Name: crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella at JoVE.com

Finansiering av denne forskningen ble levert av: nasjonale nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), National natur Science Foundation i Kina (31320103922, 31230061) og prosjekt av nasjonal grunnforskning (973) Program Kina (2015CB856500, 2015CB856504). Vi er takknemlige for ansatte på beamline BL17U1 i Shanghai Synchrotron stråling anlegg (SSRF).

1. gen kloning, Protein uttrykk og rensing
<ol><li>PCR forsterke DNA tilsvarer protein av interesse (rester 1-205 av DBM RyR, Genbank iht. no. AFW97408) og klone i pET-28a-HMT vektor av hemorroider-uavhengig kloning (LIC)25. Denne vektoren inneholder en histidin kode, MBP tag og en TEV protease cleavage nettsted på N-terminus15.
	<ol>
<li>Design LIC primere for forsterkning av målet genet med LIC-kompatible 5 utvidelser: Videresend LIC primer: 5' ...

<ol>
	<li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels.">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li><li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor/calcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li><li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+ryanodine+receptors:+molecular+targets+for+novel+pest+control+chemicals.">Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals.</a> Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).</li><li>Steinbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+spread,+genetics+and+functional+characteristics+of+ryanodine+receptor+based+target-site+resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth,+Plutella+xylostella.">Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).</li><li>Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth,+Plutella+xylostella,+from+China.">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li><li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae).">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+(L.)+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole.">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li><li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth,+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae)+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor.">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li><li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer,+Tuta+absoluta+(Lepidoptera:+Gelechiidae).">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li><li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias.">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor.">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li><li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+mutations+in+the+ryanodine+receptor+N-terminal+region+couple+to+a+mobile+intersubunit+interface.">Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface.</a> Nature Communications. 4, 1506 (2013).</li><li>Lau, K., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+wild+type+and+disease+mutant+forms+of+the+ryanodine+receptor+SPRY2+domain.">Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain.</a> Nature Communications. 5, 5397 (2014).</li><li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors:+insights+into+disease+mutations.">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>des Georges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Gating+and+Activation+of+RyR1.">Structural Basis for Gating and Activation of RyR1.</a> Cell. 167 (1), 145-157 (2016).</li><li>Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+conformational+switch+mechanism+of+the+ryanodine+receptor.">Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+gating+mechanism+of+the+type+2+ryanodine+receptor+RyR2.">Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.</a> Science. 354 (6310), (2016).</li><li>Wei, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+Ca2+-activated+long-range+allosteric+channel+gating+of+RyR1.">Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.</a> Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).</li><li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+rabbit+ryanodine+receptor+RyR1+at+near-atomic+resolution.">Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.</a> Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).</li><li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor.">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li><li>Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamondback+moth+ecology+and+management:+problems,+progress,+and+prospects.">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li><li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors:+Insights+into+Disease+Mutations.">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography.">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li><li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HKL-3000:+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes.">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li><li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xtriage+and+Fest:+Automatic+assessment+of+X-ray+data+and+substructure+structure+factor+estimation.">Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation.</a> CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).</li><li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling,+prediction+and+analysis.">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li><li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites.">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li><li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor.">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li></ol>

I dette papiret beskriver vi fremgangsmåten for å recombinantly express, rense, utkrystallisere og bestemme strukturen i DBM RyR NTD. For krystallisering er et viktig krav å skaffe proteiner med høy løselighet, renhet og homogenitet. I vår protokollen valgte vi å bruke pET-28a-HMT vektor som inneholder en hexahistidine kode og MBP tag, begge kan utnyttes for rensing å få en høyere fold renhet. I tillegg MBP tag aids i Løseligheten av målet protein. Vi renset protein av fem sammenhengende trinn som hadde prote...

