Name: direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Bu eser HEBEI İl Müdürlüğü insan kaynakları ve sosyal güvenlik (CY201605) hibe ve Hebei Eyaleti, Doğa Bilimleri Vakfı (H2017206101) bir hibe tarafından finanse edildi, ve biz AAV için sağlanan Guangping Gao için Dr için çok minnettarız Bu çalışmada.

FVB/NJ fareler anahtar laboratuvar Hebei Nöroloji hayvan tesiste bred. Tüm fare deneyleri ikinci hastane, Hebei Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvan yönetimi, Çin Halk Cumhuriyeti'nin teknoloji ve Bilim Bakanlığı tarafından yürürlüğe düzenlemelere göre yürütülen Çin.
1. %20 lidokain hidroklorür stok çözelti hazırlanması
<ol><li>Lidokain hidroklorür 2 g ağırlığında. 5-6 mL steril su ve girdap yavaşça ekleyin. 10 mL ster...

<ol>
	<li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system.">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).</li><li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10.">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord.">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+a+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).</li><li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs.">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li><li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice.">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS.">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li><li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1(G93A)+Mice+and+Nonhuman+Primates.">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K/Akt+pathway.">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, 1-10 (2016).</li></ol>

Teknik olarak, uyanık farelerde BT enjeksiyon sırasında birkaç önemli adımlar vardır. İlk, uygun jest ve firma denetimi tüm operasyon boyunca farelerin başarılı teslimat için bir ön koşul olduğunu. İkinci olarak, değil çok fazla direniş olmadan eklemek veya zorla hayvanlar yaralanmasına veya iğne ucunu bükme durumunda güçlü direnç altında eklemek için gerekli olduğu gibi en zor nokta intervertebral alanı iğne ucu ile hissediyor. Üçüncü olarak, lidokain nedeniyle geçici felç objektif ...

AAV CNS iletim birkaç yan etkisi ile uzun vadeli ve yaygın gen ifadesinde aracılık ve bu nedenle amyotrofik lateral skleroz (ALS), Huntington'ın da dahil olmak üzere CNS hastalıkları tedavi etmek gen tedavisi için en umut verici araçlar haline gelmiştir hastalığı (HD), Alzheimer hastalığı (Ah), lizozomal hastalıklar (LSD), Gaucher hastalığı (GD) ve nöronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. Halen, 100'den fazla AAV serotipleri insan ve hayvan izole edilmiştir. Bunlar arasında en az 12 içinde Preklinik kullanılmıştır ve en çok da dahil olmak üzere klinik çalışmalarda kullanılan gen vektörel çizimler gibi AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ve rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Farklı CNS hastalıkları nedeniyle çeşitli etkilenen CNS bölgeler ve hücre tipleri farklı AAV teslim stratejileri gerektirir. CNS bölgeler ve hücre AAV transduce türleri değişir bağlı olarak serotip yanı sıra teslimat yöntemi. Örneğin, rAAVrh10 nöronlar ve ne zaman intratekal enjeksiyon4,7tarafından teslim glia transduced ise ağırlıklı olarak sistemik damar içi enjeksiyon (IV), tarafından teslim astrocytes transduce gösterilmiştir. İntraventriküler aracılığıyla beyin-omurilik sıvısı (BOS) içine enjeksiyon veya intratekal enjeksiyon yaygın CNS iletim8 sonuçlandı, ancak buna ek olarak, parankimi enjeksiyon enjeksiyon yeri çevresinde için yerel iletim sonuçlandı . Çalışmalar de AAV teslim gen tedavisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi edici etki gücü tarafından Yönetim9,10,11göstermiştir. CNS ALS gibi geniş alanlarda etkileyen hastalıklarda intratekal enjeksiyon bos içine bir sistemik teslim Yöntem4,10' a kıyasla daha düşük bir dozda hastalıkla tarafından tutulmuş çoğu alanları kapsayacak şekilde gösterilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu lomber ponksiyon laminektomi ve intratekal kateterizasyon4ile ilişkili olası yaralanmaları önler ALS için fare modellerinde AAV enjekte için kullanılan göstermiştir.
Deneysel doğrudan lumbar ponksiyon ilk ajanlar, özellikle anestezi, spinal kord analjezi ve anestezi 188512,13için teslim etmek için kullanılmıştır. Bu raporda, lomber ponksiyon BT enjeksiyon yöntemi %1 lidokain hidroklorür, bir yerel Amid kaynaklı anestezi, değerlendirmek ve enjeksiyon kalite izlemek için enjeksiyon çözümde yardımı ile yetişkin farelerde göstermektedir. Başarısız olan iğneleri bu davranışı belli etmedi, ancak başarılı enjeksiyonları lidokain kaynaklı geçici felç tarafından işaretlenen. Enjeksiyon verimliliği tahmin yardımcı olmak için beş sınıflarda biri olarak geçici zayıflık düzeyini gizli. Son olarak, biz rAAVrh10 iletim düzeyi felç sınıf tarafından tahmin edilebilir gösterir. Bu nedenle, bu kulaklıklar AAV teslim yöntemi AAV aracılı gen-teslimat için deneysel tedavi CNS hastalıkları geliştirmek için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:832px;" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">FVB/NJ mice</td>
			<td style="width:219px;">Charles River Laboratories China</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Lidocaine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>73-78-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">AAV</td>
			<td style="width:417px;">Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">25&#181;L&#160; Hamilton syringe/27-30g needle</td>
			<td>GASTIGHT</td>
			<td>1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">O.C.T compond</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">H 2O 2</td>
			<td>SHUI HUAN PAI</td>
			<td>170401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Goat serum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Triton X-100</td>
			<td>LIFE SCIENCES</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Life tech</td>
			<td>G10362</td>
			<td>1:333 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">The second antibody (goat-anti rabbit)</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-005-144</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">VECTASTAIN ABC REAGENT</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectorshield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaCl</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Yong Da Chemical</td>
			<td>307699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>17083</td>
			<td>25*75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td>
			<td>Electro Microscopy Siences</td>
			<td>72236-60</td>
			<td>24*60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">15 ml Centrifuge tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">96 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">24 well cell culture cluster</td>
			<td>Coster</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% Ethanol</td>
			<td>WEN ZHI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Gauze</td>
			<td>Wei AN</td>
			<td>05171112</td>
			<td>8cm*10cm*12cm</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1mL syringe</td>
			<td>Hong Da</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Microtubes</td>
			<td>Plasmed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Micropipet&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Peppet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centirifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Regerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-539WT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Filter</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>R4PA42342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Pump</td>
			<td style="width:219px;">LongerPump</td>
			<td style="width:199px;">BT-100-2J/YZ1515X</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:284px;">Freezing-microtome</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:199px;">CM1520</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice

İntratekal (BT) enjeksiyon adeno ilişkili virüs (AAV) içinde CNS CNS gen terapisi Emanet, noninvasiveness ve mükemmel iletim etkinliği sayesinde önemli ilgi çekmiş olmalı. Önceki çalışmalarda AAV teslim gen terapisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi potens tarafından yönetim gösterdi. Ancak, öngörülemeyen hatası BT yönetim küçük hayvanlarda teknik sınırlandırılması nedeniyle yüksek oranlarda bildirilmiştir. Burada, %1 lidokain hidroklorür enjeksiyonu çözüm içine ekleyerek lumbar ponksiyon küçük hayvanlarda başarı kapsamını belirtmek için bir skorlama sistemi kurduk. Biz daha fazla geçici zayıflık enjeksiyon takip ölçüde AAV iletim verimliliği tahmin edebilirsiniz göstereceğim. Böylece, BT ekleme Buyöntem fare modelleri MSS geniş bölgelerinde eziyet CNS hastalıkları tedavi edici çalışmalarda en iyi duruma getirmek için kullanılabilir.

Fareler farklı derecelerde geçici zayıflık değil peşini enjeksiyon AAV çözüm %1 lidokain hidroklorür nedeniyle çeşitli intratekal enjeksiyon kalitesini gösterdi. Biz kurduk yarı kantitatif 5 dereceli Puanlama sistemine göre AAV iletim şekillerinin farelerde lidokain kaynaklı uzuv zayıflık farklı derecelerde ile test ettik (0, n puan edinildi = 2; 1, n puan edinildi = 1; 4, n puan edinildi = 4; puan edinildi 5, n = 3). EGFP immunostaining spinal iplerden gösterdi ya hi...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice at JoVE.com

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Burada %1 lidokain hidroklorür viral bir çözümde küçük hayvanlar için verimli adeno ilişkili virüs teslim edilmesini sağlamak ve iletim verimliliği merkezi tahmin etmek için bir skorlama sistemi kurmak için bir doğrudan intratekal enjeksiyon tekniği mevcut sinir sistemi geçici zayıflık lidokain tarafından indüklenen derecesine göre.

Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Bu yöntem, ALS gibi merkezi sinir sistemi hastalıklarının deneysel tedavisi için uyanık küçük hayvanlarda adeno-ilişkili viral transgenlerin etkin intratekal teslimini kolaylaştırır. Bu yöntemin en büyük avantajı viral çözelti başarılı bir enjeksiyon dan sonra geçici bir felç neden olur% 1 lidokain hidroklorür içerir olmasıdır. Bu yöntem intratekal otomatik durumun başarısını değerlendirmek için görsel bir gösterge sağlasa da, teslimatın başarı oranını artırmak için yeterli uygulama şarttır.İşleme başlamadan önce, 25 mikrolitrelik Hamilton şırıngasına 27 kalibrelik bir iğne takın ve iğnenin yontucuucunu şırıngadaki hacimsel ölçekle hizala. Daha sonra, virüs çözeltisinin 10.genom kopyalarını şırıngaya dikkatlice yükleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen din. Sonra, bir biyogüvenlik başlık eğilimli pozisyonda bir yatak parçası üzerinde bir uyanık 30 ila 70 günlük 12-30 gram fare yerleştirin ve fare sakin ve ısırılmadan kaçınmak için steril gazlı bez ile üst vücut kapağı.Sıkıca bir tarafta başparmak ve diğer tarafta işaret parmağı ve orta parmak bir başparmak ve işaret parmağı ile ikili pelvik korseler arasında cilt tutmak ile pelvik korse üzerinde fare kavrama. Sonra ikili pelvik korseler arasında kürk tıraş ve bir iyot bazlı scrub ve% 70 etanol ile maruz kalan cilt sterilize. Adeno ile ilişkili virüs çözeltisinin doğrudan intratekal iletimi için, bilateral pelvik korseler arasındaki orta hat boyunca intervertebral uzayı palpate ve L5-L6 intervertebral uzayı göstermek için cilde bir girintiyi bastırmak için bir tırnak kullanın.Omurganın orta çizgisini ortaya çıkarmak ve iğnenin eğimini hayvanın kafasına doğru ayarlamak için kuyruk tabanını hafifçe ve hafifçe döndürün. Fare sıkıca konumlandırılırken, iğneyi omurganın orta hattı boyunca hizalayın ve iğneyi girintinin merkezine yavaşça ve dikey olarak yerleştirin ve şırıngayı merkezi bir sagittal düzlemde tutarak yerleştirin. İğne kemikle temas ettiğinde, açıyı yavaşça yaklaşık 30 dereceye düşürün ve iğneyi omurgasız uzaya kaydırın.Ani bir kuyruk hareketi intradural alana başarılı bir girişin işaretidir. İğne intervertebral uzaya girdiğinde, ucu sıkıca kenetlenmiş hissedeceksiniz. Vektör çözeltisini enjekte edin ve iğneyi intradural boşlukta bir dakika koruyun.Daha sonra sızıntıyı en aza indirmek için yavaşça dönme ile iğneyi geri çekin. Enjeksiyon kalitesini değerlendirmek için fare uzuvlarının geçici zayıflığını hemen skorlayın ve felcinden kurtulması için fareyi kafesine geri döndürün. Uygun deneysel bitiş noktasında, bir köpük kutusu kapağı üzerinde eğilimli pozisyonda ekstremite ve enjekte farenin başını düzeltmek ve şerit ve sakrum için baş deri kaldırmak için makas kullanın.Kafatasını gözler inara, kafatasının orta çizgisi boyunca ve beyincik üzerindeki yatay çizgiyi kesve kafatasını her iki tarafta da açın. Oksipital kemik kaldırmak ve bilateral spinal kanal açmak için oftalmik makas kullanmak için cımbız kullanın. Her iki tarafta kaburga kesin ve dikkatle omurüst kısmını çıkarın.Beyni kaldırmak ve kafatası tabanının sinirlerini kesmek için kavisli cımbız kullanın. Sonra dikkatle tüm beyin ve omurilik ayıklayın ve 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit dokuları düzeltmek. Fiksasyon döneminin sonunda, 4 santigrat derecede bir gecede %30 sakaroz çözeltisinde beyni ve servikal ve lomber omuriliği kriyoprotectt ve ardından sıvı nitrojende ani donma işleminden önce optimum kesme sıcaklığı bileşime katıştırma