Name: crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella at JoVE.com

Financiamento para esta pesquisa foi fornecida por: nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nacional natureza Science Foundation da China (31320103922, 31230061) e projeto de pesquisa básica nacional (973) programa de China (2015CB856500, 2015CB856504). Somos gratos ao pessoal sobre a trajetória de BL17U1 em instalações de radiação síncrotron de Shanghai (SSRF).

1. Gene clonagem e expressão de proteínas purificação
<ol><li>PCR amplificar DNA correspondente à proteína de interesse (resíduos 1-205 de DBM RyR, Genbank ACC. n. AFW97408) e clone em vetor de animal de estimação-28a-HMT por clonagem independente de ligadura (LIC)25. Este vetor contém uma marca de histidina, tag MBP e um local de clivagem de protease TEV no N-terminal15.
	<ol>
<li>Projeto LIC primers para amplificação do gene alvo com extens?...

<ol>
	<li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels.">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li><li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor/calcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li><li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. 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K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth,+Plutella+xylostella,+from+China.">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li><li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae).">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+(L.)+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole.">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li><li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth,+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae)+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor.">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li><li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer,+Tuta+absoluta+(Lepidoptera:+Gelechiidae).">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li><li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias.">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor.">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li><li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. 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J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamondback+moth+ecology+and+management:+problems,+progress,+and+prospects.">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li><li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors:+Insights+into+Disease+Mutations.">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography.">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li><li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HKL-3000:+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes.">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li><li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li><li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites.">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li><li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor.">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li></ol>

Neste artigo, descrevemos o procedimento para expressar recombinantes, purificar, cristalizar e determinar a estrutura de DBM RyR NTD. Para cristalização, um requisito crucial é a obtenção de proteínas com homogeneidade, pureza e alta solubilidade. Em nosso protocolo, escolhemos usar pET-28a-HMT vetor que contém uma marca de hexahistidine e MBP, ambos os quais poderiam ser utilizados para a purificação obter uma maior pureza de dobra. Além disso, as aids marca MBP na solubilidade da proteína alvo. Nós purific...