Ryanodine reseptorer (RyRs) er bestemt ionekanaler, som megle gjennomtrengning av Ca2 + ioner over sarcoplasmic retikulum (SR) membraner i muskelceller. Derfor spille de en viktig rolle i magnetisering sammentrekning kopling prosessen. I sin funksjonelle form, RyR samler som en homo-tetramer med en molekylær masse > 2 MDa, med hver delenhet bestående av ~ 5000 aminosyre rester. I pattedyr, finnes det tre isoformene: RyR1 - Skjelettmuskel type, Hjertemuskel type RyR2- og RyR3-overalt uttrykt i forskjellige vev1.
I insekter er det bare én type RyR, som er uttrykt i muskel- og nervøs vev2. Insekt RyR er mer lik pattedyr RyR2 med en sekvens identitet på ca 47%3. Diamide insektmidler målretting RyR av sommerfugler og Coleoptera er utviklet og markedsført av store selskaper som Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) og Syngenta (cyantraniliprole). Siden lanseringen relativt nylig har diamide insektmidler blitt en av de raskest voksende klassen av insektmidler. Foreløpig har salget av disse tre insektmidler årlig krysset 2 milliarder amerikanske dollar med en vekst på mer enn 50% siden 2009 (Agranova).
Nyere studier har rapportert utviklingen av motstand i insekter etter et par generasjoner av bruken av insektmidler4,5,6,7,8. Den motstand mutasjoner i transmembrane domenet av RyRs fra diamondback møll (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) og de tilsvarende stillingene i tomat leafminer, Tuta reservatet (G4903E, I4746M) viser at regionen kan være involvert i diamide insektmiddel binding som denne regionen er kjent for å være kritisk for gating av channel4,8,9. Til tross for omfattende forskning på dette området forblir nøyaktig molekylære mekanismer av diamide insektmidler unnvikende. Videre er det uklart om motstand mutasjoner påvirker interaksjonene med diamides direkte eller allosterically.
Tidligere studier har rapportert strukturen i flere RyR domener pattedyrarter og strukturen i full lengde pattedyr RyR1 og RyR2 av Røntgenkrystallografi og cryo-elektronmikroskop, henholdsvis10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Men så langt ingen struktur av insekt RyR er rapportert, som forbyr oss fra å forstå molekylær vanskelighetene med funksjonen reseptor og molekylære mekanismer insektmiddel handling og utvikling av insektmiddel motstand.
I dette manuskriptet presenterer vi en generalisert protokoll for strukturelle karakterisering av N-terminal β-trefoil domene ryanodine reseptoren fra diamondback møll, en ødeleggende pest infisere cruciferous avlinger verdensomspennende22. Konstruer ble utviklet etter publiserte kanin RyR1 NTD krystall strukturer23,24og cryo-EM strukturelle modeller16,17,18,19, 20 , 21. Dette er første høyoppløselig strukturen rapportert insekt RyR, som avslører mekanismen for kanal gating og gir en viktig mal for utviklingen av artsspesifikke insektmidler ved hjelp av strukturen-basert stoff design. For strukturen forklaring ansatt vi Røntgenkrystallografi, som regnes som "gull standard' for protein proteinstrukturer på nær Atom løsning. Selv om krystallisering prosessen er uforutsigbare og arbeidsintensiv, vil denne trinnvise protokollen hjelpe forskere til å uttrykke, rense og karakterisere andre domener av insekter RyR eller noen andre proteiner generelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pET-28a-HMT vector</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:941px;">This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli BL21 (DE3) strain</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td>69450-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrapHP column (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylose resin column</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:129px;">E8021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q Sepharose high-performance column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon concentrators (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex 200 26/600 gel-filtration column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automated liquid handling robotic system&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:129px;">Gryphon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>82050-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR4-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puck dewar loading tool</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nano drop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal incubator</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD5-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-Ray diffractor</td>
			<td style="width:164px;">Rigaku</td>
			<td style="width:129px;">FRX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR machine</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">Nexus GX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid mini-prep kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SspI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:164px;">NEB</td>
			<td style="width:129px;">R0132S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">2868713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:164px;">Scientific Chemical</td>
			<td align="right" style="width:129px;">25389940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">367931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">7365459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">60242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">Sorvall LYNX 6000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonnicator</td>
			<td style="width:164px;">Scientz</td>
			<td style="width:129px;">II-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protein purification system</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">Akta Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;">Nikon</td>
			<td style="width:129px;">SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IzIt crystal dye</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td>HR4-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrophoresis unit</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">1658005EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker Incubator</td>
			<td style="width:164px;">Zhicheng</td>
			<td style="width:129px;">ZWYR-D2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Index crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Structure crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProPlex crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PACT premier crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JCSG-plus crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella

Utvikling av potente og effektive insektmidler målretting insekt ryanodine reseptorer (RyRs) har vært av stor interesse innen landbruk skadedyrbekjempelse. Hittil har flere diamide insektmidler målretting pest RyRs har blitt kommersialisert, som genererer årlig omsetning på 2 milliarder amerikanske dollar. Men forståelse av modusen for handling av RyR målretting insektmidler er begrenset av mangel på strukturelle informasjon om insekt RyR. Dette begrenser igjen forståelse av utviklingen av insektmiddel motstand i skadedyr. Diamondback møll (DBM) er en ødeleggende pest ødelegge cruciferous avlinger over hele verden, som har også blitt rapportert å vise motstand mot diamide insektmidler. Derfor er det av stor praktisk betydning å utvikle romanen insektmidler målretting DBM RyR, spesielt rettet mot en region forskjellig fra det tradisjonelle diamide binding området. Her presenterer vi en protokoll strukturelt betegner N-terminal domenet RyR fra DBM. Krystallstruktur x-ray ble løst av molekylære erstatning oppløsning av 2.84 Å, som viser en beta-trefoil folding motiv og en flankemanøveren alpha helix. Denne protokollen kan tilpasses for uttrykket, rensing og strukturelle karakteristikk av andre domener eller proteiner generelt.

Rensing
N-terminal domenet DBM RyR ble uttrykt som en fusion protein med en hexahistidine kode, MBP koder og et TEV protease cleavage område. Vi fulgte en fem-trinns rensing strategi for å få en svært ren protein, egnet for krystallisering formålet. Først var fusion protein renset fra løselig brøkdel av celle lysate Ni-NTA kolonnen (HisTrap HP). Deretter fusion protein ble utsatt for TEV protease cleavage og hexahistidine-M...

Watch this Scientific Journal Video about Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella at JoVE.com

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

I denne artikkelen beskrive vi protokoller av protein uttrykk, rensing, krystallisering og struktur fastsettelse av N-terminal domenet ryanodine reseptoren fra diamondback møll (Plutella xylostella).

