Name: a new straightforward method for lipophilicity (logp) measurement using 19f nmr spectroscopy
Uploaded: 2019-01-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Straightforward Method for Lipophilicity logP Measurement using 19F NMR Spectroscopy at JoVE.com

Esta pesquisa é financiada como parte do EPSRC concede EP/K016938/1 e EP/P019943/1 (ZW, HRF) e de um prêmio de conversão caso EPSRC/AstraZeneca (BFJ). Universidade de Southampton é agradeceu apoio adicional. O EPSRC é agradeceu ainda mais para uma concessão de capacidade de núcleo EP/K039466/1.

1. particionamento
<ol><li>Adicionar 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composto X, ca. 6,0 mg) e 2, 2,2-trifluoroethanol (referência composto, ca. 3,0 mg) para um balão em forma de pera com 10 mL, dissolver em n- octanol (grau HPLC, ca. 2 mL) e adicionar água (grau HPLC, ca. 2 mL). Nota: Este experimento é executado em triplicado. Composto solubilidade em água e n- octanol deve ser verificada. A quantidade do composto usado para partição deve ser considerada com cuidado para evitar supersaturação...

<ol>
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O protocolo descrito no documento é um método simples para logP medição de compostos fluorados. Este método é aplicável a compostos fluorados com um logP valor de -3 a 3. Para obter mais hidrófila (logP < -3) ou compostos lipofílicos (logP > 3), este método pode ainda ser usado, mas vai exigir muito mais tempo de experiência NMR como número alargado de transientes é necessárias para obter uma boa relação sinal-ruído. Portanto, esta é uma limitação do método. Não h...

