Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av anslaget från HEBEI provinsiella institutionen av mänskliga resurser och Social trygghet (CY201605) och ett bidrag från naturvetenskap Foundation i Hebei-provinsen (H2017206101), och vi är mycket tacksam för Dr Guangping Gao, som tillhandahöll AAV för denna studie.

Kandeekane/NJ möss var uppvuxna i djuranläggningen nyckel laboratorium av Hebei neurologi. Alla musen experiment godkändes av andra sjukhus av Hebei medicinska universitet etikkommittén och utförs enligt reglementet av laboratoriet djurhållning som utfärdas av ministeriet för vetenskap och teknik av folkets republik av Kina.
1. beredning av 20% lidokain hydroklorid stamlösning
<ol><li>Väg 2 g av lidokain hydroklorid. Tillsätt 5 – 6 mL sterilt vatten och skaka försiktigt. Öka v...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Tekniskt sett finns det flera kritiska steg under IT injektionen i vaken möss. Första, rätt gest och företaget kontroll av möss under hela operationen är en förutsättning för framgångsrik leverans. Det andra är den svåraste punkten känsla intervertebral utrymme med kanylspetsen, som det är nödvändigt att inte infoga för djupt utan motstånd eller infoga med våld under starkt motstånd när det gäller skadar djuren eller böjning nålspetsen. Tredje, även om den övergående förlamningen på grund av ...

AAV kan medla långsiktiga och omfattande genuttryck i den CNS transduktion med få biverkningar, och därför har blivit en av de mest lovande fordon för genterapi att behandla CNS sjukdomar inklusive amyotrofisk lateralskleros (ALS), Huntingtons sjukdom (HD), Alzheimers sjukdom (AD), lysosomala lagring sjukdomar (LSD), Gauchers sjukdom (GD) och neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. För närvarande har mer än 100 AAV serotyper isolerats från människor och djur. Bland dessa, minst 12 har använts i prekliniska och kliniska prövningar, inklusive de vanligaste används genen vektorer såsom AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 och rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Olika CNS sjukdomar kräver olika AAV leverans strategier på grund av de olika drabbade CNS regionerna och celltyper. CNS regionerna och cell typer som AAV kan transduce varierar beroende på serotypen samt leveransmetod. RAAVrh10 har till exempel visat sig transduce huvudsakligen astrocyter när levereras av systemisk intravenös injektion (IV), medan det sensorik både nervceller och glia när levereras av intratekal injektion4,7. Dessutom, resulterade parenkymet injektion i lokala transduktion till närheten av injektionsstället, medan injektion i cerebrospinalvätskan (CSF) via intraventrikulär eller intratekal injektion resulterade i omfattande CNS transduktion8 . Studier har också visat terapeutiska styrka av AAV-levererade genterapi i neurodegenerativa sjukdomar av det administration9,10,11. Sjukdomar som påverkar breda områden i CNS som ALS, har intratekal injektion i CSF visat att täcka de flesta områden som är drabbade av sjukdomen med en lägre dos, jämfört med en systemisk leverans metod4,10. Nyligen genomförda studier har också visat att lumbalpunktion kan användas för att injicera AAV i musmodeller för ALS, som undviker potentiella skador associerade med laminektomi och intratekal kateterisering4.
Experimentell direkt lumbalpunktion användes först att leverera ombud, särskilt bedövningsmedel, till ryggmärgen för analgesi och anestesi i 188512,13. I betänkandet illustrera vi den lumbal punktion IT injektion metod i vuxna möss med hjälp av 1% lidokain hydroklorid, en lokal Amid-derived bedövningsmedel, i injektionslösningen att utvärdera och övervaka injektion kvalitet. Framgångsrika injektioner präglades av lidokain-inducerad övergående förlamning, medan misslyckade injektioner inte visade detta beteende. Vi klassificeras nivån på övergående svaghet som en av fem kvaliteter för att förutsäga injektion effektivitet. Slutligen visar vi att rAAVrh10 transduktion nivån kan förutsägas av grad av förlamning. Detta intratekal AAV leveransmetod kan därför användas för att förbättra AAV-medierad gen-leverans för experimentell behandling av CNS-sjukdomar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

Intratekal (IT) injektion av adeno-associerade virus (AAV) har dragit betydande intresse i CNS genterapi enligt dess säkerhet, noninvasiveness och utmärkt transduktion effekt i CNS. Tidigare studier har visat terapeutiska styrkan av AAV-levererade genterapi i neurodegenerativa sjukdomar av det administration. Dock har höga andelen oförutsägbara misslyckande på grund av tekniska begränsning av IT-administration i små djur rapporterats. Här, etablerat vi ett poängsystem för att ange framgång omfattningen av lumbalpunktion i små djur genom att lägga 1% lidokain hydroklorid i injektionslösningen. Vi visar vidare att omfattningen av övergående svaghet efter injektion kan förutsäga AAV transduktion effektivitet. Denna IT injektion metod kan således användas för att optimera terapeutiska prövningar i musmodeller av CNS-sjukdomar som drabbar breda regioner av CNS.