Crystal struktur av N-terminal domenet av Ryanodine reseptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Å løse strukturen til ryanodinreseptordomenet kan hjelpe med vår forståelse av proteinfunksjonens molekylære mekanisme, insektmiddelhandling og insektmiddelresistensutvikling. Dette tiltaket innebærer bruk av røntgenkrystallografi for strukturillustrasjon, som regnes som en gullstandard for proteinstrukturbestemmelse ved næratomoppløsning. Denne høyoppløselige strukturen til insektet ryanodine reseptordomenet avslører mekanismen for kanal gating og gir en viktig mal for utvikling av artsspesifikke insektmidler ved hjelp av strukturbaserte legemiddeldesigntilnærminger.Generelt vil personer som er nye på denne metoden slite, fordi potensielle proteinkrystallografer må være dyktige i biokjemi, biofysikk, informatikk og matematikk. Begynn med å forsterke DNA som tilsvarer proteinet av interesse ved polymerasekjedereaksjon. På slutten av reaksjonen, kjør hele 50 mikroliter av reaksjonsblanding på en 2% agarose gel, og trekk ut DNA med et gelekstraksjonssett i henhold til standardprotokoller.Deretter kan du linearisere LIC-vektor-DNA ved å blande 20 mikroliter av vektor-DNA med 6 mikroliter på 10X reaksjonsbuffer og 4 mikroliter SspI-begrensningsenzym i 30 mikroliter dobbeltdestillert vann. Inkuber denne reaksjonsblandingen i tre timer ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, kjør hele reaksjonsblandingen på en 1% agarose gel, etterfulgt av ekstraksjon av lineærisert vektor DNA med et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.Deretter utfører du separate T4 DNA polymerase behandlinger på 5 mikroliter av den lineariserte vektor DNA og PCR forsterket sette inn DNA, i henhold til standard protokoller. Inkuber i 40 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av 20 minutter med enzymvarmeinaktivering ved 75 grader Celsius. Utfør den ligation-uavhengige kloning glødereaksjonen ved å kombinere 2 mikroliter av T4 behandlet sett inn DNA med 2 mikroliter av T4 behandlet LIC vektor DNA for en 10 minutters inkubasjon ved romtemperatur.For å forvandle BL21(DE3)E. Coli-celler med rekombinantplasmid, tin 50 mikroliter kompetente celler på is, og tilsett ca. 1 mikroliter av den glødede plasmiden til røret. Knips forsiktig røret to til tre ganger for å blande cellene og DNA-et, og plasser røret tilbake på isen i 20 minutter.På slutten av inkubasjonen, varme-sjokk cellene på 42 grader Celsius i 40 sekunder, etterfulgt av to minutter tilbake på isen. Deretter legger du til en milliliter romtemperatur LB medium til røret, og plasserer cellene på en 250 RPM shaker i 45 minutter ved 37 grader Celsius. På slutten av risting inkubasjonen, plate 150 til 200 mikroliter av denne blandingen på valgplater, og invertere platene over natten på 37 grader Celsius.Neste dag, kultur en enkelt koloni i 100 milliliter av 2-YT medium, supplert med kanamycin, i en shaker inkubator ved 37 grader Celsius over natten. Neste morgen inokulerer du en liter 2-YT-medium, supplert med kanamycin, med 10 milliliter av overnattingskultur, og inkuber ved 37 grader Celsius med risting til OD600-avlesningen når ca. 0,6. Deretter induserer kulturen med IPTG til en endelig konsentrasjon på 0,4 millimolar, og vokser cellene i fem timer ved 30 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen høster cellene ved sentrifugering, og re-suspendere pellet til en 10 gram bakterier per 40 milliliter lysis buffer konsentrasjon. Forstyrre celleveggene ved sonikering ved en 65% amplitude, og ett sekund på ett sekund av, i åtte minutter. Fjern celleavfallet ved sentrifugering.Deretter filtrerer du det overnaturlige gjennom et 22 mikrometerfilter, og laster løsningen inn i en prøvesløyfe. For å rense fusjonsproteinet, injiser den filtrerte supernatanten fra prøveløkken i en fem milliliter nikkel-nitrolotriacetisk kolonne på et rensesystem med en lineær gradient på 20 til 250 millimolar imidazol. Cleave eluted target protein med tobakk etse virus protease, på en 1-til-50 ratio, over natten på 4 grader Celsius, og rense cleavage reaksjonblandingen på en amylose harpiks kolonne, og en nikkel-nitrolotriacetic kolonne, for å fjerne koden og tobakk ets virus protease.Dialyser gjennomstrømningen fra nikkel-nitrolotriacetic kolonnen mot dialysebuffer for å redusere saltkonsentrasjonen, og rense prøven på en anionutvekslingskolonne med en lineær gradient på 20 til 500 millimolar kaliumklorid