Name: crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella at JoVE.com

Finansiering för denna forskning lämnades av: nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nationella natur Science Foundation of China (31320103922, 31230061) och projekt av nationell grundforskning (973) Program för Kina (2015CB856500, 2015CB856504). Vi är tacksamma till Personalen på beamline BL17U1 på Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).

1. gen kloning, proteinuttryck och rening
<ol><li>PCR förstärka DNA motsvarande protein av intresse (rester 1-205 av DBM RyR, Genbank acc. nr. AFW97408) och klon i pET-28a-HMT vektor av Ligation-oberoende kloning (LIC)25. Den här vektorn innehåller en histidin tagg, MBP-tagg och en TEV proteas klyvning webbplats vid N-terminalen15.
	<ol>
<li>Design LIC primers för förstärkning av målgenen med LIC-kompatibel 5' tillägg: Framåt LIC primer: 5...

<ol>
	<li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels.">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li><li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor/calcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li><li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+ryanodine+receptors:+molecular+targets+for+novel+pest+control+chemicals.">Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals.</a> Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).</li><li>Steinbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+spread,+genetics+and+functional+characteristics+of+ryanodine+receptor+based+target-site+resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth,+Plutella+xylostella.">Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).</li><li>Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth,+Plutella+xylostella,+from+China.">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li><li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae).">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+(L.)+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole.">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li><li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth,+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae)+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor.">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li><li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer,+Tuta+absoluta+(Lepidoptera:+Gelechiidae).">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li><li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias.">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor.">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li><li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+mutations+in+the+ryanodine+receptor+N-terminal+region+couple+to+a+mobile+intersubunit+interface.">Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface.</a> Nature Communications. 4, 1506 (2013).</li><li>Lau, K., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+wild+type+and+disease+mutant+forms+of+the+ryanodine+receptor+SPRY2+domain.">Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain.</a> Nature Communications. 5, 5397 (2014).</li><li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors:+insights+into+disease+mutations.">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>des Georges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Gating+and+Activation+of+RyR1.">Structural Basis for Gating and Activation of RyR1.</a> Cell. 167 (1), 145-157 (2016).</li><li>Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+conformational+switch+mechanism+of+the+ryanodine+receptor.">Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+gating+mechanism+of+the+type+2+ryanodine+receptor+RyR2.">Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.</a> Science. 354 (6310), (2016).</li><li>Wei, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+Ca2+-activated+long-range+allosteric+channel+gating+of+RyR1.">Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.</a> Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).</li><li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+rabbit+ryanodine+receptor+RyR1+at+near-atomic+resolution.">Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.</a> Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).</li><li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor.">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li><li>Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamondback+moth+ecology+and+management:+problems,+progress,+and+prospects.">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li><li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors:+Insights+into+Disease+Mutations.">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography.">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li><li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HKL-3000:+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes.">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li><li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xtriage+and+Fest:+Automatic+assessment+of+X-ray+data+and+substructure+structure+factor+estimation.">Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation.</a> CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).</li><li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling,+prediction+and+analysis.">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li><li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites.">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li><li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor.">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li></ol>

I detta papper beskriver vi förfarandet för att recombinantly express, rena, kristallisera och utreda strukturen av DBM RyR NTD. För kristallisering är ett viktigt krav att få proteiner med hög löslighet, renhet och homogenitet. I våra protokoll valde vi att använda pET-28a-HMT vektor eftersom det innehåller en hexahistidine-tagg och MBP tagg, som båda skulle kunna utnyttjas för rening att erhålla en högre fold renhet. Dessutom de MBP tag aids i målproteinet löslighet. Vi renat protein av fem på varandra...