Möss visade olika grader av övergående svaghet direkt efter den injektion av AAV lösning i 1% lidokain hydroklorid på grund av olika kvalitet av intratekal injektion. Enligt semikvantitativt 5-grade poängsystem har vi, vi testade transduktion mönster av AAV i möss med olika grader av lidokain-inducerad lem svaghet (Poäng 0, n = 2; Poäng 1, n = 1; betyg 4, n = 4; betyg 5, n = 3). ANDRA immunfärgning av ryggmärg visade antingen ingen eller liten transduktion i ländryggen ryggm?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Här presenterar vi en direkt intratekal injektionsteknik med 1% lidokain hydroklorid i en viral lösning att säkerställa effektiv adeno-associerade virus leverans till små djur och etablera ett scoringsystem för att förutsäga transduktion effektivitet i central nervsystemet enligt graden av övergående svaghet orsakade av lidokain.

Direkta intratekal injektion av rekombinant Adeno-associerade virus i vuxna möss

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Denna metod underlättar effektiv intratekal leverans av adeno-associerade virustransgener i vaket smådjur för experimentell behandling av centrala nervsystemet sjukdomar såsom ALS. Den största fördelen med denna metod är att viruslösningen inkluderar 1%lidokainhydroklorid vilket inducerar en övergående förlamning efter en lyckad injektion. Även om denna metod ger en visuell indikator för att bedöma framgången för intratekal automatiserad situation, är tillräcklig praxis avgörande för att förbättra andelen framgångsrika leveransen.Innan du påbörjar proceduren, fäst en 27 gauge nål till en 25 microliter Hamilton spruta och rikta den avfasade spetsen av nålen med den volymetriska skalan på sprutan. Sedan försiktigt ladda 8 mikroliter av 4 x 10 till den 10: e genomet kopior av viruslösningen i sprutan, var noga med att undvika bubblor. Därefter placerar en vaken 30 till 70 dagar gammal 12 till 30 gram mus på en säng bit i utsatt position i en biosäkerhet huva och täcka överkroppen med steril gasväv för att lugna musen och för att undvika att bli biten.Fast grepp musen på bäcken gördel med tummen på ena sidan och pekfingret och långfingret på andra sidan hålla huden mellan den bilaterala bäckenhålorna gördles spänd med en tumme och pekfinger. Sedan raka pälsen mellan de bilaterala bäckengiroarna och sterilisera den exponerade huden med en jodbaserad skrubb och 70%etanol. För direkt intratekal leverans av adeno-associerade viruslösningen, palpate intervertebral utrymmet längs mittlinjen mellan de bilaterala bäckenhålorna gördlar och använda en fingernagel för att trycka ner en indrag i huden för att ange L5 till L6 intervertebral utrymme.Rotera svansens bas något och försiktigt för att avslöja ryggradens mittlinje och justera nålens avfasning mot djurets huvud. Med musen fast ordentligt i läge, rikta nålen längs mittlinjen av ryggraden och för in nålen försiktigt och vertikalt i mitten av indraget hålla sprutan i en central sagittal plan. När nålen kommer i kontakt med benet, långsamt minska vinkeln till cirka 30 grader och glida nålen i det intervertebral utrymmet.En plötslig svans flick är ett tecken på en lyckad inträde i intradural rymden. När nålen kommer in i det intervertebral utrymmet, kommer spetsen kännas fastklämd. Injicera vektorlösningen, och underhåll nålen inom det intradurala utrymmet i en minut.Dra sedan långsamt tillbaka nålen med rotation för att minimera läckage. Omedelbart poäng övergående svaghet av musen lemmar att utvärdera injektion kvalitet och returnera musen till sin bur för återhämtning från förlamning. Vid lämplig experimentell endpoint, fixera lemmarna och huvudet på den injicerade musen i utsatt position på ett skumdostskydd och använd sax för att strippa och avlägsna huden från huvudet till korsbenet.Klipp skallen mellan ögonen, skär längs mittlinjen av skallen och den horisontella linjen ovanför lillhjärnan och öppna skallen på varje sida. Använd pincett för att ta bort det occipitala benet och använd oftalmisk sax för att öppna ryggradskanalen bilateralt. Skär revbenen på båda sidor och försiktigt bort den övre delen av kotor.Använd böjd