Lipofilicidade é um parâmetro chave e físico-químico das moléculas de drogas que influencia as propriedades de candidatos da droga em muitos aspectos, incluindo a solubilidade da droga, biodisponibilidade e toxicidade1. Lipofilicidade é medida como o logaritmo (logP) da razão de concentrações de compostos após particionamento entre n-octanol e água. Intervalos de Lipofilicidade ideal têm sido propostos com base em dados estatísticos de medicamentos administrados por via oral, de que a regra de Lipinski"de 5 ' é o mais famoso exemplo2,3. Com efeito, controlar Lipofilicidade mostrou para ser essencial para melhorar a perspectiva de candidatos da droga. Aumentando a afinidade de ligação da droga pela elevada Lipofilicidade foi identificado como um dos principais problemas em projetos de descoberta de drogas durante as últimas décadas, levando ao aumento do atrito taxas3. Portanto, sugeriu-se que o desenvolvimento de drogas bem sucedida é associado com manter a lipofilicidade molecular dos candidatos dentro dos limites ideais droga durante o processo de otimização do afinidade3,4. A esse respeito, novos conceitos (tais como índices de eficiência lipofílicos) foram introduzidos5,6.
Assim, é de grande importância para medir com precisão a lipofilicidade durante o processo de desenvolvimento de drogas. Além disso, a disponibilidade de métodos simples para medição Lipofilicidade está na demanda como investigação fundamental visa identificar soluções para logP modulação. Actualmente, numerosos métodos estabelecidos são acessíveis para Lipofilicidade determinação1. O método de 'agitar-aferido (SF)'7e suas variações são comumente empregadas para medir valores logP diretamente, o que, na maioria dos casos, dependem de espectroscopia UV-Vis para quantificação. A principal desvantagem deste método clássico de SF é a sua natureza de trabalho intensiva. Além disso, pode ocorrer a formação de emulsões, especialmente para compostos altamente lipofílicos8,9. Vários métodos foram desenvolvidos para contornar esses problemas, tais como utilizando análise de injeção de fluxo, tubulação da diálise, etc. 9,10. No entanto, nenhum desses métodos são simples ou facilmente aplicável em laboratórios não especializados.
Existem também muitos métodos indiretos disponíveis para uso, tais como titulação potenciométrica11métodos eletroforética12,13, métodos cromatográficos baseados em RP-HPLC, métodos baseados em massa-espectrometria de14, etc. Estes são os métodos indiretos, como os valores de logP são obtidos por curvas de calibração. Entre esses métodos, o método de RP-HPLC foi amplamente utilizado porque é fácil de usar e economia de tempo. No entanto, sua precisão depende do conjunto de treinamento usado para estabelecer a curva de calibração, e a lipofilicidade estimada depende a partição sistema utilizado13,15.
Há um número de métodos baseados em H NMR de 1relatados na literatura para determinação de Lipofilicidade. Et al . mo desenvolveu um método para a medição de logP usando 1H NMR sem solventes deuterados. Água e octanol, como solventes de partição, foram utilizados como referências para a quantificação da concentração de soluto em cada fase16. Heath e colegas de trabalho também relataram uma abordagem, por que o experimento de partição ocorreu diretamente num tubo NMR, onde os dados NMR da camada aquosa inferior D2O foram coletados antes e após a extração com o 1-octanol, para obter a distribuição coeficiente de17. Além disso, Soulsby et al explorados 1H NMR como uma ferramenta de análise, determinar a amplitude dos sinais por meio de redução completa ao software de tabela de frequência de amplitude. A relação entre as amplitudes em ambas as camadas que levou para o coeficiente de partição medido18. Estes métodos são relativamente simples de usar, mas muitas vezes requerem a calibração de pulsos seletivos e os níveis de energia ou o uso de em forma de pulsos de gradientes para garantir a supressão de solvente apropriado e seletividade do sinal.
Valores deP (Pde tamanco) log calculado para compostos também podem ser obtidos. Estão disponíveis vários métodos de cálculo e software comercialmente disponível. Tais valores de tamancoP são comumente usados na indústria farmacêutica, ao avaliar um grande número de moléculas de drogas. No entanto, grandes erros de entupirP valores não são incomuns19,20.
Os requisitos de UV-atividade para análise da concentração e o estabelecimento de curvas de calibração para cálculo de logP impedem o progresso de pesquisa neste campo. Em particular, este é o caso dos compostos alifáticos não-UV-ativas. Fluorados alifáticos metades tornaram-se cada vez mais atraentes para o design de drogas nos últimos anos, e sua influência na Lipofilicidade total do composto é um tópico de pesquisa em nosso grupo21. Além disso, 19F é um núcleo ativo de NMR altamente sensível, fazendo 19F NMR uma ferramenta útil para a análise de compostos fluorados. Ele também tem uma gama maior de shift química comparada com a de 1H. Portanto, vale a pena desenvolver um método simples para logP determinação de compostos fluorados UV-inativos por espectroscopia de RMN de F 19. Portanto, o objetivo geral deste método é conseguir a determinação Lipofilicidade conveniente de compostos fluorados.
O princípio-chave da nossa 19método baseado em F NMR é adicionar uma referência de fluorados composta na partição experimento (Figura 1)21. Compostos X e composto de referência (ref) são divididos entre água e n- octanol. Após desenroscada, uma alíquota de cada fase é levada em um tubo de NMR e 19F NMR experimentos são executados em ambas as amostras de NMR. A intensidade dos picos do flúor é proporcional aos compostos concentração (C) e o número de átomos de flúor (n) dos compostos. Entre compostos X e ref, rácios integrais podem ser obtidos por ambas as fases. A relação em n- octanol camada é definida como ρocte ρaq para a camada de água (EQ. 1). A relação dos valores ρ é igual a proporção dos coeficientes de partição (P) dos compostos X e ref (EQ. 2). Isto conduz à equação final (EQ. 4) para logP medição do composto X. Portanto, a fim de determinar o valor deP de um desconhecido X composto, rácios de integração somente (ρoct e ρaq) de log em ambas as camadas são necessárias para ser medido por 19F NMR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SEF probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>AVIIIHD400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SMART probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DrySyn Snowstorm reactor</td>
			<td>Asynt</td>
			<td>ADS13-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recirculating chiller</td>
			<td>Asynt</td>
			<td>n/a</td>
			<td>model:Grant-LTC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirplate</td>
			<td>Asynt</td>
			<td>ADS-HP-NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD/NMR processor software</td>
			<td>ACD/Labs</td>
			<td>n/a</td>
			<td>ACD/NMR processor academic edition or ACD/Spectrus processor 2015</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new straightforward method for lipophilicity (logp) measurement using 19f nmr spectroscopy

Fluoração tornou-se uma ferramenta eficaz para otimizar as propriedades físico-químicas de compostos bioativos. Uma das aplicações da introdução de flúor é de modular a lipofilicidade do composto. No nosso grupo, estamos interessados no estudo do impacto da fluoração na Lipofilicidade da fluorohydrins alifáticos e fluorados hidratos de carbono. Estes não são UV-ativo, resultando em uma determinação de Lipofilicidade desafiador. Aqui, apresentamos um método simples para a medição da Lipofilicidade de compostos fluorados por espectroscopia de RMN de F 19. Este método não requer nenhuma atividade-UV. Massa exata de soluto, solvente e alíquota volume também não são obrigados a ser medido. Usando esse método, Nós medimos as lipophilicities de um grande número de alkanols de gases fluorados e hidratos de carbono.