i elutionbufferen. Deretter konsentrerer proteinet i en sentrifugalkonsentrator. Injiser det konsentrerte proteinet i en Superdex 200 26/600 gelfiltreringskolonne for å kontrollere homogeniteten, og vurder proteinets renhet med 15 % SDS-PAGE.For å forberede proteinet for krystallisering, konsentrat den rensede proteinprøven til 10 milligram per milliliter i sentrifugalkonsentratoren, og bufferutveksling til krystalliseringsbuffer før 80 grader Celsius lagring. For å utføre krystalliseringsscreening, bruk den sittende drop vapordiffusjonsmetoden på 295 Kelvin, med flere krystalliseringssett og et automatisert væskehåndteringssystem i et 96-brønnsformat. På slutten av dråpeinnstillingen forsegler du krystalliseringsplaten med 96 brønner for å forhindre fordampning, og for å muliggjøre likevekt av proteinfallet i reservoarbufferen.Legg platene i en krystallinkubator ved 18 grader Celsius. Kontroller platene regelmessig under et lett mikroskop for å overvåke krystalldannelsen og veksten. For å skille proteinkrys krystallene fra saltkrys krystallene, legg til en mikroliter proteinkrystallfarge til måldråpen, og observer krystallene under mikroskopet etter en time.Proteinkrys krystallene vil virke blå. For ytterligere å optimalisere krystallene, bruk de positive krystalliseringsforholdene og den hengende drop vapor diffusjonsmetoden i 24-brønnsplater, etterfulgt av inkubasjon i krystallinkubatoren ved 18 grader Celsius. For å bestemme proteinstrukturen, monter krystallene på en kryoloop under et lett mikroskop for blitskjøling i flytende nitrogen, og legg krystallene i en unibuck for lagring og transport.Pre-screen krystallene i en in-house X-ray diffractor, ved hjelp av den manuelle sentreringsfunksjonen for å montere og sentrere krystallene. Deretter bruker du programvaren for røntgendiffraksjon til å samle inn dataene. Hvis du vil indeksere, integrere og skalere datasettet ved hjelp av HKL-2000-pakken, velger du først detektoren og laster inn datasettet.Deretter utfører du toppsøkefunksjonen for å finne diffraksjonspunktene. Indekser stedene, velg riktig plassgruppe og utfør toppintegrering. Deretter skalerer du datasettet.Juster feilmodellen og skaler på nytt. Lagre utdatafilen. For å bestemme strukturen ved hjelp av Phenix software suite, opprett et nytt prosjekt.Først kjører Extriage med sca-filen for å beregne mulig kopinummer av proteinmolekyler i den asymmetriske enheten. Deretter, for å løse faseproblemet ved molekylær erstatning, kjør Phaser, ved hjelp av diffraksjonsdatafilen, malstrukturfilen med høysekvensidentitet og strukturell likhet som målproteinet, og proteinsekvensfilen, for å finne løsningen. Utfør automatisk bygging i Phenix for å generere den første modellen, ved hjelp av utdatafilen fra Phaser og sekvensfilen fra målproteinet.Bygg strukturen manuelt inn i den modifiserte eksperimentelle elektrontettheten ved hjelp av COOT, og finjuster ved hjelp av Phenix refine i iterative sykluser. Valider den endelige modellen ved hjelp av valideringsverktøyene i Phenix. I dette representative eksperimentet ga rensing av endeterminaldomenet til diamondback moth ryanodine reseptorprotein, som demonstrert, et enkelt bånd på ca 21 kilodaltonn ved STS-PAGE-analyse.Elution-volumet fra gelfiltreringskolonnen bekreftet at det rensede ryanodinreseptorens endeterminaldomene var en monomer. For krystallisering var de mest optimale forholdene der plateformede krystaller av høy kvalitet ble dannet i nærvær av 1 molar HEPES av en pH på 7 og 1,6 molar ammoniumsulfat. Bestemmelse av proteinstrukturen fra diffraksjonsdatasettet ved hjelp av programvare som demonstrerte avslørte diamondback moth ryanodine reseptor end-terminal domene som dekker rester 1 til 205.Proteiner med stor lidelse, fleksible regioner, eller med svake affiniteter er utfordrende å krystallisere. I disse scenariene, protein engineering strategier som overflaten entropi reduksjon, loop avkorting, og kryss-linking, kan øke sannsynligheten for å oppnå bedre protein krystaller. I tillegg til å avsløre høyoppløselige proteinstrukturer, kan røntgenkrystallografi også brukes til å studere protein-plantevernmidler interaksjoner, som kan hjelpe med strukturbasert plantevernmiddeldesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisering Alpakka (Lama Britis) med Protein antigener og produksjon av Antigen-spesifikke enkelt domene antistoffer

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...