Ryanodine receptorer (RyRs) är specifika jonkanaler, som medlar genomträngning av Ca2 + joner över de sarkoplasmatiska Retikulum (SR) membran i muskelcellerna. Därför, de spelar en viktig roll i excitation contractionen koppling processen. I sin funktionella form, RyR monterar som en homo-tetramer med en molekylvikt av > 2 MDa, med varje subenhet bestående av ~ 5000 aminosyra rester. Hos däggdjur finns det tre isoformer: RyR1 - skelettmuskulaturen typ, hjärtmuskulatur typ RyR2- och RyR3-ubiquitously uttryckt i olika vävnader1.
I insekter finns det endast en typ av RyR, som uttrycks i muskulös och nervös vävnad2. Insekt RyR är mer lik däggdjur RyR2 med en sekvens identitet av cirka 47%3. Diamide insekticider inriktning RyR av Lepidoptera och Coleoptera har utvecklats och marknadsförs av stora företag som Bayer (flubendiamid), DuPont (klorantraniliprol) och Syngenta (cyantraniliprole). Sedan lanseringen relativt nyligen har diamide insekticider blivit en av de snabbast växande klassen av insekticider. För närvarande har försäljningen av dessa tre insekticider årligen passerat 2 miljarder US-dollar med en tillväxttakt på mer än 50% sedan 2009 (Agranova).
Nyligen genomförda studier har rapporterat resistensutveckling hos insekter efter några generationer av användningen av dessa insektsmedel4,5,6,7,8. Resistensmutationer i domänen transmembrana av RyRs från diamondback mal (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) och motsvarande positioner i tomat leafminer, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) visar att regionen kan vara inblandade i diamide insektsmedel bindande eftersom denna region är känd för att vara kritiska för gating av channel4,8,9. Trots omfattande forskning på detta område fortfarande de exakta molekylära mekanismerna av diamide insekticider gäckande. Dessutom är det oklart huruvida resistensmutationer påverkar interaktionen med diamides direkt eller allosterically.
Tidigare studier har rapporterat strukturen för flera RyR domäner från däggdjursarter och struktur fullängds däggdjur RyR1 och RyR2 av röntgenkristallografi och cryo-elektronmikroskopi, respektive10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Men hittills har ingen struktur av insekt RyR har rapporterats, som förbjuder oss från att förstå funktionen receptor molekylär krångligheter samt insektsmedel molekylära verkningsmekanismer och insektsmedel resistensutveckling.
I detta manuskript presenterar vi en generaliserad protokoll för strukturella karakterisering av N-terminala β-klöver domänen för ryanodinreceptorn från diamondback mal, en destruktiv pest som infekterar korsblommiga grödor i världen22. Konstruktionen utformades enligt den publicera kanin RyR1 NTD crystal strukturer23,24och cryo-EM strukturella modeller16,17,18,19, 20 , 21. Detta är den första högupplösta strukturen som rapporterats för insekt RyR, som avslöjar mekanismen för kanal gating och ger en viktig mall för utvecklingen av artspecifika insekticider använder strukturbaserad design. För struktur klarläggande anställt vi röntgenkristallografi, som är ansedd som den 'gold standarden' för protein strukturbestämning på nära atomär upplösning. Även om kristallisation är oförutsägbar och arbetsintensivt, hjälper detta stegvisa protokoll forskare att uttrycka, rena och karakterisera andra domäner av insekt RyR eller några andra proteiner i allmänhet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pET-28a-HMT vector</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:941px;">This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli BL21 (DE3) strain</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td>69450-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrapHP column (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylose resin column</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:129px;">E8021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q Sepharose high-performance column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon concentrators (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex 200 26/600 gel-filtration column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automated liquid handling robotic system&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:129px;">Gryphon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>82050-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR4-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puck dewar loading tool</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nano drop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal incubator</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD5-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-Ray diffractor</td>
			<td style="width:164px;">Rigaku</td>
			<td style="width:129px;">FRX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR machine</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">Nexus GX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid mini-prep kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SspI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:164px;">NEB</td>
			<td style="width:129px;">R0132S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">2868713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:164px;">Scientific Chemical</td>
			<td align="right" style="width:129px;">25389940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">367931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">7365459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">60242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">Sorvall LYNX 6000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonnicator</td>
			<td style="width:164px;">Scientz</td>
			<td style="width:129px;">II-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protein purification system</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">Akta Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;">Nikon</td>
			<td style="width:129px;">SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IzIt crystal dye</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td>HR4-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrophoresis unit</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">1658005EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker Incubator</td>
			<td style="width:164px;">Zhicheng</td>
			<td style="width:129px;">ZWYR-D2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Index crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Structure crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProPlex crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PACT premier crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JCSG-plus crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella

Utvecklingen av potenta och effektiva insektsmedel inriktning insekt ryanodine receptorer (RyRs) har varit av stort intresse i området i jordbruket skadedjursbekämpning. Hittills har flera diamide insekticider inriktning pest RyRs har kommersialiserats, som genererar omsättning om 2 miljarder US-dollar. Men förståelsen av verkningsmekanismen av RyR-targeting insekticider begränsas av bristen på strukturell information angående insekt RyR. Detta begränsar i sin tur förståelsen av insektsmedel resistensutveckling i skadedjur. Diamondback mal (DBM) är ett förödande skadedjur som förstör korsblommiga grödor i världen, som har också rapporterats att Visa motstånd mot diamide insekticider. Därför är det av stor praktisk betydelse att utveckla nya insekticider inriktning den DBM RyR, särskilt inriktning en region som skiljer sig från traditionella diamide bindningsstället. Här presenterar vi ett protokoll för att strukturellt karakterisera den N-terminala domänen av RyR från DBM. X-ray kristallstrukturen löstes genom molekylär ersätter en upplösning av 2.84 Å, som visar ett beta-klöver fällbara motiv och en kompletterande alpha helix. Detta protokoll kan anpassas för uttryck, rening och strukturell karaktärisering av andra domäner eller proteiner i allmänhet.

Rening
Den N-terminala domänen av DBM RyR uttrycktes ett fusionsprotein med en hexahistidine-tagg, en MBP-tagg och en TEV proteas klyvning webbplats. Vi följde en fem-stegs rening strategi för att få ett mycket rent protein, lämpliga för kristallisering ändamål. Först var fusionsprotein renats från den lösliga fraktionen av cell lysate av Ni-NTA kolumn (HisTrap hk). Nästa, fusionsprotein utsattes för TEV proteas klyvni...

Watch this Scientific Journal Video about Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella at JoVE.com

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

I den här artikeln beskriver vi protokoll av protein uttryck, rening, kristallisering och struktur bestämning av N-terminala domänen för ryanodinreceptorn från diamondback moth (Plutella xylostella).