Dois conjuntos de dados, como controle de experimentos são mostrados na Figura 2,21. Usando 2, 2,2-trifluoroethanol como composto de referência, valores logP foram obtidos por 2-fluoroethanol e 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol-0,75 e +1.20, respectivamente (Figura 2A). Posteriormente, a lipofilicidade da 2-fluoroethanol determinou-se novamente, mas com 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol como a referênc...

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A New Straightforward Method for Lipophilicity logP Measurement using 19F NMR Spectroscopy

Um romance e uma variação simples do método agitar-balão foi desenvolvido para a medição exata Lipofilicidade de compostos fluorados por espectroscopia de RMN de F 19.

Um novo método simples para a medição de Lipofilicidade (logP) usando 19espectroscopia RMN de F

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction ...

Desenvolvemos um método simples para a medição da lipofphilicidade de compostos frenéticos usando RMR flúor que é árido o suficiente para reproduzir medimos pequenas diferenças na lipoffilia. Este método pode ser usado para estudar sistematicamente o impacto da formação de compostos orgânicos nas mudanças de lipofífilidade resolvidas, o que é de interesse na química medicinal geral. As vantagens deste método incluem que os compostos não têm que ser reativos, e eles não têm que ser completamente puros.Não há necessidade de medir a massa exata ou os volumes, e não há necessidade de estabelecer curvas de calibração. Deve-se escolher um composto de referência adequado e evitar a contaminação cruzada da alíquota durante a fase de amostragem. Neste vídeo, demonstraremos habilidades práticas apropriadas para amostragem, vedação de tubos NMR e uso correto de software NMR para processamento de dados.Adicione 6,0 miligramas de Composto X e 3,0 miligramas do Composto de Referência a um frasco em forma de pera de 10 mililitros. Dissolva os compostos em aproximadamente dois mililitros de n-Octanol de grau HPLC, e adicione dois mililitros de água de grau HPLC. Coloque os frascos dentro de um recipiente controlado pela temperatura acima de uma placa de mexida e conecte-se a um refrigerador recirculador.Mexa a mistura bifásica a 25 graus Celsius por duas horas, com velocidade de agitação a 600 RPM. Equilibre a mistura a 25 graus Celsius durante a noite para permitir a separação completa da fase. Fixar o frasco em uma bancada de réplica com um grampo.Pegue uma alíquota de aproximadamente 0,70 a 0,85 mililitros de ambas as camadas de água e n-Octanol usando uma seringa plástica descartável mililitro com agulhas longas. Para tomar a alíquota da água, desenhe aproximadamente 0,02 mililitros de ar na seringa antes de colocar a agulha na mistura. Ao mover a agulha através da camada n-Octanol superior para a camada de água, empurre suavemente o ar para evitar que a solução n-Octanol entre na agulha.Retire a agulha longa da mistura. Descarte uma pequena quantidade de água, deixando aproximadamente 0,6 mililitros de amostra deixados na seringa. Limpe cuidadosamente a agulha com tecido seco e injete aproximadamente 0,5 mililitros da amostra de água em um tubo NMR limpo.Feche rapidamente o tubo NMR com uma tampa. Para a amostra n-Octanol, remova a agulha longa da camada n-Octanol. Descarte uma pequena quantidade de amostra n-Octanol, deixando aproximadamente 0,6 mililitros de amostra deixadas na seringa.Depois de limpar cuidadosamente a agulha com tecido seco, injete aproximadamente 0,5 mililitros da amostra n-Octanol em um tubo NMR limpo. Feche rapidamente o tubo NMR com uma tampa. Inspecione visualmente amostras de n-Octanol e água para obter qualquer contaminação da outra fase.A cada tubo NMR, adicione 0,1 mililitros de um solvente NMR desuterado que é miscível tanto com n-Octanol quanto com água, para permitir o bloqueio de sinal durante a aquisição de NMR. Para compostos com baixos pontos de ebulição, sele os tubos NMR usando um maçarico e, após o resfriamento, inverta o tubo para verificar se há vazamentos. Inverta cuidadosamente os tubos NMR selados ou não selados 20 vezes para obter uma solução homogênea para experimentos de RMR F19.Execute experimentos de RMR de flúor dissociados de prótons para identificar mudanças químicas do Composto X e do Composto de Referência em amostras de N-Octanol e NMR de água. Use as configurações padrão do parâmetro NMR conforme