Name: crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella at JoVE.com

Le financement de cette recherche a été fournie par : National Key Research et Development Programme of China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), Nature Science Fondation nationale de Chine (31320103922, 31230061) et projet de recherche fondamentale National (973) programme de Chine (2015CB856500, 2015CB856504). Nous sommes reconnaissants envers le personnel sur la ligne de faisceau BL17U1 à Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).

1. clonage de gènes, Expression de la protéine et de Purification
<ol><li>PCR amplification ADN correspondant à la protéine d’intérêt (résidus 1-205 de DBM RyR, Genbank ACC. no. AFW97408) et le clone en pET-28 a-HMT vecteur de clonage de ligature indépendante (LIC)25. Ce vecteur contient une étiquette histidine, tag MBP et un site de clivage de protéase TEV à l’extrémité N-terminale15.
	<ol>
<li>Concevoir des amorces LIC pour l’amplific...

<ol>
	<li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels.">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li><li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor/calcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li><li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. 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A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors:+Insights+into+Disease+Mutations.">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li><li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites.">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li><li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor.">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li></ol>

Dans cet article, nous décrivons la procédure pour l’inoculation express, purifier, cristalliser et déterminer la structure de DBM RyR NTD. De cristallisation, une condition essentielle est d’obtenir des protéines avec l’homogénéité, la pureté et la solubilité élevée. Dans notre protocole, nous avons choisi d’utiliser TEP-28 a-HMT vecteur car il contient une protéine balise et la balise MBP, qui pourraient être utilisés pour la purification obtenir une pureté supérieure de pli. En outre, le MBP ta...

Récepteurs de la ryanodine (RyRs) sont des canaux ioniques spécifiques qui négocient la pénétration des ions Ca2 + à travers les membranes du réticulum sarcoplasmique (RS) dans les cellules musculaires. Par conséquent, ils jouent un rôle important dans l’excitation contraction processus de couplage. Dans sa forme fonctionnelle, RyR assemble comme un homo-tétramère ayant une masse moléculaire de > 2 MDa, avec chaque sous-unité comportant des résidus d’acides aminés ~ 5000. Chez les mammifères, il existe trois isoformes : RyR1 - type de muscle squelettique, le muscle cardiaque type de RyR2 - et RyR3-ubiquitaire exprimés dans différents tissus1.
Chez les insectes, il y a qu’un seul type de RyR, qui s’exprime dans le tissu musculaire et nerveuse2. RyR insecte est plus proche de mammifères RyR2 avec une identité de séquence d’environ 47 %3. Diamide insecticides ciblant RyR de lépidoptères et coléoptères ont été développés et commercialisés par grandes entreprises telles que Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) et Syngenta (cyantraniliprole). Depuis sa création relativement récente, diamide insecticides sont devenus un de la classe plus forte croissance d’insecticides. Actuellement, les ventes de ces trois insecticides par an ont franchi les 2 milliards de dollars avec un taux de croissance de plus de 50 % depuis 2009 (Agranova).
Des études récentes ont signalé l’apparition d’une résistance chez les insectes après quelques générations d’utilisation de ces insecticides4,5,6,7,8. Les mutations de résistance dans le domaine transmembranaire de RyRs de la teigne des crucifères (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) et aux emplacements correspondants à la mineuse de la tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) montrent que la région pourraient être impliqués dans la liaison de diamide insecticides comme cette région est connue pour être critique pour le processus de blocage du canal4,8,9. Malgré des recherches approfondies dans ce domaine, les mécanismes moléculaires exacts de diamide insecticides demeurent insaisissables. En outre, on ignore si les mutations de résistance influent sur les interactions avec les diamides directement ou de façon allostérique.
Des études antérieures ont révélé la structure de plusieurs domaines de RyR d’espèces de mammifères et la structure de RyR1 mammifères pleine longueur et RyR2 par cristallographie aux rayons x et microscopie de cryo-électronique, respectivement10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Mais jusqu’ici, aucune structure d’insecte RyR n’a été signalée, qui nous interdit de saisir la complexité moléculaire de la fonction des récepteurs ainsi que les mécanismes moléculaires d’action insecticide et le développement de la résistance aux insecticides.
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole généralisé pour la caractérisation du domaine β-trefoil N-terminale du récepteur à la ryanodine de la teigne des crucifères, un ravageur qui infectent les crucifères cultivées dans le monde entier22. La construction a été conçue selon le lapin publiées RyR1 NTD crystal structures23,24et la cryo-EM modèles structuraux16,17,18,19, 20 , 21. il s’agit de la première structure à haute résolution pour insecte RyR, qui révèle le mécanisme de blocage du canal et fournit un modèle important pour le développement des insecticides spécifiques à l’aide de conception de médicaments basée sur la structure. Pour l’élucidation de la structure, nous avons utilisé la cristallographie aux rayons x, qui est considérée comme le « gold standard » pour la détermination de structure de protéine à près de résolution atomique. Bien que le processus de cristallisation est imprévisible et demande beaucoup de travail, le présent protocole étape par étape aidera les chercheurs à exprimer, de purifier et de caractériser les autres domaines d’insecte RyR ou tout autres protéines en général.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pET-28a-HMT vector</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:941px;">This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli BL21 (DE3) strain</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td>69450-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrapHP column (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylose resin column</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:129px;">E8021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q Sepharose high-performance column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon concentrators (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex 200 26/600 gel-filtration column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automated liquid handling robotic system&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:129px;">Gryphon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>82050-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR4-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puck dewar loading tool</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nano drop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal incubator</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD5-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-Ray diffractor</td>
			<td style="width:164px;">Rigaku</td>
			<td style="width:129px;">FRX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR machine</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">Nexus GX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid mini-prep kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SspI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:164px;">NEB</td>
			<td style="width:129px;">R0132S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">2868713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:164px;">Scientific Chemical</td>
			<td align="right" style="width:129px;">25389940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">367931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">7365459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">60242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">Sorvall LYNX 6000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonnicator</td>
			<td style="width:164px;">Scientz</td>
			<td style="width:129px;">II-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protein purification system</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">Akta Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;">Nikon</td>
			<td style="width:129px;">SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IzIt crystal dye</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td>HR4-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrophoresis unit</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">1658005EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker Incubator</td>
			<td style="width:164px;">Zhicheng</td>
			<td style="width:129px;">ZWYR-D2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Index crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Structure crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProPlex crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PACT premier crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JCSG-plus crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella

Développement des insecticides puissants et efficaces ciblant les récepteurs de la ryanodine insectes (RyRs) a été d’un grand intérêt dans le domaine de la lutte contre les parasites agricoles. A ce jour, plusieurs diamide insecticides ciblant les ravageurs que ryrs ont été commercialisés, qui génèrent un revenu annuel de 2 milliards de dollars US. Mais la compréhension du mode d’action des insecticides RyR ciblage est limitée par le manque d’informations structurelles concernant les insectes RyR. Ceci limite à leur tour comprendre le développement de la résistance aux insecticides de ravageurs. La teigne des crucifères (DBM) est un ravageur dévastatrice, détruisant les crucifères cultivées dans le monde entier, qui a également été signalé à montrer aux diamide insecticides. Par conséquent, il est d’une grande importance pratique pour développer de nouveaux insecticides ciblant le RyR DBM, ciblant plus particulièrement une région différente de l’accepteur diamide traditionnels. Nous présentons ici un protocole afin de caractériser structurellement le domaine N-terminal de RyR de DBM. La structure cristalline a été résolue par le remplacement moléculaire à une résolution de 2,84 Å, qui montre un motif de bêta-trefoil pliable et une accompagnement hélice alpha. Ce protocole peut être adapté pour l’expression, de purification et de caractérisation structurale des autres domaines ou des protéines en général.

Purification
Le domaine N-terminal de DBM RyR a été exprimé d’une protéine de fusion avec une balise de protéine, une balise MBP et un site de clivage de protéase TEV. Nous avons suivi une stratégie en cinq étapes de purification pour obtenir une protéine très pure, appropriée pour usage de cristallisation. Dans un premier temps, la protéine de fusion a été purifiée de la fraction soluble du lysat cellulaire par co...

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Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Dans cet article, nous décrivons les protocoles de détermination d’expression, purification, la cristallisation et la structure de la protéine du domaine N-terminal du récepteur à la ryanodine de teigne des crucifères (Plutella xylostella).

Structure cristalline du domaine N-terminal du récepteur à la Ryanodine de Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

