las neuronas y glia entrega intratecal inyectable4,7. Además, inyección de parénquima dio lugar en la transducción de local a los alrededores del sitio de inyección, mientras que la inyección en el líquido cerebroespinal (CSF) a través de intraventricular o intratecal inyectable resultó en la transducción generalizada de CNS8 . Estudios también han demostrado potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por él administración9,10,11. En enfermedades que afectan a amplias zonas del SNC como ALS, inyección intratecal en el LCR se ha demostrado para cubrir la mayoría de las áreas que es afligida por la enfermedad con una dosis más baja, en comparación con un método de entrega sistémica4,10. Estudios recientes también han demostrado que la punción lumbar se puede utilizar para inyectar AAV en modelos de ratón de ALS, que evita posibles lesiones asociadas con cateterización de laminectomía e intratecal4.
Una punción lumbar directa experimental primero fue utilizada para entregar a agentes, especialmente los anestésicos, a la médula espinal para analgesia y anestesia en 188512,13. En este informe, nos ilustran el método de inyección es en ratones adultos con la ayuda del 1% clorhidrato de lidocaína, un anestésico local derivado de amida, en la solución de la inyección para evaluar y controlar la calidad de la inyección la punción lumbar. Inyecciones de éxito fueron marcadas por parálisis transitoria inducida por la lidocaína, mientras que inyecciones no mostró este comportamiento. Clasificamos el nivel de debilidad transitoria como uno de cinco grados para ayudar a predecir la eficacia de la inyección. Finalmente, nos muestran que el nivel de la transducción de rAAVrh10 puede predecirse por el grado de parálisis. Por lo tanto, este método de la entrega intratecal AAV puede utilizarse para mejorar el AAV-mediated gene-entrega para el tratamiento de enfermedades del SNC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

La inyección intratecal (IT) de virus adeno-asociado (AAV) ha atraído un considerable interés en la terapia génica del CNS en virtud de su eficacia de transducción excelente, seguridad y noninvasiveness en el SNC. Estudios anteriores han demostrado la potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por su administración. Sin embargo, se han reportado altas tasas de fracaso impredecible debido a la limitación técnica de administración de TI en pequeños animales. Aquí, hemos establecido un sistema de puntuación para indicar el grado de éxito de la punción lumbar en pequeños animales mediante la adición de clorhidrato de lidocaína 1% en la solución de la inyección. Se muestra más que el grado de debilidad transitoria después de la inyección puede predecir la eficiencia de la transducción de AAV. Por lo tanto, puede utilizarse este método de inyección de TI para optimizar los ensayos terapéuticos en modelos murinos de enfermedades del SNC que afligen a grandes regiones del SNC.

Los ratones mostraron diferentes grados de debilidad transitoria justo después de que inyección de solución AAV en clorhidrato de lidocaína 1% debido a varios calidad de inyección intratecal. Según el sistema de puntuación grado 5 semi cuantitativo hemos establecido, hemos probado los patrones de transducción de AAV en ratones con diferentes grados de debilidad de la extremidad inducida por lidocaína (puntuación de 0, n = 2; puntuación 1, n = 1, puntuación 4, n = 4; puntuació...