listado no protocolo de texto. Meça o tempo de relaxamento de rede de spin, ou T1, para núcleos de flúor diagnóstico usando uma sequência de recuperação de inversão.Avalie o nível de tempo de atraso de pulso adequado dos valores T1 obtidos para uma integração quantitativa precisa de RMR. Execute um espectro F19 H1 rápido para configurar os parâmetros iniciais. Meça a largura de pulso de 90 graus e, em seguida, defina o parâmetro para o experimento de medição T1 e execute o experimento de medição T1 usando uma sequência de recuperação de inversão.Execute experimentos de RMR de flúor dissociados novamente com configurações de parâmetros ajustados. Defina D1 e centralizar o ponto de deslocamento de frequência entre os dois sinais de flúor diagnóstico para que ambos os núcleos possam ser igualmente animados. Além disso, defina a largura espectral como 300 PPM, e defina o número de transitórios para 64.Ajuste esses valores se for necessária uma maior relação sinal-ruído. Processe os dados obtidos usando o ACD NMR Processor Academic Edition ou outro software de processamento NMR personalizado. Abra o arquivo de dados NMR.Em seguida, abra a pasta pdata, seguida pela pasta 1. Exclua o arquivo 1r. Retorne ao arquivo de dados NMR e arraste o arquivo FID para a janela do processador ACD NMR.Clique no botão de função da janela, selecione exponencial, defina o valor de ampliação da linha como dois e clique no botão ok. Agora, clique no botão de preenchimento zero, aumente a contagem de pontos para quatro vezes da contagem de pontos original clicando em um pequeno botão ao lado do número e clique no botão ok. Selecione o botão de transformar fourier.Em seguida, clique no botão de fase e clique no botão de eliminação do mouse. Clique e segure o botão esquerdo do mouse e prossiga para mover o mouse para frente ou para trás até que o pico principal do espectro seja devidamente gradual. Agora, clique e segure o botão direito do mouse e mova o mouse para frente ou para trás até que os outros picos do espectro sejam devidamente gradualmente.Em seguida, desbocote o botão de esfinge do mouse e amplie na área espectral com os picos de flúor. Clique em ajuste fino, execute a correção de fase, se necessário, conforme descrito anteriormente e clique no botão tick. Clique no botão da linha de base e, em seguida, no botão opções.Selecione a média de espectro para modelos automáticos, ajuste o número de pontos para meia largura da caixa, se necessário. Clique bem, auto e clique no botão tick. Em seguida, clique em integração, integre os picos de flúor diagnóstico e clique no botão tick.Finalmente, obtenha as razões de integração das amostras N-Octanol e NMR de água e use-as na equação de cálculo logP para obter o valor logP do composto X.Usando 2, 2, 2-Trifluoroetanol como Composto de Referência, um valor logP de 0,75 foi obtido para dois fluoroetanol, e um valor logP de 1,20 positivo foi encontrado para 3, 3, 3, 2, 2-pentafluoropropanol. Posteriormente, a lipofilia de dois fluoroetanol foi determinada novamente, mas com 3, 3, 3, 2, 2-pentafluoropropanol como referência. O valor de logP medido foi de 0,76, que só teve diferença de 0,01 unidades logP quando comparado com o valor medido utilizando 2-2-2-trifluoroetanol como referência.Da mesma forma, para cis-2, 3-difluro-1, 4-butano-diol, a diferença nos valores de logP medidos usando dois fluoroetanol e seu trans-isômero são muito pequenos. Isso demonstra boa reprodutibilidade, e que a seleção do Composto de Referência não tem impacto na medição do logP. Exemplos selecionados adicionais são mostrados aqui.Todos esses compostos a fafáticos ativos não UV, desde carboidratos fluorados, até fluorohidrinas, podem ser facilmente medidos com este método. Outros métodos baseados em NMR podem ser usados se o composto não contiver flúor, e se o composto contiver Cromofor UV, então a medição do logP pode ser realizada usando quantificação UV. A lipoficidade de uma ampla gama de fluorohidrinas ativas não UV e carboidratos desoxifluoados foi medida.A biblioteca de dados obtida foi utilizada para estabelecer tendências e regras para o impacto da fluoretação alifática na lipofoficidade. Octanol e água representam riscos mínimos de segurança. É claro que os perigos que são medidos e o Composto de Referência devem ser sempre levados em consideração.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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