Kristallstrukturen av N-terminala domänen av ryanodinreceptorn från Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Att lösa strukturen hos ryanodine-receptordomänen kan hjälpa till med vår förståelse av den molekylära mekanismen hos proteinfunktionen, insekticid-verkan och insekticidresistensutveckling. Detta mäter antyder bruket av röntgenkristallografi för strukturerar illustration, som är ansedd en guldmyntfot för protein strukturerar beslutsamhet på near-atomic upplösning. Denna högupplösta struktur av insekten ryanodine receptor domän avslöjar mekanismen för kanal gating och ger en viktig mall för utveckling av artspecifika insekticider med hjälp av struktur-baserade metoder läkemedelsdesign.Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa, eftersom blivande protein kristallografer måste vara skickliga i biokemi, biofysik, datavetenskap och matematik. Börja med att förstärka DNA som motsvarar proteinet av intresse genom polymeras kedjereaktion. I slutet av reaktionen, kör hela 50 mikroliter av reaktion mix på en 2%agaros gel, och extrahera DNA med en gel extraktion kit enligt standardprotokoll.Därefter linjäriserar LIC-vektorns DNA genom att blanda 20 mikroliter av vektorndna med 6 mikroliter av 10X-reaktionsbuffert och 4 mikroliter av SspI-restriktionsenzym i 30 mikroliter av dubbeldestillerat vatten. Inkubera denna reaktionsblandning i tre timmar vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen, kör hela reaktionsmixen på en 1%agarosgel, följt av extraktion av det linjäriserade vektor-DNA med en gelextraktionssats enligt tillverkarens anvisningar.Därefter utför separata T4 DNA-polymeras behandlingar på 5 mikroliter av den linjäriserade vektornDNA och PCR förstärkt infoga DNA, enligt standardprotokoll. Inkubera i 40 minuter vid rumstemperatur, följt av 20 minuters enzymvärme inaktivering vid 75 grader Celsius. Utför den ligeringsoberoende kloningsglödgningsreaktionen genom att kombinera 2 mikroliter av det T4-behandlade instudet DNA med 2 mikroliter av det T4-behandlade LIC-vektor-DNA för en 10 minuters inkubation vid rumstemperatur.För att omvandla BL21(DE3)E. Coli celler med rekombinant plasmid, tina 50 mikroliter av kompetenta celler på is, och tillsätt cirka 1 mikroliter av den glödgade plasmid till röret. Snärta försiktigt röret två till tre gånger för att blanda cellerna och DNA, och placera röret tillbaka på is i 20 minuter.I slutet av inkubationen, värme-chock cellerna på 42 grader Celsius i 40 sekunder, följt av två minuter tillbaka på is. Lägg därefter till en milliliter av rumtemperatur LB-medium till röret, och placera cellerna på en 250 RPM shaker i 45 minuter vid 37 grader Celsius. I slutet av skakningen inkubation, platta 150 till 200 mikroliter av denna blandning på urval plattor, och invert plattorna över natten vid 37 grader Celsius.Nästa dag, kultur en enda koloni i 100 milliliter av 2-YT medium, kompletterad med kanamycin, i en shaker inkubator på 37 grader Celsius över natten. Nästa morgon, inokulera en liter 2-YT medium, kompletteras med kanamycin, med 10 milliliter av natten kultur, och inkubera vid 37 grader Celsius med skakning tills OD600 behandlingen når cirka 0,6. Sedan, inducera kulturen med IPTG till en slutlig koncentration av 0,4 millimolar, och odla cellerna i fem timmar vid 30 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen, skörda cellerna genom centrifugering, och åter upphäva pelleten till en 10 gram bakterier per 40 milliliter av lys buffertkoncentration. Störa cellväggarna genom ultraljudsbehandling vid en 65%amplitud, och en sekund på en sekund av, i åtta minuter. Ta bort cellskräpet genom centrifugeringen.Filtrera sedan supernatanten genom ett 22-mikrometerfilter och ladda lösningen i en provslinga. För att rena fusionsproteinet injicerar du den filtrerade supernatanten från provslingan i en fem milliliter nickel-nitrolotriatisk kolonn på ett reningssystem med en linjär gradient på 20 till 250 millimolar imidazol. Cleave eluted målprotein med tobak etch virus proteas, vid en 1-till-50 förhållande, över natten vid 4 grader Celsius, och rena klyvning reaktionsblandningen på en amylos harts kolumn, och en nickel-nitrolotriacetic kolumn, för att ta bort taggen och tobak etch virus proteas.Dialysa genomflödet från nickel-nitrolotriacetiska kolonnen mot dialysbuffert för att minska saltkoncentrationen, och rena provet på en anjonutbyteskonar med en linjär gradient på 20 till 500 millimolär kaliumklorid i elutionsbufferten. Koncentrera sedan proteinet i en centrifugalkoncentrator. Injicera det koncentrerade proteinet i en Superdex 200 26/600 