sağlar.Daha sonra her dokunun 25 mikrometre kalınlığında kesitleri elde etmek için bir kriyostat kullanın, onlar elde edilir gibi 0.01 molar PBS dondurulmuş bölümleri depolamak. Dokuların immünohistokimyasal analizi için, 10 dakika boyunca %1 hidrojen peroksit ile serbest yüzen bölümleri ve ardından PBS'de 10 dakikalık bir yıkama yapın. Daha sonra pbs%5 serum ve %0.3 non-iyonik deterjan içeren bloklama solüsyonundaki numuneleri 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve ardından uygun primer antikorlarla 4 santigrat derecede geceleme etiketi ni takip edin.Ertesi gün, PBS artı Tween 3 10 dakikalık yıkar ile bölümleri yıkayın ve son yıkamadan sonra 1 saat boyunca oda sıcaklığında uygun biyotinylated ikincil antikorlar ile slaytlar inkübül. Kuluçka sonunda, sadece gösterildiği gibi taze PBST bölümleri 3 kez yıkayın ve sonsuzbiotin peroksidaz kompleksi ile örnekleri kuluçka 40 dakika sonra uygun bir kromojenik ajan ile boyama. Etiketli bölümleri cam mikroskop slaytlarına monte edin ve atlı bölümler tamamen kuruduktan sonra slaytları 5 dakika boyunca susuz etanolle ıslatın.Daha sonra slaytları 10 dakika ksilene batırın ve uygun bir montaj ortamı ile kapatın. Daha sonra slaytları 100, 200 ve 400 kat büyütülmüş bir şarjlı cihazla donatılmış bir ışık mikroskobuyla görüntüleyin. servikal ve lomber omurilik kesitlerinin eGFP immünboylelemi, 0 zayıflık skoru olan farelerin lomber omuriliğinde çok az veya hiç transdüksiyon, zayıflık skoru 1 olan farelerde biraz gelişmiş transdüksiyon ve 4 veya 5 zayıflık puanı olan farelerde güçlü ve yaygın transdüksiyonu ortaya koymaktadır.Geçici ekstremite zayıflığı nın çeşitli derecelerde gösteren farelerden omurilik dokusu bölümlerinin GFP boyama yoğunluğunun ölçülmesi, virüs çözeltisi enjeksiyonundan sonra zayıflığın şiddetinin omurilik transdüksiyonunun kapsamıyla yakından ilişkili olduğunu gösterir. Beyinde, sağlam eGFP sinyalleri koku ampul tespit edilir, dorsolateral prefrontal korteks, dentate girus, ve hipokampus CA3 bölgesi, serebellar korteks, ve beyin sapının marjinal alanları, yüz çekirdeği de dahil olmak üzere, koroid pleksus, ve ependymal epitel hücreleri. Ön boynuzlarda motor nöronlar da güçlü omurilik farklı düzeylerde transdükelenir.Ayrıca, kortekste, piramidal hücreler de dahil olmak üzere GFP pozitif nöronlar yanı sıra mikroglia, astrositler ve oligodendrocytes dahil olmak üzere çeşitli glial hücre tipleri tespit edilir. Bu teknik, nöroloji alanındaki araştırmacıların küçük uyanık hayvanlarda doğrudan intratekal doğumun merkezi sinir sistemi hastalıkları üzerindeki terapötik etkilerini keşfetmelerini sağlar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Farelerde Transkraniyal doğru akım stimülasyon (tDCS)

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subaraknoid Kanama Modeli olarak Cisterna Magna içine Kan Çift Doğrudan Enjeksiyon

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Farelerde Cofilin Hedef Alan Adeno İlişkili Bir Virüs Kullanılarak Manipüle Edilen Serebral Korteks Alanlarının Elektrokortikografik Kaydı

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Intracerebroventricular Injection in Mice

Intracerebroventricular Injection in Mice (Video) | JoVE 

Farelerde İntraserebroventriküler Enjeksiyon

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Author Spotlight: Intrathecal Injection &#8211; An Efficient and Reliable Delivery Method to Test the Efficacy of Gene Editing in Neonatal Mouse Brains

Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...