Ryanodine receptors (RyRs) são canais de íon específico, que mediam a permeação dos íons de Ca2 + através das membranas do retículo sarcoplasmático (RS) em células musculares. Portanto, eles jogam um papel importante na processo de acoplamento excitação contração. Na sua forma funcional, RyR monta como um homo-tetrâmero com uma massa molecular de > 2 MDa, com cada subunidade composto por resíduos de aminoácidos ~ 5000. Em mamíferos, existem três isoformas: RyR1 - tipo de músculo esquelético, RyR2 - tipo de músculo cardíaco e RyR3-ubiquitously expressa em tecidos diferentes1.
Em insetos, há apenas um tipo de RyR, que é expresso no tecido muscular e nervoso2. Inseto RyR é mais semelhante a mamíferos RyR2 com uma identidade de sequência de cerca de 47%3. Inseticidas de diamido segmentação RyR de Lepidoptera e Coleoptera foram desenvolvidas e comercializadas por grandes empresas como Bayer (flubendiamida), DuPont (chlorantraniliprole) e Syngenta (cyantraniliprole). Desde o seu lançamento relativamente recente, diamido inseticidas tornaram-se uma das classe mais rápido crescimento de inseticidas. Atualmente, as vendas destes três inseticidas anualmente cruzaram 2 bilhões dólares americanos com uma taxa de crescimento de mais de 50% desde 2009 (Agranova).
Estudos recentes têm relatado o desenvolvimento de resistência em insetos, depois de algumas gerações de uso destes inseticidas4,5,6,7,8. As resistência mutações no domínio transmembrana de RyRs do diamondback moth (DBM), Plutella plutella (G4946E, I4790M) e as posições correspondentes em Minador do tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) mostram que a região pode ser envolvido na ligação de inseticida de diamido como esta região é conhecida por ser crítico para retenção do canal4,8,9. Apesar de inúmeras pesquisas nesta área, os mecanismos moleculares exatos de diamido inseticidas permanecem indescritíveis. Além disso, não está claro se as mutações de resistência afetam as interações com diamides diretamente ou qual alostericamente.
Estudos anteriores relataram a estrutura de vários domínios RyR de espécies de mamíferos e a estrutura de completos mamíferos RyR1 e RyR2 por cristalografia de raios x e microscopia cryo-elétron, respectivamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Mas até agora, nenhuma estrutura de insecto RyR foi relatada, que nos proíbe de compreender os meandros moleculares da função do receptor, bem como os mecanismos moleculares de ação inseticida e desenvolvimento de resistência de inseticida.
Este manuscrito, apresentamos um protocolo de generalizadas para caracterização estrutural de domínio de β-trevo N-terminal do receptor de ryanodine do diamondback moth, uma praga destrutivo infectando crucíferos culturas no mundo22. A construção foi projetada de acordo com o coelho publicado RyR1 NTD cristal estruturas23,24e o cryo-EM modelos estruturais16,17,18,19, 20 , 21. esta é a primeira estrutura de alta resolução, relatada por inseto RyR, que revela o mecanismo de retenção de canal e fornece um modelo importante para o desenvolvimento de inseticidas espécie-específicos usando drogas baseada em estrutura de design. Para a elucidação da estrutura, utilizamos a cristalografia de raios x, que é considerada como o "padrão ouro" para a determinação da estrutura da proteína em perto de resolução atômica. Embora o processo de cristalização é imprevisível e trabalho intensivo, este protocolo passo a passo ajudará pesquisadores a express, purificar e caracterizar outros domínios de inseto RyR ou qualquer outras proteínas em geral.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pET-28a-HMT vector</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:941px;">This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli BL21 (DE3) strain</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td>69450-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrapHP column (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylose resin column</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:129px;">E8021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q Sepharose high-performance column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon concentrators (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex 200 26/600 gel-filtration column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automated liquid handling robotic system&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:129px;">Gryphon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>82050-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR4-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puck dewar loading tool</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nano drop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal incubator</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD5-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-Ray diffractor</td>
			<td style="width:164px;">Rigaku</td>
			<td style="width:129px;">FRX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR machine</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">Nexus GX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid mini-prep kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SspI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:164px;">NEB</td>
			<td style="width:129px;">R0132S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">2868713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:164px;">Scientific Chemical</td>
			<td align="right" style="width:129px;">25389940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">367931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">7365459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">60242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">Sorvall LYNX 6000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonnicator</td>
			<td style="width:164px;">Scientz</td>
			<td style="width:129px;">II-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protein purification system</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">Akta Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;">Nikon</td>
			<td style="width:129px;">SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IzIt crystal dye</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td>HR4-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrophoresis unit</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">1658005EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker Incubator</td>
			<td style="width:164px;">Zhicheng</td>
			<td style="width:129px;">ZWYR-D2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Index crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Structure crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProPlex crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PACT premier crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JCSG-plus crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella

Desenvolvimento de inseticidas potentes e eficientes como alvo receptores ryanodine inseto (RyRs) tem sido de grande interesse na área de controle de pragas agrícolas. Até à data, vários insecticidas de diamido visando pragas que ryrs ter sido comercializados, que geram receita anual de 2 bilhões de dólares. Mas a compreensão do modo de ação de inseticidas RyR-direcionamento é limitada pela falta de informações estruturais sobre inseto RyR. Isto por sua vez restringe a compreensão do desenvolvimento da resistência de inseticida em pragas. O diamondback moth (DBM) é uma praga devastadora destruindo crucíferas culturas em todo o mundo, que também tem sido relatada para mostrar resistência aos inseticidas de diamido. Portanto, é de grande importância prática para desenvolver novas inseticidas visando o RyR DBM, especialmente visando uma região diferente do local de ligação do diamido tradicional. Aqui, apresentamos um protocolo para caracterizar estruturalmente o domínio N-terminal do RyR da DBM. A estrutura de cristal de raio-x foi resolvida por substituição molecular em uma resolução de 2.84 Å, que mostra um motivo de dobramento de beta-trevo e uma acompanhamento alfa-hélice. Este protocolo pode ser adaptado para a expressão, purificação e caracterização estrutural de proteínas ou outros domínios em geral.

Purificação
O domínio N-terminal da DBM RyR foi expressa como uma proteína de fusão com uma marca de hexahistidine, uma marca MBP e um local de clivagem de protease TEV. Nós seguimos uma estratégia de purificação de cinco etapas para obter uma proteína altamente pura, adequada para efeito de cristalização. Em primeiro lugar, a proteína de fusão foi purificada da fracção solúvel de lisado celular por coluna Ni-NTA (...

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Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Neste artigo, descrevemos os protocolos de determinação de estrutura, purificação, cristalização e expressão da proteína do domínio N-terminal do receptor de ryanodine do diamondback moth (Plutella plutella).

Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Resolver a estrutura do domínio do receptor de ryanodo pode ajudar com a compreensão do mecanismo molecular da função proteica, ação de inseticidas e desenvolvimento de resistência a inseticidas. Esta medida implica o uso de cristalografia de raios-X para ilustração da estrutura, que é considerada um padrão-ouro para determinação da estrutura proteica em resolução quase atômica. Esta estrutura de alta resolução do domínio do receptor de ryanodo de insetos revela o mecanismo de gating de canal e fornece um modelo importante para o desenvolvimento de inseticidas específicos de espécies usando abordagens de design de drogas baseadas em estrutura.Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão, porque os cristalógrafos de proteínas em potencial devem ser proficientes em bioquímica, biofísica, ciência da computação e matemática. Comece amplificando o DNA correspondente à proteína de interesse pela reação em cadeia de polimerase. No final da reação, execute todos os 50 microliters de mistura de reação em um gel de 2% de agarose, e extraia o DNA com um kit de extração de gel de acordo com os protocolos padrão.Em seguida, linearize o DNA vetorial LIC misturando 20 microliters do DNA vetorial com 6 microliters de tampão de reação 10X e 4 microliters de enzima de restrição de SiI em 30 microliters de água dupla destilada. Incubar esta mistura de reação por três horas a 37 graus Celsius. No final da incubação, execute toda a mistura de reação em um gel de 1% de agarose, seguido pela extração do DNA vetorial linearizado com um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, realize tratamentos separados de polimerase de DNA T4 em 5 microliters do DNA vetorial linearizado e o DNA de inserção amplificada do PCR, de acordo com os protocolos padrão. Incubar por 40 minutos em temperatura ambiente, seguido de 20 minutos de inativação de calor enzimante a 75 graus Celsius. Realize a reação de ressarcação de clonagem independente da ligadura combinando 2 microlitadores do DNA de inserção t4 tratado com 2 microliters do DNA vetorial LIC tratado T4 para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.Para transformar as células BL21(DE3)E. Coli com o plasmídeo recombinante, descongelar 50 microliters de células competentes no gelo, e adicionar aproximadamente 1 microliter do plasmídeo realado ao tubo. Gire suavemente o tubo duas a três vezes para misturar as células e o DNA, e coloque o tubo de volta no gelo por 20 minutos.No final da incubação, o calor choca as células a 42 graus Celsius por 40 segundos, seguido de dois minutos de volta ao gelo. Em seguida, adicione um mililitro de temperatura ambiente lb médio ao tubo, e coloque as células em um agitador de 250 RPM por 45 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação de agitação, placa de 150 a 200 microliters desta mistura em placas de seleção, e inverta as placas durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, a cultura uma única colônia em 100 mililitros de meio 2-YT, suplementada com kanamicina, em uma incubadora shaker a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, inocular um litro de meio 2-YT, suplementado com kanamicina, com 10 mililitros de cultura durante a noite, e incubar a 37 graus Celsius com agitação até que a leitura de OD600 atinja aproximadamente 0,6. Em seguida, induzir a cultura com IPTG a uma concentração final de 0,4 milimililar, e cultivar as células por cinco horas a 30 graus Celsius.Ao final da incubação, colde as células por centrifugação e suspenda a pelota para 10 gramas de bactérias por 40 mililitros de concentração tampão de lise. Interrompa as paredes celulares por sônica em uma amplitude de 65%, e um segundo em um segundo de folga, por oito minutos. Remova os detritos celulares por centrifugação.Em seguida, filtre o supernatante através de um filtro de 22 micrômetros e carregue a solução em um loop de amostra. Para purificar a proteína de fusão, injete o supernanato filtrado do laço amostral em uma coluna de níquel-nitrolotriactic de cinco mililitros em um sistema de purificação com um gradiente linear de 20 a 250 milimidazol. Corte a proteína alvo elucida com protease do vírus da etch do tabaco, em uma proporção de 1 a 50, durante a noite a 4 graus Celsius, e purifique a mistura de reação de decote em uma coluna de resina amilose, e uma coluna de níquel-nitrolotriacético, para remover a etiqueta e o vírus da etch do tabaco protease.Diálise do fluxo da coluna níquel-nitrolotriactica contra o tampão de diálise para reduzir a concentração de sal e purifique a amostra em uma coluna de troca de ânion por um gradiente linear de 20 a 500 mililitros de potássio no tampão de eluição. Então, concentre a proteína em um concentrador centrífuga. Injete a proteína concentrada em uma coluna de