gelfiltreringskolumn för att kontrollera homogeniteten, och bedöm proteinens renhet med 15%SDS-PAGE.För att förbereda proteinet för kristallisation, koncentrera det renade proteinprovet till 10 milligram per milliliter i centrifugalkoncentratorn, och buffertutbyte till kristalliseringsbuffert före 80 grader Celsius lagring. För att utföra kristallisering screening, använd den sittande metoden drop vapor diffusion på 295 Kelvin, med flera kristallisering kit, och en automatiserad vätskehantering system i en 96-brunn format. I slutet av droppinställningen förseglar du 96-brunnskristalliseringsplattan för att förhindra avdunstning, och för att möjliggöra jämvikten av proteindroppningen inom reservoarbufferten.Placera plattorna i en kristall inkubator på 18 grader Celsius. Kontrollera plattorna periodiskt under ett lätt mikroskop för att övervaka kristallbildningen och tillväxten. För att skilja proteinkristallerna från saltkristallerna, tillsätt en mikroliter proteinkristallfärg till målet droppe, och observera kristallerna under mikroskopet efter en timme.Proteinkristallerna kommer att verka blå. För att ytterligare optimera kristallerna, använd de positiva kristalliseringsförhållandena och metoden med hängande droppångdiffusion i 24-brunnsplattor, följt av inkubation i kristallinkubatorn vid 18 grader Celsius. För att bestämma proteinstrukturen monterar du kristallerna på en kryoslinga under ett ljusmikroskop för blixtkylning i flytande kväve, och placera kristallerna i en unibuck för lagring och transport.För-skärm kristallerna i en in-house röntgen diffractor, med hjälp av den manuella centrering funktion för att montera och centrera kristallerna. Sedan använder du programvaran för röntgendiffraktion för att samla in data. För att indexera, integrera och skala datamängden, med HKL-2000-svit, först, välj detektor och ladda datamängden.Sedan, utföra topp sökfunktionen för att hitta diffraktion fläckar. Indexera fläckarna, välj rätt utrymmesgrupp och utför toppintegration. Därefter skalar du datauppsättningen.Justera felmodellen och skalan igen. Spara utdata sca-filen. För att bestämma strukturen med hjälp av Phenix software suite, skapa ett nytt projekt.Kör först Extriage med sca-filen för att beräkna det möjliga kopieringsnumret av proteinmolekyler i den asymmetriska enheten. Nästa, för att lösa fas problemet genom molekylär ersättning, kör Phaser, med hjälp av diffraktion datafilen, mallen strukturfilen med hög sekvens identitet och strukturell likhet som målprotein, och proteinsekvensfilen, att hitta lösningen. Utför auto-build i Phenix för att generera den initiala modellen, med hjälp av utdatafilen från Phaser och sekvensfilen från målproteinet.Bygg strukturen manuellt in i den modifierade experimentella elektrontätheten med hjälp av COOT, och förfina med hjälp av Phenix förfina i iterativa cykler. Validera den slutliga modellen med hjälp av valideringsverktygen i Phenix. I detta representativa experiment, rening av slutet-terminal domänen av diamondback moth ryanodine receptor protein, som visat, gav ett enda band på cirka 21 kilodalton genom STS-PAGE analys.Elueringsvolymen från gel filtrering kolumnen bekräftade den renade ryanodine receptorn end-terminal domän att vara en monomer. För kristallisering, de mest optimala förhållanden under vilka högkvalitativa plattan-formade kristaller bildades var i närvaro av 1 molar HEPES av ett pH-värde på 7, och 1,6 molar ammoniumsulfat. Bestämning av proteinstrukturen från diffraktion datamängden utnyttja mjukvaror som visats avslöjade diamondback moth ryanodine receptor slutet-terminal domän som täcker rester 1 genom 205.Proteiner med stor oordning, flexibla regioner, eller med svag affiniteter är utmanande att kristallisera. I dessa scenarier, protein engineering strategier såsom ytan entropi minskning, loop trunkering, och tvärbindning, kan öka sannolikheten för att få bättre proteinkristaller. Förutom att avslöja högupplösta proteinstrukturer kan röntgenkristallografi också användas för att studera interaktioner mellan protein och bekämpningsmedel, vilket kan hjälpa till med strukturbaserad bekämpningsmedelsdesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metod för effektiv vika och rening av Chemoreceptor Ligand bindande domän

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisering av alpackor (Lama pacos) med proteinantigener och produktion av Antigen-specifika enda domän antikroppar

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur lösning av den fluorescerande Protein Cerulean använder MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...