La résolution de la structure du domaine récepteur de la ryanodine peut aider à notre compréhension du mécanisme moléculaire de la fonction protéique, de l’action insecticide et du développement de la résistance aux insecticides. Cette mesure implique l’utilisation de la cristallographie aux rayons X pour l’illustration de la structure, qui est considérée comme un étalon-or pour la détermination de la structure protéique à résolution quasi atomique. Cette structure à haute résolution du domaine des récepteurs de la ryanodine des insectes révèle le mécanisme de l’accouplement des canaux et fournit un modèle important pour le développement d’insecticides spécifiques aux espèces à l’aide d’approches de conception de médicaments basées sur la structure.En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal, parce que les cristallographes protéiques potentiels doivent être compétents en biochimie, biophysique, informatique et mathématiques. Commencez par amplifier l’ADN correspondant à la protéine d’intérêt par réaction en chaîne de polymése. À la fin de la réaction, exécuter l’ensemble des 50 microlitres de mélange de réaction sur un gel agarose de 2%, et extraire l’ADN avec un kit d’extraction de gel selon les protocoles standard.Ensuite, linéariser l’ADN vecteur du LIC en mélangeant 20 microlitres de l’ADN vecteur avec 6 microlitres de tampon de réaction 10X et 4 microlitres d’enzyme de restriction SspI dans 30 microlitres d’eau double-distillée. Incuber ce mélange de réaction pendant trois heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, faire fonctionner l’ensemble du mélange de réaction sur un gel d’agarose de 1 %, suivi de l’extraction de l’ADN vectoriel linéarisé avec un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.Ensuite, effectuez des traitements distincts de polymélase d’ADN T4 sur 5 microlitres de l’ADN vectoriel linéarisé et de l’ADN amplifié d’insertion pcr, selon les protocoles standard. Incuber pendant 40 minutes à température ambiante, suivi de 20 minutes d’inactivation thermique enzymatique à 75 degrés Celsius. Effectuez la réaction d’annealage de clonage indépendante de ligature en combinant 2 microlitres de l’ADN d’insertion traité T4 avec 2 microlitres de l’ADN vecteur LIC traité T4 pour une incubation de 10 minutes à température ambiante.Pour transformer les cellules BL21(DE3)E. Coli avec le plasmide recombinant, décongelez 50 microlitres de cellules compétentes sur la glace et ajoutez environ 1 microlitre du plasmide annelé au tube. Feuilletez doucement le tube deux à trois fois pour mélanger les cellules et l’ADN, et placez le tube sur la glace pendant 20 minutes.À la fin de l’incubation, choquer les cellules à 42 degrés Celsius pendant 40 secondes, suivies de deux minutes de retour sur la glace. Ensuite, ajoutez un millilitre de LB à température ambiante au tube et placez les cellules sur un shaker de 250 RPM pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation secouant, plaque 150 à 200 microlitres de ce mélange sur les plaques de sélection, et inverser les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, la culture d’une seule colonie en 100 millilitres de milieu 2-YT, complétée par la kanamycine, dans un incubateur shaker à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, inoculer un litre de 2-YT moyen, complété par la kanamycine, avec 10 millilitres de culture de nuit, et incuber à 37 degrés Celsius avec secouant jusqu’à ce que la lecture OD600 atteint environ 0,6. Ensuite, induire la culture avec IPTG à une concentration finale de 0,4 millimolaire, et faire croître les cellules pendant cinq heures à 30 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, récolter les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille à 10 grammes de bactéries par 40 millilitres de concentration tampon de lyse. Perturber les parois cellulaires par sonication à une amplitude de 65%, et une seconde sur une seconde, pendant huit minutes. Enlever les débris cellulaires par centrifugation.Ensuite, filtrer le supernatant par un filtre de 22 micromètres, et charger la solution dans une boucle d’échantillon. Pour purifier la protéine de fusion, injectez le supernatant filtré de la boucle de l’échantillon dans une colonne nickel-nitrolotriacetic de cinq millilitres sur un système de purification avec un gradient linéaire de 20 à 250 millimolar imidazole. Fendre la protéine cible élitisée avec la protéase du virus de l’etch du tabac, à un rapport de 1 à 50, pendant la nuit à 4 degrés Celsius, et purifier le mélange de réaction de clivage sur une colonne de résine d’amylose, et une colonne nickel-nitrolotriacétique, pour enlever l’étiquette et la protéase du virus de l’etch du tabac.Dialyz le flux de la colonne nickel-nitrolotriacetic contre le tampon de dialyse pour réduire la concentration de sel, et purifiez l’échantillon sur une colonne d’échange d’anion par un gradient linéaire de chlorure de potassium de 20 à 500 millimillires dans le tampon d’élitution. Ensuite, concentrez la protéine dans un concentrateur centrifuge. Injectez la protéine concentrée dans une colonne de filtration de gel Superdex 200 26/600 pour vérifier l’homogénéité et évaluer la pureté de la