filtragem de gel Superdex 200 26/600 para verificar a homogeneidade e avaliar a pureza da proteína em 15% de SDS-PAGE.Para preparar a proteína para cristalização, concentre a amostra de proteína purificada em 10 miligramas por mililitro no concentrador centrífugo e troque o tampão para o tampão de cristalização antes do armazenamento de 80 graus Celsius. Para realizar a triagem de cristalização, use o método de difusão de vapor de gota sentado em 295 Kelvin, com vários kits de cristalização, e um sistema automatizado de manuseio líquido em um formato de 96 poços. No final do ajuste de queda, sele a placa de cristalização de 96 poços para evitar a evaporação, e para permitir o equilíbrio da gota de proteína dentro do tampão do reservatório.Coloque as placas em uma incubadora de cristal a 18 graus Celsius. Verifique periodicamente as placas sob um microscópio leve para monitorar a formação e o crescimento do cristal. Para diferenciar os cristais proteicos dos cristais de sal, adicione um microliter de corante de cristal proteico à gota alvo, e observe os cristais sob o microscópio após uma hora.Os cristais de proteína parecerão azuis. Para otimizar ainda mais os cristais, use as condições positivas de cristalização e o método de difusão de vapor de gota suspensa em placas de 24 poços, seguido de incubação na incubadora de cristais a 18 graus Celsius. Para determinar a estrutura proteica, monte os cristais em um crioloop sob um microscópio leve para resfriamento de flash em nitrogênio líquido, e coloque os cristais em um unbuck para armazenamento e transporte.Pré-tela os cristais em um difrator de raios-X interno, usando a função de centralização manual para montar e centralizar os cristais. Em seguida, use o software de difração de raios-X para coletar os dados. Para indexar, integrar e dimensionar o conjunto de dados, usando o conjunto de dados HKL-2000, primeiro, selecione o detector e carregue o conjunto de dados.Em seguida, realize a função de busca de pico para encontrar os pontos de difração. Indexe as manchas, selecione o grupo espacial certo e realize a integração máxima. Em seguida, dimensione o conjunto de dados.Ajuste o modelo de erro e dimensione novamente. Salve o arquivo de sca de saída. Para determinar a estrutura usando o pacote de software Phenix, crie um novo projeto.Primeiro, execute Extriage com o arquivo de sca para calcular o possível número de cópia de moléculas de proteína na unidade assimétrica. Em seguida, para resolver o problema de fase por substituição molecular, execute Phaser, usando o arquivo de dados de difração, o arquivo de estrutura de modelo com identidade de alta sequência e similaridade estrutural como a proteína alvo, e o arquivo de sequência de proteínas, para encontrar a solução. Execute a construção automática em Phenix para gerar o modelo inicial, usando o arquivo de saída do Phaser e o arquivo de sequência da proteína alvo.Construa manualmente a estrutura na densidade experimental modificada de elétrons usando COOT, e refine usando refinar Phenix em ciclos iterativos. Validar o modelo final utilizando as ferramentas de validação em Phenix. Neste experimento representativo, a purificação do domínio terminal final da proteína receptor de mariposa diamondback, como demonstrado, rendeu uma única banda a cerca de 21 kilodaltons pela análise STS-PAGE.O volume de elução da coluna de filtragem de gel confirmou que o domínio do receptor de ryanodo purificado para ser um monômero. Para a cristalização, as condições mais ideais sob as quais cristais em forma de placa de alta qualidade foram formados foi na presença de 1 HEPES molar de um pH de 7, e 1,6 sulfato de amônio molar. Determinação da estrutura proteica a partir do conjunto de dados de difração utilizando softwares como demonstrado revelou o domínio final do receptor de mariposa diamondback ryanodine cobrindo resíduos de 1 a 205.Proteínas com grande desordem, regiões flexíveis ou com afinidades fracas são desafiadoras para cristalizar. Nesses cenários, estratégias de engenharia de proteínas, como redução da entropia superficial, truncação de loop e ligação cruzada, podem aumentar a probabilidade de obter melhores cristais proteicos. Além de revelar estruturas proteicas de alta resolução, a cristalografia de raios-X também pode ser usada para estudar interações proteína-pesticidas, o que poderia ajudar no projeto de pesticidas baseados em estrutura.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Bioquímica

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Imunização de alpaca (Lama pacos) com antígenos da proteína e a produção de anticorpos de domínio único antígeno-específicas

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Solução de estrutura da proteína fluorescente Cerulean usando MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...