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Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Este método facilita la administración intratecal eficiente de transgenes virales adeno asociadas en animales pequeños despiertos para el tratamiento experimental de enfermedades del sistema nervioso central como la ELA. La principal ventaja de este método es que la solución viral incluye 1%clorhidrato de lidocaína que induce una parálisis transitoria después de una inyección exitosa. Aunque este método proporciona un indicador visual para juzgar el éxito de la situación automatizada intratecal, la práctica suficiente es esencial para mejorar la tasa de éxito de la entrega.Antes de comenzar el procedimiento, coloque una aguja de calibre 27 en una jeringa Hamilton de 25 microlitrotros y alinee la punta biselada de la aguja con la escala volumétrica de la jeringa. A continuación, cargue cuidadosamente 8 microlitros de 4 x 10 a las copias del genoma 10 de la solución del virus en la jeringa, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, coloque un ratón despierto de 30 a 70 días de edad de 12 a 30 gramos sobre una pieza de cama en la posición propensa en una capucha de bioseguridad y cubra la parte superior del cuerpo con gasa estéril para calmar al ratón y evitar ser mordido.Agarre firmemente el ratón sobre su faja pélvica con el pulgar en un lado y el dedo índice y medio en el otro lado manteniendo la piel entre las fajas pélvicas bilaterales tensas con un pulgar y un dedo índice. A continuación, afeitar el pelaje entre las fajas pélvicas bilaterales y esterilizar la piel expuesta con un exfoliante a base de yodo y 70%etanol. Para la administración intratecal directa de la solución vírica asociada al adeno, palpar el espacio intervertebral a lo largo de la línea media entre las fajas pélvicas bilaterales y utilizar una uña para deprimir una sangría en la piel para indicar el espacio intervertebral L5 a L6.Gire la base de la cola ligeramente y suavemente para revelar la línea media de la columna vertebral y ajustar el bisel de la aguja hacia la cabeza del animal. Con el ratón firmemente fijado en su posición, alinee la aguja a lo largo de la línea media de la columna vertebral e inserte la aguja suavemente y verticalmente en el centro de la sangría manteniendo la jeringa en un plano sagital central. Cuando la aguja entra en contacto con el hueso, disminuya lentamente el ángulo a aproximadamente 30 grados y deslice la aguja en el espacio intervertebral.Un movimiento de cola repentino es un signo de una entrada exitosa en el espacio intradural. Cuando la aguja entra en el espacio intervertebral, la punta se sentirá firmemente sujeta. Inyecte la solución vectorial y mantenga la aguja dentro del espacio intradural durante un minuto.A continuación, retire lentamente la aguja con rotación para minimizar las fugas. Puntuar inmediatamente la debilidad transitoria de las extremidades del ratón para evaluar la calidad de la inyección y devolver el ratón a su jaula para su recuperación de la parálisis. En el punto final experimental adecuado, fije las extremidades y la cabeza del ratón inyectado en la posición propensa en una cubierta de la caja de espuma y use tijeras para quitar y quitar la piel de la cabeza al sacro.Recorta el cráneo entre los ojos, corta a lo largo de la línea media del cráneo y la línea horizontal por encima del cerebelo y abre el cráneo a cada lado. Use pinzas para extraer el hueso occipital y use tijeras oftálmicas para abrir el canal espinal bilateralmente. Corte las costillas de ambos lados y retire cuidadosamente la sección superior de las vértebras.Usa pinzas curvas para levantar el cerebro y cortar los nervios de la base del cráneo. Luego extrae cuidadosamente todo el cerebro y la médula espinal y fija los tejidos en 4%paraformaldehído durante 24 horas. Al final del período de fijación, crioprotece el cerebro y la médula espinal cervical y lumbar en una solución de 30% de sacarosa durante la noche a 4 grados centígrados seguido de la incrustación en un compuesto óptimo de temperatura de corte antes de congelar el nitrógeno líquido.A continuación, utilice un criostato para obtener secciones de 25 micrómetros de espesor de cada tejido, almacenando las secciones congeladas en 0,01 PBS molar a 4 grados centígrados a medida que se obtienen. Para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos, pretrata las secciones flotantes libres con 1%peróxido de hidrógeno durante 10 minutos seguido de un lavado de 10 minutos en PBS. A continuación, incubar las muestras en solución de bloqueo que contengan 5% de suero y 0,3% detergente no iónico en PBS durante 1 hora seguido de etiquetado nocturno a 4 grados Centígrados con los anticuerpos primarios de interés adecuados.Al día siguiente, lavar las secciones con 3 lavados de 10 minutos en PBS más Tween e incubar los portaobjetos con los anticuerpos secundarios biotinilados correspondientes a temperatura ambiente durante 1 hora después del último lavado. Al final de la incubación, lavar las secciones 3 veces en PBST fresco como acaba de demostrar e incubar las muestras con complejo de biotina peroxidasa infinita durante 40 minutos seguido de tinción con un agente cromogénico adecuado. Monte las secciones etiquetadas en portaobjetos de microscopio de vidrio y remoje los portaobjetos en etanol anhidro durante 5 minutos una vez que las secciones montadas se hayan secado por completo.A continuación, remoje los portaobjetos en xileno durante 10 minutos y séquelos con un medio de montaje adecuado. A continuación, imagine las diapositivas con un microscopio de luz equipado con un dispositivo acoplado de carga a 100, 200 y 400 aumentos. La inmunostaining eGFP de secciones del tejido espinal cervical y lumbar revela poca o ninguna transducción en la médula espinal lumbar de ratones con una puntuación de debilidad de 0, transducción ligeramente mejorada en ratones con una puntuación de debilidad de 1, y transducciones fuertes y generalizadas en ratones con una puntuación de debilidad de 4 o 5.La cuantificación de la intensidad de tinción de la PFNM de las secciones del tejido de la médula espinal de ratones que muestran varios grados de debilidad transitoria de las extremidades indica que la gravedad de la debilidad después de la inyección de la solución del virus se correlaciona estrechamente con la extensión de la transducción de la médula espinal. En el cerebro, se detectan señales eGFP robustas en la bombilla olfativa, la corteza prefrontal dorsolateral, el giro denato y la zona CA3 del hipocampo, la corteza cerebelosa y las zonas marginales del tronco cerebral, incluyendo el núcleo facial, el plexo coroideo y las células epiteliales ependimales. Las neuronas motoras en los cuernos anteriores también se trans inducen fuertemente en diferentes niveles de la médula espinal.Además, en la corteza, se detectan neuronas positivas de GFP, incluidas las células piramidales, así como varios tipos de células gliales, como microglia, astrocitos y oligodendrocitos. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la neurología explorar los efectos terapéuticos del parto intratecal directo en pequeños animales despiertos en enfermedades del sistema nervioso central.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Investigación

Neurociencias

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) en ratones

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Registro electrocorticográfico de áreas de la corteza cerebral manipuladas con un virus adenoaso asociado dirigido a la cofilina en ratones

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Inyección intracerebroventricular en ratones

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Inyección intratecal de ratón recién nacido para la edición del genoma y la administración de fármacos

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...