pincett för att lyfta hjärnan och bryta nerverna i skallbasen. Sedan försiktigt extrahera hela hjärnan och ryggmärgen och fixa vävnaderna i 4%paraformaldehyd i 24 timmar. I slutet av fixeringsperioden, cryoprotect hjärnan och livmoderhalscancer och ländryggen ryggmärgen i 30%sackaros lösning över natten vid 4 grader Celsius följt av inbäddning i optimal skärtemperatur förening innan snäpp frysning i flytande kväve.Använd sedan en kryostat för att få 25 mikrometer tjocka sektioner av varje vävnad, lagra de frysta sektionerna i 0,01 molar PBS vid 4 grader Celsius när de erhålls. För immunohistokemisk analys av vävnaderna, förtredning av de fria flytande sektionerna med 1%väteperoxid i 10 minuter följt av en 10 minuters tvätt i PBS. Inkubera därefter proverna i blockerande lösning som innehåller 5%serum och 0,3%icke-joniskt rengöringsmedel i PBS i 1 timme följt av märkning över natten vid 4 grader Celsius med lämpliga primära antikroppar av intresse.Nästa dag tvättar du sektionerna med 3 10 minuters tvättar i PBS plus Tween och inkuberar objektglasen med lämpliga motsvarande biotinelated sekundära antikroppar vid rumstemperatur under 1 timme efter den sista tvätten. Vid slutet av inkubationen, tvätta sektionerna 3 gånger i färsk PBST som just visats och inkubera proverna med infinity biotinperoxidaskomplex i 40 minuter följt av färgning med ett lämpligt kromogent medel. Montera de märkta sektionerna på glasmikroskopsglas och blötlägg rutschkanorna i vattenfri etanol i 5 minuter när de monterade sektionerna har torkat helt.Nästa blöta diabilderna i xylen i 10 minuter och försegla dem med ett lämpligt monteringsmedium. Sedan avbilda bilderna med ett ljusmikroskop utrustat med en laddnings kopplade enheten på 100, 200 och 400 gånger förstoringar. eGFP immunfärgning av livmoderhalscancer och ryggradens ryggmärg vävnad sektioner avslöjar liten eller ingen transduktion i ländryggen ryggmärgen hos möss med en svaghet poäng 0, något förbättrad transduktion i möss med en svaghet poäng 1, och starka och utbredda transductions i möss med en svaghet poäng 4 eller 5.Kvantifiering av GFP färgning intensiteten av ryggmärgen vävnad sektioner från möss som uppvisar olika grader av transienta lem svaghet indikerar att svårighetsgraden av svaghet efter viruslösning injektionen nära korrelerar med omfattningen av ryggmärgen transduktion. I hjärnan, robust eGFP signaler upptäcks i luktbulben, dorsolateral prefrontal cortex, dentate gyrus, och CA3 zon av hippocampus, cerebellar cortex, och marginella områden av hjärnstammen, inklusive ansiktshärkleus, koroid plexus, och ependymal epitelial celler. Motor nervceller i främre hornen är också starkt transduced i olika nivåer av ryggmärgen.Dessutom, i cortex, GFP positiva nervceller inklusive pyramidala celler upptäcks samt olika gliaceller celltyper inklusive mikroglia, astrocyter, och oligodeblocyter. Denna teknik gör det möjligt för forskare inom neurologi området att utforska de terapeutiska effekterna av direkt intratekal leverans i små vakna djur på centrala nervsystemet sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakraniell Injektion av Adeno-associerad virala vektorer

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpierad adenoassocierad virus 9 (AAV9) vektorleverans i vuxna möss

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associerade Virus-medierad transgenens uttryck i genetiskt definierade nervceller i ryggmärgen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcranial Direct Current stimulering (TDC) hos möss

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Dubbel direktinsprutning av blod i Cisterna Magna som en modell av Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Elektrokortatisk inspelning av hjärnbarkområden manipulerade med hjälp av ett Adeno-associerat virus som riktar sig mot cofilin hos möss

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Intracerebroventrikulär injektion hos möss

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Intratekal injektion av nyfödd mus för genomredigering och läkemedelstillförsel

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...