protéine de 15 %SDS-PAGE.Pour préparer la protéine à la cristallisation, concentrez l’échantillon de protéines purifiées à 10 milligrammes par millilitre dans le concentrateur centrifuge, et échangez tampon au tampon de cristallisation avant le stockage de 80 degrés Celsius. Pour effectuer le criblage de cristallisation, utilisez la méthode de diffusion de vapeur de chute assise à 295 Kelvin, avec plusieurs kits de cristallisation, et un système automatisé de manipulation liquide dans un format de 96 puits. À la fin du réglage de la goutte, sceller la plaque de cristallisation de 96 puits pour éviter l’évaporation et permettre l’équilibrage de la goutte de protéines dans le tampon du réservoir.Placer les plaques dans un incubateur en cristal à 18 degrés Celsius. Vérifiez périodiquement les plaques au microscope léger pour surveiller la formation et la croissance des cristaux. Pour différencier les cristaux protéiques des cristaux de sel, ajoutez un microlitre de colorant en cristal protéique à la goutte cible et observez les cristaux au microscope après une heure.Les cristaux protéiques apparaîtront bleus. Pour optimiser davantage les cristaux, utilisez les conditions de cristallisation positives et la méthode de diffusion de vapeur de goutte suspendue dans les plaques de 24 puits, suivie de l’incubation dans l’incubateur de cristal à 18 degrés Celsius. Pour déterminer la structure protéique, montez les cristaux sur un cryoloop sous un microscope léger pour le refroidissement flash dans l’azote liquide, et placez les cristaux dans un unibuck pour le stockage et le transport.Pré-filtrer les cristaux dans un diffractor de rayons X interne, en utilisant la fonction de centrage manuel pour monter et centrer les cristaux. Ensuite, utilisez le logiciel de diffraction des rayons X pour recueillir les données. Pour indexer, intégrer et mettre à l’échelle l’ensemble de données, en utilisant la suite HKL-2000, sélectionnez d’abord le détecteur et chargez l’ensemble de données.Ensuite, effectuez la fonction de recherche de pointe pour trouver les taches de diffraction. Indexer les taches, sélectionner le bon groupe d’espace et effectuer l’intégration de pointe. Ensuite, mettez à l’échelle l’ensemble de données.Ajustez à nouveau le modèle d’erreur et l’échelle. Enregistrez le fichier sca de sortie. Pour déterminer la structure à l’aide de la suite logicielle Phenix, créez un nouveau projet.Tout d’abord, exécutez Extriage avec le fichier sca pour calculer le nombre possible de molécules protéiques dans l’unité asymétrique. Ensuite, pour résoudre le problème de phase par remplacement moléculaire, exécutez Phaser, en utilisant le fichier de données de diffraction, le fichier de structure de modèle avec l’identité de haute séquence et la similitude structurelle que la protéine cible, et le fichier séquence de protéines, pour trouver la solution. Effectuez la construction automatique dans Phenix pour générer le modèle initial, en utilisant le fichier de sortie de Phaser et le fichier séquence de la protéine cible.Construire manuellement la structure dans la densité électronique expérimentale modifiée à l’aide de COOT, et affiner à l’aide de Phenix affiner dans les cycles itératifs. Valider le modèle final à l’aide des outils de validation de Phenix. Dans cette expérience représentative, la purification du domaine terminal final de la protéine récepteur de la ryanodine à dos de diamant, comme démontré, a donné une seule bande à environ 21 kilodaltons par l’analyse STS-PAGE.Le volume d’élitution de la colonne de filtration de gel a confirmé que le domaine end-terminal purifié de récepteur de ryanodine était un monomère. Pour la cristallisation, les conditions les plus optimales dans lesquelles des cristaux en forme de plaque de haute qualité ont été formés était en présence de 1 MOLAIRE HEPES d’un pH de 7, et de 1,6 sulfate d’ammonium molaire. La détermination de la structure protéique à partir de l’ensemble de données de diffraction utilisant des logiciels tels qu’ils ont été démontrés a révélé le domaine terminal final du récepteur de la ryanodine à dos de diamant couvrant les résidus 1 à 205.Les protéines atteintes de troubles importants, de régions flexibles ou ayant de faibles affinités sont difficiles à cristalliser. Dans ces scénarios, les stratégies d’ingénierie protéique telles que la réduction de l’entropie de surface, la troncature en boucle et la liaison croisée peuvent augmenter la probabilité d’obtenir de meilleurs cristaux protéiques. En plus de révéler des structures protéiques à haute résolution, la cristallographie aux rayons X peut également être utilisée pour étudier les interactions protéine-pesticide, ce qui pourrait aider à la conception de pesticides à base de structure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recherche

Biochimie

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisation des alpaga (Lama pacos) avec les antigènes protéiques et de la Production d’anticorps spécifiques de l’antigène unique

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Solution de la structure de la protéine fluorescente Cerulean à l’aide de MeshAndCollect

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